kratak pregled glavnih alergena kikirikija i mleka. Takođe, razmatrana je i anatomija digestivnog sistema
čoveka, kao i veza između digestibilnosti proteina i njihove alergenosti. Opisani su i oksidativni enzimi
tirozinaza i lakaza, kao i njihova primena u industriji hrane radi umrežavanja proteina i poboljšanja tehnofunkcionalnih osobina hrane.
Poglavlje Alergenost enzimski procesovanih alergena kikirikija i mleka u in vitro i ex vivo
testovima se sastoji iz dve celine. U prvoj se ispituje alergenost enzimski procesovanih proteina
kikirikija, a u drugoj alergenost umreženih kazeina in vitro i ex vivo metodama. Svaka celina je
organizovana u četiri odeljka: uvodnog dela specifičnog za problematiku, materijala i metoda, rezultata i
diskusije. U prvoj celini ispitana je veličina agregata dobijenih umrežavanjem proteina kikirikija
različitim elektroforetskim tehnikama i skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM). Takođe,
inhibitornim ELISA testovima ispitana je očuvanost glavnih alergena kikirikija Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3
i Ara h 6 u enzimski umreženom materijalu. Funkcionalnost dobijenog materijala u smislu očuvanja
sposobnosti da veže humana IgE antitela i da izazove aktivaciju bazofila kod pacijenata alergičnih na
kikiriki takođe je ispitana. U drugoj celini ispitan je uticaj umrežavanja kazeina tirozinazama iz gljivice
Trichoderma reesei i pečuraka Agaricus bisporus (Lange) Imbach, kao i lakazom fungalnog porekla
(Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát) na alergenost ovog proteina. Utvrđena je sposobnost aktivacije bazofila,
kao i inhibicija vezivanja humanih IgE antitela za kazein u prisustvu dobijenih modifikata u ImmunoCAP
testu.
Poglavlje Alergenost enzimski procesovanih proteina kikirikija u in vivo modelima se sastoji
iz dve celine: u prvoj se ispituje alergenost proteina kikirikija nakon umrežavanja dvema tirozinazama (iz
gljivice Trichoderma reesei i pečuraka Agaricus bisporus (Lange) Imbach), a u drugoj se ispituje
alergenost proteina kikirikija nakon umrežavanja lakazom (iz gljive Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát).
Obe celine su organizovane u četiri odeljka: uvod specifičan za problematiku, materijal i metode, rezultati
i diskusija. U prvoj celini su ispitivane sposobnosti proteina kikirikija umreženih tirozinazama da izazovu
alergijsku senzitizaciju i indukuju oralnu toleranciju u mišjem modelu alergije na kikiriki, kao i
transepitelni transport i biodostupnost glavnih alergena kikirija u Caco-2 ćelijskoj liniji. U drugoj celini
ispitana je sposobnost proteina umreženih lakazom da izazovu alergijsku senzitizaciju i indukuju oralnu
toleranciju u mišjem modelu alergije na kikiriki. Takođe je ispitana i mogućnost primene proteina
kikirikija umreženh lakazom u imunoterapiji alergije na kikiriki u mišjem modelu. Rezultati su
diskutovani u odnosu na širi kontekst relevantnih podataka iz literature.
Poglavlje Uticaj proteolitičkog procesovanja Ara h 2 proteina na njegovu alergenost se
sastoji iz četiri celine: uvodnog dela specifičnog za dato poglavlje, materijala i metoda, rezultata i
diskusije. U ovom poglavlju prečišćen je glavni alergen kikirikija Ara h 2 u uslovima koji inhibiraju i ne
inhibiraju dejstvo proteaza. Prečišćavanje je praćeno SDS-PAG elektroforezom i čist protein je analiziran
ESI-MS spektrometrijom. Struktura dobijenih proteina modelovana je na osnovu homologije sa Ara h 6
proteinom višestrukom metodom mapiranja (Multiple Mapping Method) i dobijene strukture su
pregledane i upoređene u programu Swiss-Pdb Viewer 4.01. Vezivanje humanih IgE antitela iz seruma
pacijenata alergičnih na kikiriki provereno je u 2D imunoblotu. Rezultati su obrazloženi u diskusiji i
upoređeni sa podacima iz literature.
