POTENCIJALI PRIMJENE
AUTOHTONIH BAKTERIJA MLIJEČNE
KISELINE U INDUSTRIJI MLIJEKA
Prof. dr Zorica Radulović
Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu
Autohtona mikroflora – potencijal za
selekciju autohtonih kultura


Standardizacija
tradicionalnih
proizvoda
Autohtona mikroflora – ogroman biodiverzitet
različitih rodova, vrsta i sojeva
Autohtona mikroflora – ogroman potencijal različitih
metaboličkih funkcija
Poboljšanje arome
Novi funkcionalni
proizvodi
Starter kulture
Zaštita proizvoda
Dopunske kulture
Probiotske
Protektivne
Autohtoni sirevi

Karakterističan region
proizvodnje

Specifičnih geografskih
karakteristika
Specifičnih klimatskih
uslova
Industrijski nerazvijen
Ekološki zaštićen




Specifična mikroflora

specifičnog ukusa,
arome, punoće, što ga
čini prepoznatljivim i van
regiona
SIREVI U SRBIJI

Beli sirevi u salamuri

Sjenički sir

Homoljski sir

Svrljiški sir

Zlatarski sir

Polutvrdi pasta filata
sirevi

Kackavalj

Sirac
Karakteristike autohtone
proizvodnje sireva
• Proizvodnja u domaćinstvima na tradicionalan način
• Primena sirovog mleka (ovčije, kravlje, kozije ili mešano)
• Bez primene starter kulture, pa se proces proizvodnje i
zrenja odvija pod uticajem samo prirodne autohtone
mikroflore
• Odsustvo bilo kakve kontrole: - higijene
- tehnoloških parametara
(temperatura, pH, vreme koagulacije, uslovi zrenja i dr.)
• Neujednačen kvalitet sira i
često mikrobiloška neispravnost
PROIZVODNJA SIREVA
 Tradicionalan

metod
Proizvodnja u domaćinstvima
ili malim pogonima
Sveže mleko ili blag termički
tetman
 Bez starter kultura – autohtona
mikroflora


Nekontrolisani higijenski
uslovi proizvodnje
 Industrijski
metod

U pogonima srednjih ili
većih kapaciteta

Termički tretman mleka

Upotreba starter kultura –
kontrolisana mikroflora

Kontrolisani higijenski
uslovi proizvodnje
KARAKTERISTIKE SIREVA
Tradicionalni
Industrijski
Prednosti
 Izražene specifične
senzorne karakteristike
 Bogatstvo specifičnog
mirisa i ukusa
 Najčešće prepoznatljiv
kvalitet
 Ujednačen sastav i kvalitet
sireva
 Visoka mikrobiološka
bezbednost
Nedostaci
• Neujednačen
sastav i
kvalitet sireva
• Neujednačene senzorne
karakteristike
• Rizici po
ljudsko zdravlje
Odsustvo
bogatstva specifičnog
mirisa i ukusa
Standardizacija
tradicionalnih
proizvoda
Autohtone starter kulture
Značaj standardizacije tradicionalnih
sireva primenom autohtonih sojeva BMK
dobijanje sireva sa tipičnim senzornim
karakteristikama tradicionalnih sireva
dobijanje
bezbedni
sireva
koji
su
mikrobiološki
dobijanje sireva standardog ujednačenog
kvaliteta
bolja mogućnost plasmana
Mleko
Mleko
Termičkitretman
tretman
Termički
63°C/20min.
min.
63°C/20
Hlađenje37-33°C
37-33°C
Hlađenje
CaCl 200mg/l
Sirilo
Tehnološki
postupak
proizvodnje sireva
Inokulacija 1%
Koagulacija33°C/45min
33°C/45min
Koagulacija
Sečenjegruša
gruša
Sečenje
Mešanje
Mešanje
Prenosuucedila
cedilai iceđenje
ceđenje
Prenos
Predpresovanjei i
Predpresovanje
presovanje
presovanje
Sečenjeuukriške
kriške
Sečenje
12x12x6cm
12x12x6cm
Suvosoljenje
soljenje2,3%
2,3%NaCl
NaCl
Suvo
Zrenjeuusalamuri
salamuri7%
7%NaCl
NaCl
Zrenje
STARTER KULTURE ?
Autohtone starter kulture
Ključna uloga u biohemijskim procesima zrenja
Ključna uloga u formiranju specifičnog mirisa i ukusa
Autohtona mikroflora peduslov autohtonosti sira
Primena autohtonih kultura je jednostavan i brz načina za proveru
originalnosti sira, na osnovu DNA analiza sira
Razvoj starter kultura
Sposobnost acidifikacije
Starter kultura
Senzorna svojstva
Miris i ukus
Tekstura
Dopunske kulture
Protektivne kulture:
bakteriocinogene kulture
antifugi kulture
Mikrobiološka bezbednost
Nove funkcionalnosti
Zdravstveni efekat
Probiotske kulture
DOBIJANJE AUTOHTONIH STARTER
KULTURA

