1
Délka buněčného cyklu u savčích buněk trvá 10-30 hodin, přičemž některé buňky
zůstávají dočasně nebo permanentně v tzv. G0 fázi, do které vstupují z G1.
Obrázek podle Sumner 2003
2
3
Jedno- i mnohobuněčné organizmy musejí množení buněk pečlivě regulovat. U
jednobuněčných organismů se buňky množí, mají-li k tomu vhodné podmínky
(dostatek živin). U mnohobuněčných organismů je situace složitější. Dělení
buněk je žádoucí je někdy a u některých buněk, navíc je potřeba zajistit, aby se
množily jen buňky, které mají v pořádku DNA. To vše je řízeno kontrolními
mechanismy buněčného cyklu. Za jejich objev byla v roce 2001 L. Hartwellovi, P
Nursemu a T. Huntovi udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu.
Původní se myslelo, že řízení buněčného cyklu funguje jako hodiny a každá
fáze má vymezený určitý čas, za který musí stihnout svoje úkoly. Dnes víme, že
přesnější je představa padajícího domina, kdy konec jedné fáze spouští začátek
další fáze.
Leland Hartwell studoval princip řízení buněčného cyklu na kvasinkách Saccharomyces
cerevisiae na počátku 70. let 20. století. Izoloval buňky, které se zastavily v určité fázi
buněčného vývoje a z nich izoloval více než 100 genů řídících buněčný cyklus
(pojmenovány cdc geny = cell division cycle genes). Gen cdc8 byl pojmenován start,
protože byl zodpovědný za počátek buněčného cyklu. Hartwell si povšimul, že mutované
kvasinky, které mají poškozenou DNA, se v buněčném cyklu zastaví, a zavedl pojem
„kontrolní bod“).
Paul Nurse studoval v polovině 70. let buněčný cyklus u kvasinek
Schizosaccharomyces pombe (oddělila se od S.cerevisiae před 1 miliardou let) a objevil
gen cdc2, který řídil přechod z G2 do M fáze. Později přišel na to, že tento gen je totožný
s genem „start“ u S. cerevisiae, který objevil Hartwell, a že tedy tento gen řídí přechody
do několika fází buněčného cyklu. Podobný gen byl pak objeven i u člověka a
pojmenován CDK1 (cyklin dependentní kináza 1).
Tim Hunt – objevil počátkem 80. let 20. století cykliny u ježovky na základě jejich
periodické přítomnosti/absence během buněčného cyklu. Ukázal, že jsou periodicky
degradované při každém buněčném cyklu, což je pro regulaci buněčného cyklu klíčové.
Mechanismus regulace buněčného cyklu založený na cyklin dependentních kinázách
a cyklinech je splečný pro všechna eukaryota, je tedy starý cca dvě miliardy let.
Info a obrázky z
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/press.html
Všechna eukaryota mají několik cyklinů, které se váží na cyklin dependentní kinázy
(CDK). Pokud je více CDKs, každá tvoří vazbu se specifickým cyklinem. Cykliny se dělí
do skupin podle toho, kterou část buněčného cyklu spouštějí (cykliny G1 fáze, cykliny
G1/S fáze, cykliny S fáze, cykliny M fáze), např. cykliny M fáze řídí vstup buňky do
mitózy, cykliny G1 fáze řídí průchod buňkou G1 fází, atd.
CDKs jsou přítomny v buňce během celého buněčného cyklu v přibližně stejné
koncentraci, zatímco koncentrace cyklinů se mění v závislosti a fázi buněčného cyklu,
vrcholí v době, kdy posouvají buněčný cyklus dále a pak jsou odbourány. Jakmile
koncentrace cyklinu klesne, příslušná CDK přestane být aktivní.
Každý komplex CDK a cyklinu fosforyluje specifickou skupinu substrátu a tak je
schopen spustit řadu dějů, které jsou v dané fázi potřeba. Např. v M-fázi komplex cyklinu
M-fáze a CDK aktivuje kondensiny, které jsou potřeba pro kondenzaci chromatinu,
ovlivňuje složení dělícího vřeténka tím, že fosforyluje proteiny řídící chování mikrotubulů,
atd.
Komplexy CDK/cyklin jsou pozitivními regulátory buněčného cyklu, protože jejich
aktivita posouvá buňku do další fáze buněčného cyklu. Pokud tyto geny přestanou
správně reagovat na vnější stimuly a začnou být aktivní v nesprávnou chvíli, umožní i
nepřipravené nebo poškozené buňce se dál dělit, což může vést až k rakovinnému
bujení. Proto se též nazývají onkogeny.