Poglavlje Uticaj proteolize u digestivnom traktu na alergenost proteina mleka se sastoji iz
četiri celine: uvodnog dela specifičnog za dato poglavlje, materijala i metoda, rezultata i diskusije. U
ovom delu ispitan je uticaj pH vrednosti na pepsinsku digestiju α-laktalbumina i β-laktoglobulina u in
vitro uslovima. Nakon digestije, β-laktoglobulin analiziran je ESI-masenom spektrometrijom. Ispitani su i
pH vrednost i aktivnost pepsina u želucima pacova hranjenih svežim mlekom i dobijeni uslovi su
korišćeni za oponašanje digestije in vivo. Imunoblotom je ispitana sudbina α-laktalbumina i βlaktoglobulina tokom digestije u želucima pacova i digestije koja oponaša uslove in vivo digestije. Peptidi
izvedeni iz proteina mleka nakon digestije u želucu analizirani su tandem masenom spektrometrijom i
sposobnost da vežu IgE je proverena u ImmunoCAP testu. Rezultati su upoređeni i prodiskutovani u
skladu sa literaturnim navodima.
U okviru odeljka Zaključci ukratko su sumirani svi dobijeni rezultati i iznet je njihov značaj.
Literatura sadrži 190 literaturnih navoda prema abecednom redosledu prezimena autora.
B. Kratak opis postignutih rezultata
Enzimski tretman proteina kikirikija dvema različim tirozinazama proizvodi kovaletno agregirane
i umrežene proteine velike molekulske mase. Ovaj tretman očuvava imunološke karakteristike alergena
kikirikija, tj. usled agregacije alergena kikirikija tirozinazama ne dolazi do smanjenja vezivanja za
specifična IgE antitela i promene u aktivaciji bazofila. Umrežavanje kazeina lakazom u prisustvu
kafeinske kiseline i tirozinazom iz Agaricus bisporus (Lange) Imbach smanjuje aktivaciju bazofila.
Tretman kazeina oksidativnim enzimima smanjio je mogućnost inhibicije vezivanja humanih IgE antitela
za kazein u ImmunoCAP analizi.
Ukupni transepitelni transport proteina kikirikija je povećan jedino u slučaju umrežavanja
kikirikija tirozinazom iz Agaricu bisporus (Lange) Imbach. Biodostupnost Ara h 2, ali ne i Ara h 6
alergena povećana je u transportnim studijama na Caco-2 ćelijskoj liniji. Umrežavanje proteina kikirikija
tirozinazama ne pojačava alergijsku senzitizaciju in vivo, niti narušava kapacitet proteina kikirikija da
indukuju toleranciju kod miševa. Imunoterapija eksperimentalnih životinja proteinima kikirikija
umreženih lakazom dovodi do smanjenja mMCP-1, bez povećanja nivoa IgE antitela. Takođe,
modifikacija proteina kikirikija na ovaj način dovodi do smanjenja kapaciteta za senzitizaciju i,
istovremeno, bolje indukuje toleranciju nego nemodifikovani proteini kikirikija.
Procesovanje C-terminusa Ara h 2 proteina kikirikija proteazom prisutnom u kikirikiju dovodi do
formiranja dva izoalergena molekulske mase 16.34 i 17.71 kDa, redom, koje su prisutne u kikirikiju
zajedno sa prethodno prijavljenim izoformama Ara h 2, Ara h 2.01 i Ara h 2.02, molekulskih masa 16.66
kDa i 18.03 kDa. Ovo procesovanje ne dovodi do značajnih izmena u trodimenzionalnoj strukturi ovog
proteina, niti narušavanja organizacije IgE-vezujućih epitopa. Identifikovane proteolitički obrađene forme
vezuju IgE antitela iz seruma pacijenata alergičnih na kikiriki u imunoblotu.