Ispitati dominantnu autohtonu mikrofloru BMK
tradicionalnih sireva

Izolovati čiste kulture
Ispitati njihove osnovne tehnološke i
biohemijske karakteristike u cilju njihove primene
kao starter kulture u standardizovanoj proizvodnji
sireva
Konstrukcija starter kulture
Primena u proizvodnji sireva
Praćenje biohemijskih, mikrobioloških i
senzornih promena tokom zrenja sireva




Radulović Z. 2010, Autohtone bakterije mlečne kiseline kao starter kulture, Monografija;
Radulović Z. et al., 2008, 5th IDF Symposium on Cheese Ripening, Bern
Izolacija
MRS za
laktobacile
43°C
M17 za
laktokoke
37 °C
43 ° C
LDC za cit+
laktokoke
30 °C
25 ° C
LDV za
leukonostok
25 ° C
Trostruko prečišćavanje
Čista kultura
Gram reakcija i mikroskopski pregled
Katalaza test
Utvrdjivanje tehnolških kriterijuma
Utvrdjivanje biohemijskih karakteristika
Kriterijumi selekcije autohtonih bakterija
mlečne kiseline
Tehnološki
rast na različitim % soli
rast na različitim temperaturama
rast na različitim pH vrednostima
termorezistentnost
Biohemijski
acidogena sposobnost
proteolitička aktivnost
produkcija aromogenih jedinjenja
produkcija EPS
Senzorni efekat
Vrsta
Sjenički sir
Broj
Procenat
(%)
Lactobacillus
plantarum
16
Lactobacillus
para.paracasei
Homoljski sir
Procenat
(%)
Broj
Procenat
(%)
21,62
8
25
13
17,58
7
21,87
Lactobacillus
pentosus
4
5,40
-
-
Lactobacillus
curvatus
4
5,40
1
3,12
Lactobacillus brevis
2
2,70
1
3,12
Lactococcus lactis
ssp. lactis
21
28,38
11
34,37
1
3,12
57,70
Lactococcus lactis
ssp. lactis biovar
diacetylactis
5
Lactococcus lactis
ssp. cremoris
2
2,70
1
3,12
Lactococcus
raffinolactis
2
2,70
-
-
Leuconostoc sp.
5
6,76
2
6,25
6,76
40,54
1,76
Procenat (%)
53,12
40,62
6,25
Kačkavalj
Izolati
Broj
izolata
Procenat
(%)
L. l. ssp.lactis
4
14.8
L. l. ssp.cremoris
2
7.4
Str. thermophilus
3
11.1
Enterococcus sp.
6
22.2
Lb. delbrueckii ssp.
delbruecki
3
11.1
Lb. para.paracasei
2
7.4
Lb. plantarum
3
11.1
Lb. fermentum
2
7.4
Lb. curvatus
2
7.4
Procenat
(%)
33,33
22,22
44,44
Isolates from
cheeses
Total
no.
tested
White brined cheese
% NaCl
pH
2
4
6.0
<4.8
<5.2
<6.0
Lactococcus
31
31
31
10
14
4
6
Enterococcus
7
7
7
7
7
0
0
Lactobacillus
25
25
25
8
3
6
8
Total
65
65
64
25
24
10
16
Uticaj izolata sa brzom acidogenom aktivnošću na
promene pH vrednosti mleka
pH 7
6.5
Lb. curvatus
6
Str. thermophilus
5.5
Str. thermophilus
Str. thermophilus
5
E. durans
4.5
4
2
4
6
8
24
Časovi (h)
Uticaj izolata sa umerenom acidogenom
aktivnošću na promene pH vrednosti mleka
7
6.5
E. faecium
6
pH
E. faecium
E. faecium
E. durans
5.5
E. durans
5
4.5
2
4
6
8
24
Časovi (h)
Sposobnost stvaranja aromogenih
jedinjenja diacetila i acetoina
L. lactis ssp.
lactis bv.
diacetylactis
Vreme stvaranja
diacetila (minut)
Stvaranje
acetoina
07
25
+
185
40
+
53
60
+
11
120
-
558
120
Pozitivna reakcija
Voges-Proskauera
Proteolitička aktivnost selekcionisanih sojeva
1- L. lactis ssp. lactis 363
1- L .lactis ssp. lactis 195
2- L. lactis ssp. lactis bv. diacetylactis 11
2- L. lactis ssp. lactis 653
3- Lb. para. paracasei 08
3- L. lactis ssp. lactis bv. diacetylactis 185
4- L. lactis ssp. lactis bv. diacetylactis 07
4- L. lactis ssp. cremoris 656