Obrázky a info z:
https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/cellreproduction-10/control-of-the-cell-cycle-89/regulator-molecules-of-the-cell-cycle-39911626/images/fig-ch10_03_02/
http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n6/box/nrn2097_BX2.html
Kromě CDKs a cyklinů řídí buněčný cyklu i negativní regulátory, které ho zastaví,
pokud je DNA poškozená nebo není zcela replikovaná. Negativní regulátory
buněčného cyklu jsou též zvané tumor supresorové geny nebo antionkogeny,
protože předcházejí množení buněk, které nejsou v pořádku a tím zabraňují
vzniku rakoviny. Jejich aktivita buňky v dané fázi buněčného cyklu zastavuje, a
tak jsou často v rakovinných buňkách vyřazeny. Nejznámějšími negativními
regulátory buněčného cyklu jsou proteiny retinoblastoma (Rb), p53 a p21. Tyto tři
proteiny fungují především v G1 kontrolním bodu, tedy v okamžiku, kdy se
rozhoduje o tom, zda se buňka bude množit nebo ne.
p53 je multifunkční protein, který kontroluje, zda je DNA poškozená a pokud ano,
pozastaví buněčný cyklus a povolá reparační mechanismy. Pokud se DNA
opravit nedá, spustí apoptózu buňky. Jeho vysoká koncentrace spouští expresi
proteinu p21, který inhibuje komplex CDK-G1 cyklinu.
Protein retinoblastoma (Rb) pozastavuje cyklus v G1, což dává buňce dostatek
času, aby mohla narůst. Váže se na transkripční faktory (TF), které spouští
expresi genů řídících postup buněčného cyklu do S-fáze (transkripční faktor E2F
spouští expresi cyklinu E). Jeho vazba TF inhibuje, takže k expresi genů
nedochází, dokud je buňka malá. Jak roste, Rb je postupně fosforylován
komplexem cyklin D/CDK4/6, čímž ztrácí svůj inhibující účinek. Když je buňka
dostatečně velká, Rb již nefunguje, TFs iniciují expresi genů, jejichž produkty
posunou buňku do další fáze buněčného cyklu.
Protein retinoblastoma je pojmenován podle rakoviny sítnice u dětí, která je
způsobena právě mutací v genu Rb1 pro tento protein. Naštěstí je tato rakovina
poměrně dobře léčitelná, takže se dospělosti dožije 90% dětí.
Během buněčného cyklu musí buňka projít několika kontrolními body
(checkpoints), ve kterých se rozhoduje o tom, jestli může postoupit do další fáze.
- První bod je v G1, kdy se prověřuje, jestli je buňka dostatečně veliká, jestli má
dostatek energie pro rozdělení a jestli je její DNA nepoškozená.
- Druhý kontrolní bod je v G2 před vstupem do M-fáze. Kontroluje se velikost
buňky a to, zda je DNA zreplikovaná a není poškozená.
- Třetí kontrolní bod je v metafázi a kontroluje se, jestli je každý kinetochor
správně zachycen na vlákna dělícího vřeténka.
Obrázek z http://vulgaire.com/dna-replication-conservative-semiconservative/
Replikace DNA v eukaryotní buňce začíná z mnoha míst. Na ně nasedá komplex
ORC (origin recognition complex), na který si nasedají další faktory potřebné pro
replikaci DNA. Ne všechna potenciální místa počátku transkripce jsou využívána
vždy. Některá slabá místa dokáží vázat ORC jen při jeho vysoké koncentraci. Je
to regulační mechanismus, který organismu umožňuje rychlou replikaci DNA (a
následné rozdělení) při intenzivním růstu.
Různé oblasti genomu se replikují v jiných částech S-fáze. Transkripčně aktivní
euchromatin se replikuje na počátku S-fáze, heterochromatin na konci. To je
regulováno strukturou chromatinu (vazba histonu H1 brání vazbě ORC) i vazbou
regulačních faktorů např. jen na počátky rané replikace.
Je důležité, aby se během jednoho buněčného cyklu replikovala každá část
DNA právě jednou. Kromě vychýlení z genové dávky by nastaly i problémy s
rozchodem chromosomů v anafázi, protože nezreplikované oblasti chromosomů
by se nemohly separovat. Dvojité replikaci je zabráněno tzv. licenčním faktorem,
který označuje počátky replikace, ale během replikace je zničen. Dodán může být
až z cytoplazmy během anafáze, kdy neexistuje jaderná membrána. Tento faktor
byl objeven u drápatky Xenopus a skládá se ze dvou složek: RLF-M (replication
licensing factor M) a RLF-B. RFL-B je aktivní jen anafázi a aktivuje RLF-M, který
nasedá na chromatin v místech počátků replikace. V S-fázi začne replikace jen z
míst, kde sedí RLF-M, přičemž RLF-M je tímto zničen. Tím je zajištěno, že žádná
část DNA nebude replikovaná 2x.