U ovoj tezi utvrđeno je pod kojim uslovima se odvija digestija proteina mleka pepsinom u želucu
pacova. Pokazano je i da se digestija proteina mleka koja se odvija u fiziološki relevantim uslovima
razlikuje od in vitro preporučenih testova, ne samo zbog drugačije pH vrednosti, nego, prvenstveno, i
zbog kompleksnog matriksa u kom se proteini nalaze. Prisustvo velike količine proteina i lipida usporava
digestiju u želucu, i α-laktalbumin i β-laktoglobulin bivaju prisutni kao intaktni proteini/veći fragmenti,
dok je kazein prisutan uglavnom kao smeša peptida. U preporučenim in vitro testovima koji su rađeni na
različitim pH vrednostima α-laktalbumin biva hidrolizovan pepsinom već u toku prvog minuta. Najveći
broj peptida identifikovanih u želudačnom sadržaju odgovara IgE-vezujućim epitopima kazeina koji se
mogu vezati za IgE antitela iz seruma pacijenata alergičnih na mleko. Ovo vezivanje potvrđeno je
merenjem vezivanja IgE antitela za ukupne proteine mleka, kazein, α-laktalbumin i β-laktoglobulin, u
prisustvu peptida dobijenih digestijom sirovog mleka u uslovima koji oponašaju in vivo uslove.
C. Uporedna analiza rezultata kandidata sa rezultatima iz literature
Veliki broj studija je do sada izučavao vezivanje IgE antitela za alergene modifikovane kako
enzimski, tako i hemijski. Kako su rezultati ovih studija neretko bili i kontradiktorni, bilo je neophodno
da se ispita uticaj umrežavanja enzimima na proteine kikirikija i na kazein. Tirozinaze i lakaza do sad nisu
korišćene za umrežavanje ovih proteina, te stoga i efekat koji ovi enzimi mogu da prouzrokuju na
vezivanje IgE antitela i aktivaciju bazofila nije bio poznat. U ovom slučaju, pokazano je da, iako su
alergeni modifikovani, i u nekim slučajevima dolazi do promene IgE vezivanja, funkcionalnost u smislu
aktivacije bazofila ne biva narušena usled modifikacija proteina kikirikija i kazeina oksidativnim
enzimima.
Iako se rezultati in vitro studija uzimaju sa rezervom kada je u pitanju alergenost modifikovanih
proteina, do sada je objavljena samo jedna studija koja ispituje alergenost enzimski obrađenih proteina u
in vivo modelu na životinjama. Takođe, do sada nije bilo studija koje su ispitivale biodostupnost proteina
kikirikija nakon umrežavanja, niti uticaj umrežavanja na biodostupnost pojedinih alergena kikirikija. U
ovoj tezi je po prvi put ispitana mogućnost korišćenja umreženih proteina za imunoterapiju alergije na
kikiriki. Rezultati o uticaju umrežavanja proteina kikirikija na alergene osobine proteina kikirikija su od
velikog značaja za prehrambenu i farmaceutsku industriju.
S obzirom na porast alergijskih oboljenja u svetskoj populaciji, identifikacija alergena i njihovih
izoformi koje su prisutne u izvoru od velikog je značaja za utvrđivanje alergenosti proteina i ispravnu
dijagnostiku alergija. Identifikacija novih izoformi glavnih alergena, kao i objašnjenje njihovog nastanka,
veoma su bitni za razumevanje alergenosti proteina kikirikija. S obzirom da su izoforme analizirane u
ovoj doktorskoj tezi posledica proteolize dipeptida sa C-terminusa koja ne dovodi do značajne promene u
molekulskoj masi proteina, nameće se zaključak da je u karakterizaciji alergena neophodno koristiti
savremene i sofisticirane metode koje mogu da uoče suptilne promene na proteinskom nivou. Ovakav
detaljan pristup izučavanju alergena, koji uključuje 2D elektroforezu, masenu spektrometriju i
molekulsko modelovanje, može da doprinese otkrivanju novih, procesovanih formi alergena koje imaju
smanjenu reaktivnost i mogu da budu označene kao hipoalergene varijante poznatih alergena.