5- L. lactis ssp. lactis bv. diacetylactis 558
5- L. lactis ssp. lactis 032
6- L. lactis ssp. lactis 151
6- L. lactis ssp. lactis bv. diacetylactis 53
7- β-kazein
7- β-kazein
8- standard malih molekulskih masa
Proteolitičke
promene
tokom zrenja
sireva
1 - 10 dana
2 - 30 dana
3 - 60 dana
4 - 90 dana
5 - 120 dana
6 - Na-kazeinat
7 - β-kazein
8 - standard malih
molekulskih masa
A
B
Senzorna ocena oglednih sireva A i B
Sirevi
A
B
Dani
zrenja
Senzorna
ocena
Ispitivani pokazatelji
Opšti
izgled
Presek
10
5,00
4,56
30
4,90
60
Boja
Miris
Ukus
4,94
4,67
4,73
4,80
4,80
4,60
90
4,61
120
%max
kvalit.
Tekstura
X
4,61
4,78
4,69
93,78
4,60
4,53
4,70
4,61
92,13
4,77
4,50
4,45
4,57
4,57
91,45
4,83
4,94
4,32
4,21
4,56
4,44
88,74
4,83
4,57
4,90
4,30
4,10
4,23
4,36
87,26
10
5,00
4,50
5,00
4,63
3,83
4,28
4,32
86,44
30
4,73
4,63
4,80
4,13
4,07
4,77
4,40
88,08
60
4,80
4,83
4,84
4,40
4,48
4,73
4,50
89,52
90
5,00
5,00
4.87
4,43
4,52
4,56
4,52
90,34
120
5,00
5,00
5,00
4,50
4,54
4,83
4,55
91,03
Autohtone kulture
Poboljšanje arome
Prozvodnja niskomasnih sireva od UF mleka
Sir A - osnovna komercijalna starter kultura
sir B – osnovna kultura+ komercijalni probiotik L. acidophilus L10 i B. lactis B94;
sir C - osnovna kultura+ autohtoni soj L. para. paracasei 08;
sir D - osnovna kultura+ komercijalni probiotik + autohtoni soj L. para. paracasei 08
sir E - sa autohtonom starter kulturom, koja sadrži Lc. lactis ssp. cremoris 656, Lc.
lactis ssp. lactis 653 i L. para. paracasei 08.
Miočinović J., 2009, Razvoj tehnološkog postupka proizvodnje sireva od UF mleka sa
dijetetskim i funkcionalnim svojstvima, doktorska disertacija
Senzorna ocena niskomasnih sireva od UF mleka tokom zrenja
Dani zrenja
7
21
35
56
Spoljni
izgled
Izgled
preseka
Tekstura i
konzist.
Aroma
% Max.
kvaliteta
A
4,97±0,05a
4,92±0,14a
3,71±0,18a
3,50±0,10a
78,17±1,04a
B
4,94±0,05a
4,85±0,09a
3,69±0,19a
3,76±0,13b
80,37±1,48a
C
4,97±0,05a
4,85±0,09a
3,71±0,18a
3,84±0,05b
81,34±0,65a
D
4,91±0,10a
4,88±0,11a
4,14±0,24b
4,27±0,21c
87,78±3,08b
E
4,93±0,12a
4,88±0,11a
4,19±0,11b
4,44±0,10c
89,86±1,56b
A
4,97±0,05a
4,97±0,05a
3,78±0,17a
3,49±0,15a
78,62±2,53a
B
4,94±0,10a
4,97±0,05a
3,99±0,11ab
3,83±0,14b
83,14±1,65b
C
5,00±0,00a
5,00±0,00a
3,94±0,12ab
3,97±0,05b
84,45±0,12b
D
5,00±0,00a
5,00±0,00a
4,10±0,28b
3,89±0,03b
84,38±1,65b
E
5,00±0,00a
5,00±0,00a
4,56±0,10c
4,29±0,08c
90,72±0,66c
A
4,89±0,02a
4,92±0,14a
3,50±0,00a
3,46±0,07a
76,66±0,63a
B
4,92±0,07a
4,92±0,07a
3,99±0,30b
3,82±0,19b
82,71±2,95b
C
5,00±0,00a
5,00±0,00a
4,06±0,10b
3,69±0,17ab
82,22±2,09b
D
4,90±0,09a
4,86±0,13a
3,99±0,30b
3,77±0,15b
81,94±2,98b
E
5,00±0,07a
5,00±0,02a
4,56±0,19c
4,29±0,14c
90,72±2,36c
A
4,89±0,07a
4,92±0,13a
3,50±0,13a
3,46±0,19a
76,66±2,03a
B
4,96±0,07a
5,00±0,00a
3,67±0,31ab
3,42±0,52a
77,46±6,56ac
C
5,00±0,00a
5,00±0,00a
3,79±0,40b
3,67±0,29ab
80,62±4,89ac
D
4,96±0,07a
4,96±0,07a
3,87±0,13b
3,78±0,41ab
81,93±5,03bc
E
4,96±0,07a
4,96±0,07a
4,42±0,14c
4,33±0,38b
90,22±4,43b
Sir
Autohtoni probiotik
Zašto probiotik?
Pozitivni uticaj probiotskih kultura na zdravlje
Kao pozitivni uticaji, prikazani su slijedeći primeri:










diareja (odrasli i djeca)
upala creva (colitis), Kronova bolest
jačanje imuno sistema
snižavanje holesterola
problemi u probavnom traktu kao posledica lečenja sa antibioticima
zatvor
Helicobacter pylori (bakterija koja uzrokuje ulkus )
intolerancija na laktozu
Sprečavanje sinteze prekancerogenih jedinjenja
Bolje iskorišćenje vitamina
Zadatak probiotika
Preživljavanje u toku
tehnološkog postupka proizvodnje
Preživljavanje u toku
skladištenja proizvoda
Preživljavanje
u gastrointestinalnim uslovima
Probiotski kriterijumi
(in vitro)
•Sposobnost preživljavanja u simuliranim GI uslovima
• Inhibitorno dejstvo na patogene mikroorganizme
• Senzitivnost – rezistentnost na antibiotike
• Sposobnost kolonizacije na zidove intestinalnog trakta
Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem
(SHIME)
University in Ghent, Belgium
Preživljavanje u gastrointestinalnim (GI) uslovima

Gastro test
Slani rastvor pepsina čiji je pH 2, pH 3
 Test
žučnih soli
Podloga sa žučnim solima (0,4%) i pankreatina (0,2%)
Radulović, Z., i sar., (2008). Characterization of L. paracasei strains on
potencial probiotic ability. The 38th Croatian Dairy Experts Symposium.
Pepsin pH 3
Početni
Broj
Procenat
broj
(CFU/ml) preživelih preživelih
(CFU/ml)
(%)
Soj
Pankreatin + žučne soli
Broj
preživelih
(CFU/ml)
Procenat
preživelih
(%)
Lb. paracasei
564
4.1x108
4.1x108
100
4.05x108
98.78
Lb. paracasei
05
2.46x108
2.3x108
93.49
2.0x108
81.30
Lb. paracasei
02
7.8x108
4.48x108
57.43
2.56x108
32.82
Lb. rhamnosus
1.5x109
1.5x109
100
6.9x108
96.30
1-kontrola;
2-pepsin pH3;
3-pepsin pH2;
4-pankreatin i žučne soli
Antibiotska rezistentnost autohtonih sojeva BMK
Antibiotic
Lb.paracasei
Lb. ramnosus
08
564
05
02
GG
Cloramphenicol, 30 mcg
+
+
+
+
++
Penicillin G, 6 mcg
+
R
R
+
+
Tetracycline, 30 mcg
+
+
+
+
+
Streptomycin, 30 mcg
R
R
R
R
+
Ampicillin, 10 mcg
+
++
+
++
+
Kanamycin, 40 mcg
R
R
R
R
R
Antimikrobna aktivnost izolovanih sojeva (spot test)
Prečnik zone inhibicije* (mm)
Soj
Listeria
monocytogen.
Pseudomonas
aeruginosa
Bacillus
subtilis
Staph.
aureus
Candida
albicans
E. coli
Salmonellae
enteritidis
Lb.
paracasei 08
21
15
17
24
17
25
26
Lb.
paracasei
564
23
16
16
24
16
25
26
Lb.
paracasei 05
21
16
17
22
16
24
25
Lb.
paracasei 02
11
0
0
7
13
0
0
Lb.
rhamnosus
GG
23
NI
NI
25
12
26
27
*diameter of inhibition halo include 5 mm diameter of culture spot; NI – not investigated
Sposobnost autoagregacije - spektrofotometrijski
(Del Re et al., 2000)
% autoagregacije = 1 - (At / Ao)x 100
% auoaggregation
Ao – absorbanca izmerena nultog časa, t = 0
At – absorbanca merena pri vremenima t = 1, 2, 3, 4, 5h
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Lb. paracasei 564
Lb. paracasei 05
Lb. paracasei 02
Lb. rhamnosus
1
2
3
time (h)
4
5
Autohtone probiotske
kulture
Novi funkcionalni
proizvodi
Tri varijante kozjeg mekog sira:
1. kontrolni sir: starter kultura CHN 11 (Chr. Hansen);
2. starter + autochthoni potencijalni probiotik soj Lactobacillus plantarum 564
3. starter + komercijalni probiotik Lactobacillus acidophilus LA-5 (Chr. Hansen).
Vijabilnost potencijalnih
i komercijalnih probiotik
sojeva u sirevima
Senzorni
parametri*
Sirevi
Kontrol
sir 1
Sir 2
Sir 3
Spoljasnji i
unutrašnji izgled
Tekstura
Miris i ukus
%
Maximalnog
kvaliteta
Time
(days)
R*
W*
R*
W*
R*
W*
7
4.9
14.70
4.9
34.30
4.5
45.00
94.00
21
5.0
15.00
5.0
35.00
4.2
42.00
92.00
7
4.88
14.63
5.0
35.00
4.75
47.50
97.13
21
5.0
15.00
5.0
35.00
4.9
49.00
99.00
7
4.88
14.63
4.88
34.13
3.75
37.50
86.25
21
5.00
15.00
4.8
33.60
2.8
28.00
76.60
Senzorna
ocena
sireva
Novi proizvodi – nove mogućnosti