Dokončení replikace DNA je hlídáno kontrolním bodem, kdy buňka detekuje
některé proteiny, které se nacházejí v replikačních vidličkách.
10
Po replikaci DNA jsou výsledné dvoušroubovice propletené a je potřeba je od
sebe oddělit, aby mohly vytvořit sesterské chromatidy a v anafázi se rozejít. Za
rozpletení DNA molekul je zodpovědný enzym topoisomaráza II (Topo II), která
rozštěpí jednu molekulu DNA na obou řetězcích a druhou molekulu jí protáhne.
Tím se uvolní superstočení DNA o 2 otáčky.
Rozplétání DNA se může dít ihned po dokončení replikace DNA (kvasinky)
nebo v G2 nebo dokonce v průběhu mitózy (někteří savci). U mnoha organismů
zůstávají centromery sesterských chromatid propletené do konce metáfáze.
11
12
13
14
15
Kondezace chromatinu začíná v profázi a je řízena regulátory buněčného cyklu
Cyklinem B/Cdk1. Na kondenzaci chromatinu se zřejmě podílí více paralelních
mechanismů. Chromosomální lešení (chromosome scaffold) je důležité pro
strukturu metafázního chromosomu a podílí se na kondenzaci chromatinu. Jeho
hlavními složkami jsou topoisomeráza II a proteinové komplexy kondensiny.
Proteiny v chromosomálním lešení jsou sice důležité pro ustavení struktury
metafázního chromosomu, ale kondenzace chromatinu by probíhala i bez nich.
Paralelně s kondensiny se na kondenzaci chromatinu podílí zatím neznámý
faktor RCA (regulator of chromosome architecture). RCA i kondensiny jsou
fosforylovány Cdk, tedy přímo reagují na regulátory buněčného cyklu.
Donev 2014
16
Od replikace DNA do metafáze jsou k sobě sesterské chromatidy připojeny
kondensinem, proteinovým komplexem, který vytváří kruh kolem sesterských
chromatid. Toto spojení je nesmírně důležité pro správný rozchod chromosomů.
Trvá do začátku anafáze, kdy anaphase-promoting complex (APC) degraduje
securin, protein, který inhibuje fungování separázy, což je enzym štěpící kohesin.
Spojení sesterských chromatid se nejdéle zachovává v oblasti centromery,
protože připojení a komunikace sesterských kinetochorů je klíčové pro fungování
metafázního kontrolního bodu. Když některý kinetochor není správně přichycen
na vlákna dělícího vřeténka, nevznikne bipolání tah způsobený mikrotubuly
dělícího vřeténka, proteiny zodpovědné za kontrolní bod v metafázi to rozpoznají
a inhibují APC a tím oddělení chromatid. Kohesin je více koncentrovaný v oblasti
centromer a tím je pomáhá chránit před tahem mikrotubulů dělícího vřeténka.
K vyšší koncentraci kohesinu v centromeře je důležitý pericentromerický
heterochromatin. Ukázalo se u kvasinek a obratlovců, že pokud v centromerách
není heterochromatin, kohesin není koncentrovaný, což vede k předčasnému
oddělení sesterských chromatid a tím k aneuploidiím v dceřiných buňkách. To je
možná vysvětlení toho, že většina eukaryot má v oblasti centromery
heterochromatin.
Watanabe 2005
17
Watanabe 2005
18
Dělicí vřeténko je tvořeny mikrotubuly – vlákny složenými z dimerů alfa/beta
tubulínů, která jsou velice dynamická. Mikrotubuly jsou dvou typů: 1)
kinetochorová vlákna (K-vlákna (K-fiber)) jsou mikrotubuly vážící se na
kinetochory a 2) polární (nekinetochorová vlákna). U kvasinek interaguje
kinetochor jen s jedním mikrotubulem, u obratlovců se jedno K-vlákno skládá
z 20-30 mikrotubulů. Jednotlivá vlákna dělícího vřeténka se upínají k pólům svým
–koncem. U živočichů jednotlivá vlákna vybíhají z centrosomu (= živočišné
MTOC).
Obrázky z:
http://en.wikipedia.org/wiki/Spindle_apparatus
http://biology4isc.weebly.com/6-cell-reproduction.html
19
Mikrotubuly tvořící vlákna dělícího vřeténka jsou tvořeny mnoha dimery
αλφα/βετα tubulínů. Díky tomu je vlákno polarizované a + konec má jiné
vlastnosti než – konec (+ je dynamičtějsí a náhodně přepíná mezi růstem a
ubýváním) . Polarita mikrotubulu je klíčová pro fungování motorových proteinů
(dynein + kineziny), které tak poznají, kterým směrem se mají po vlákně
pohybovat. Mikrotubuly mohou být stabilizovány proteiny MAP (microtubule
associated proteins).