Do sada nije bilo studija koje su ispitivale digestiju mleka u želucima pacova. Nekoliko studija se
do sada su bavilo identifikacijom peptida koji preživljavaju digestiju pepsinom u in vitro i in vivo, ali
korišćenjem prasića kao eksperimentalnih životinja ili mlečnih formulacija za prehranu odojčadi. Takođe,
očigledan šablon peptida koji preživljavaju digestiju, tj. podudaranje sa IgE vezujućim epitopima, nije bio
uočen do sada. Vezivanje peptida nakon digestije za IgE antitela pacijenata alergičnih na mleko nije sa
uspehom pokazano ni u jednoj do sada objavljenoj studiji. Rezultati koji su u okviru ove teze pokazuju po
prvi put ishod digestije proteina mleka pepsinom u fiziološki relevantnim uslovima, uključujući pH i
aktivnost pepsina, kao i količinu proteina i lipida prisutnih tokom digestije.
D. Objavljeni i saopšteni radovi koji čine deo teze
Radovi u vrhunskim međunarodnim časopisima (M21):
1. Stanic, D., Monogioudi, E., Dilek, E., Radosavljevic, J., Atanaskovic-Markovic, M., Vuckovic,
O., Lantto, R., Mattinen, M., Buchert, J., Cirkovic Velickovic, T. (2009) Digestibility and
allergenicity assessment of enzymatically crosslinked β-casein. Molecular Nutrition Food and
Research, 54, 1273-1284, IF=4.356
2. Radosavljevic, J., Dobrijevic, D., Jadranin, M., Blanusa, M., Vukmirica, J., Cirkovic Velickovic,
T. (2010) Insights into proteolytical processing of the major peanut protein Ara h 2 by
endogenous peanut protease, Journal of the Science of Food and Agriculture, 90 (10), 1702-1708,
IF=1.360
3. Radosavljevic, J., Nordlund, E., Mihajlovic, L., Krstic, M., Bohn, T., Buchert, J., Cirkovic
Velickovic, T., Smit, J. Sensitizing potential of enzymatically cross-linked peanut proteins in a
mouse model of peanut allergy. Molecular Nutrition Food and Research, DOI:
10.1002/mnfr.201300403, IF=4.310
Radovi u pripremi:
1. Radosavljevic, J., Nordlund, E., Mihajlovic, L., Smit, J., Buchert, J., Cirkovic Velickovic, T.
Allergenicity of laccasse cross-linked peanut proteins.
2. Radosavljevic, J., Kataranovski, D., van Haage, M., Cirkovic Velickovic, T. In vivo digestion of
milk preserves IgE binding of main milk allergens.
Saopštenja na skupovima međunarodnog značaja štampani u izvodu:
1. Radosavljevic, J., Dobrijevic, D., Jadranin, M., Atanaskovic-Markovic, M., Cirkovic Velickovic,
T. Novel isoforms of Ara h 2 can bind human IgE. XXVIII Congress of the European Academy
of Allergology and Clinical Immunology, Warszawa, June 6-10, 2009, Abstract book, Abstract
No. 680
2. Radosavljevic, J., Mihajlovic, L., Willemsen, K., Selinheimo, E., Buchert, J., Pieters, R., Smith,
J., Cirkovic Velickovic, Allergenic potential of cross-linked peanut proteins. XXIX Congress of
the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, London, June 5-9, 2010,
Abstract book, Abstract No. 1070
3. Radosavljevic, J., Stojadinovic, M., Burazer, L., Kataranovski, D., Cirkovic Velickovic, T.
Acidity, Pepsin Activity and Proteolysis of Milk Proteins in Rat's Gastric Compartment. 1st
International Conference on Food Digestion, Cesena, Italy, 2012.