Probiotski fermentisani napici
Probiotska mleka
Probiotski sirevi
Probiotski maslac
Probiotski sladoled
Probiotski napici od surutke
Protektivne
kulture
Produkcija antimikrobnih jedinjenja
Bakteriocinska aktivnost
Prevencija kvarenja
i rasta patogenih
Poboljšanje arome
Ubrzanje zrenja
Sprečavanje pojave gorčine
Multifunkcionalnost autohtonih kultura


Autohtona mikroflora – ogroman biodiverzitet
različitih rodova, vrsta i sojeva
Autohtona mikroflora – ogroman potencijal različit
metaboličkih funkcija
Standardizacija
tradicionalnih
proizvoda
Poboljšanje arome
Novi funkcionalni
proizvodi
Starter kulture
Zaštita proizvoda
Dopunske kulture
Probiotske
Protektivne
Umesto zaključka
Danas
Slabo organizovana tradicionalna proizvodnja autohtonih sireva
Uniformna primena komercijalnih starter kultura
Primena probiotika ograničena uglavnom samo na jogurt
Budućnost
Primena autentičnih kultura u kontrolisanoj proizvodnji bi obezbedila dobijanje
visoko kvalitetnih bezbednih tradicionalnih sireva sa predispozicijom za
zaštitu oznake porekla
Industrija bi imala jedinstvene proizvode tipične za region proizvodnje
Primena autohtonih dopunskih kultura bi otvorila nove pravce u razvoju
dobijanja jedinstvenih novih proizvoda
World-wide Traditional Cheeses Association
1st WwTCa International Conference
January 28th- 29th, 2012 Ragusa, Italy
www. wwtca.org
www. wwtca.org
Home Members Contacts Organisation Travel Information Weather Location
Board of Directors
The Board of Directors is composed by:
Members
Active
Members
Founder
Active
Members
Honorary
Members
Supporting
Members
Be part of it!
Publications
Events
Contacts
Login
Italia - Licitra Giuseppe – President
France -Lortal Sylvie – vice-president
USA - Catherine Donnelly – vice-president
Italia - Carpino Stefania – Threasurer
Greece - Evanthia Tzanetaki
Mongolia - Tsetsgee Ser-od
Serbia - Zorica Radulovic
Scientific Secretariat:
Margherita Caccamo
The Association is composed by:
Founder Active Members
Honorary Members
Active Members
Supporting Members
WwTCa - S.P. 25 Ragusa Mare km 5 - 97100 Ragusa
HVALA NA PAŽNJI
Download

Potencijali primjene autohtonih BMK u mljekarskoj industriji