4. Radosavljevic, J., Krstic, M., Apostolovic, D., Bohn, T., Cirkovic Velickovic, T. Bioavailability
of enzymatically cross-linked peanut proteins in Caco-2 cell monolayer. Belgrade Food
International Conference, Belgrade, 2012.
5. Radosavljevic, J., Kataranovski, D., Burazer, L., Cirkovic Velickovic, T. Digestion of Milk
Proteins in Rat’s Gastric Compartment. Belgrade Food International Conference, Belgrade, 2012.
Sаopštenjа nа nаcionаlnim skupovimа štаmpаnа u celosti (M63):
1. Rаdosаvljević, J., Stаnić, D., Polović, N., Jаdrаnin, M., Jаnkov, R., Ćirković Veličković, T.
„Uticаj pH vrednosti nа digestibilnost β-lаktoglobulinа u uslovimа simulirаnog želudаčnog sokа“
47. Sаvetovаnje Srpskog hemijskog društvа, Beogrаd 21. mаrt 2009, BH09, str. 94
2. Rаdosаvljević, J., Dobrijević, D., Jаdrаnin, M., Jаnkov, R., Ćirković Veličković, T. „Izolovаnje i
molekulаrnа kаrаkterizаcijа glаvnih аlergenа kikirikijа“ 5. Simpozijum Hemijа i zаštitа životne
sredine, Tаrа 27-30 mаj, 2008, str. 164-165
Genska sekvenca (M85):
1. Arachis hypogaea clone 1.6 Ara h 6 allergen gene, complete cds, GenBank: FJ713111.1
2. Arachis hypogaea clone 4.2 Ara h 2.01 allergen gene, complete cds, GenBank: FJ713110.1
E. Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa disertacije)
Komisija je pregledala doktorsku disertaciju kandidata Jelene Radosavljević pod naslovom:
„Alergenost enzimski procesovanih nutritivnih alergena“ i zaključila da je disertacija proizvod
samostalnog rada kandidata i da dobijeni rezultati predstavljaju kvalitetan doprinos u oblasti biohemije. Iz
dobijenih rezultata su publikovana tri rada u vrhunskim međunarodnim časopisima, a još dva rada su u
pripremi. Takođe, iz dobijenih rezultata je proisteklo sedam saopštenja na skupovima međunarodnog i
nacionalnog zanačaja i prijavljene su dve genske sekvence u GenBank bazi podataka.
U ovoj disertaciji prvi put je ispitan uticaj enzimske obrade proteina hrane na alergeni potencijal.
Ispitane su posledice umrežavanja proteina oksidativnim enzimima na in vitro i ex vivo alergenost
proteina kikirikija i mleka. In vivo alergenost proteina kikirikija umreženih oksidativnim enzimima
procenjena je i u mišjem modelu alergije na kikiriki, kao i imunoterapijski potencijal materijala dobijenog
umrežavanjem lakazom. Proteolitičko procesovanje alergena Ara h 2 koje je primećeno u kikirikiju je
okarakterisano i ispitane su posledice na strukturu proteina i alergenost. Uslovi u želucu pacova tokom
digestije svežeg mleka pepsinom su ispitani, u smislu određivanja pH vrednosti i aktivnosti pepsina, i
oponašani su in vitro. Alergenost proteina mleka nakon želudačne digestije je ispitana merenjem
vezivanja IgE antitela iz seruma osoba alergičnih na mleko. Rezultati ove teze, osim fundamentalnog
značaja, mogu imati direktnu primenu u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji, kao i u medicini za bolje
razumevanje i dijagnostikovanje uzročnika alergija na hranu.
Download

Izveštaj komisije