Polymeraci tubulínů může být narušena kolchicinem, látkou izolovanou z ocúnu
jesenního, která se váže na tubulíny a znemožňuje tak formování mikrotubulů
dělícího vřeténka. Aplikace kolchicinu tedy způsobí absenci dělícího vřeténka v
metafázi, takže buňka není schopná metafázi opustit. Toho se využívá v
cytogenetice, když kultivujeme buňky pro přípravu chromosomálních preparátů.
Použitím kolchicinu se buňky postupně zastavují v metafázi, takže na preparátu
bude více chromosomů. Z tohoto důvodu se kolchicin někdy označuje jako
mitotický jed.
Walczak a Heald 2008
20
Mikrotubuly organizující centrum je místo, kde se začínají organizovat
mikrotubuly. Hraje roli ve formování cytoskeletu a během dělení buňky vytváří
dělící vřeténko. Živočišný centrosom je velká organela složená z páru centriol
obklopených amorfním pericenriolovým materiálem (PCM), ve kterém se začínají
tvořit mikrotubuly. Pro vznik mikrotubulů jsou důležité kroužky gama-tubulínu, ze
kterého začínají růst mikrotubuly tvořené dimery alfa a beta tubulínů. V PCM jsou
mikrotubuly ukotveny – koncem, tedy alfa-tubulínem. Před vstupem do mitózy a
meiózy se centrosom rozdělí a během profáze obě kopie putují na opačné konce
buněk. Tam společně vytvoří dělící vřeténko.
21
Navzdory moderním technikám stále nevíme, jak vlastně vzniká dělící vřeténko.
Existují dva základní modely. Klasický „ search and capture“ model a „self
assembly“ model.
Podle „search and capture“ modelu růst vláken dělícího vřeténka začíná z MTOC
(mictotubule organizing centre), ve kterém jsou mikrotubuly zakotveny „–“
koncem, zatímco „+“ konec dynamicky roste a hledá kinetochor nějakého
chromosomu. Když se mu to nepodaří, vlákno se zkracuje a znovu prodlužuje.
Když se mu podaří na kinetochor přichytit, je jeho konec stabilizovaný. Chycený
chromosom je tažen mikrotubulem k pólu, ze kterého vyrůstá. Když je chycen
mikrotubulem i kinetochor na sesterské chromatidě, je chromosom tažen zpět do
ekvatoriání roviny, kde se oba tahy mikrotubulů vyrovnají.
Matematické modely ukazují, že pokud by vazba mikrotubulů na kinetochory
závisela jen na tomto mechanismu, nemohla by proběhnout dostatečně rychle,
takže pravděpodobně existují daší mechanismy, které vazbě napomáhají (např.
spolupráce chromosomu při hledání mikrotubulu, nebo tvorba mikrotubulů i jinde
než v MTOC.
Walczak a Heald 2008
22
Alternativním modelem organizace dělící vřeténka je model „self assembly“, který
praví, že mikrotubuly se začínají vytvářet poblíž chromosomů nezávisle na
MTOC, tvoří opačně orientované vlákna, ze kterých se nakonec zformuje dělící
vřeténko. O tomto mechanismu se dříve myslelo, že funguje jen v oocytech, které
nemají MTOC, ale další pokusy ukázaly, že může být rozšířený.
Pokusy podporující model „Self assembly“
1) Do extraktu z vajíček žáby drápatky (Xenopus) byly zamíchány kuličky pokryté
DNA. Kolem nich se začaly spontánně tvořit mikrotubuly. Tím bylo prokázáno, že
mikrotubuly mohou za přítomnosti DNA vznikat i bez MTOC i bez kinetochorů.
2) V savčích buňkách byly poškozeny MTOCs a dělící vřeténko se přesto
dokázalo vytvořit a chromosomy se v pořádku rozešly.
Oba mechanismy se navzájem nevylučují a je možné, že v buňce koexistují.
Walczak a Heald 2008
23
Amfitelické připojení je správné připojení, kdy oba sesterské kinetochory jsou
připojeny k opačným pólům dělícího vřeténka tak, že každý kinetochor se váže
k bližšímu pólu. Monoorientované chromosomy (připojené jen jedním
kinetochorem) se přechodně vyskytují i v metafázi, ale věšina chromosomů je
správně připojena do konce prometafáze.
Syntelické připojení je stav, kdy jsou oba sesterské kinetochroy připojeny
k jednomu pólu dělícího vřeténka. Pokud by došlo k rozchodu takto připojených
chromatid, výsledkem by byly dvě aneuploidní dceřiné buňky, v jedné by byl tento
chromosom 1x, v druhé 3x.
Merotelické připojení je takové, kdy jsou oba sesterské kinetochory správně
připojeny každý k bližšímu pólu dělícího vřeténka až na jeden mikrotubul, který
jepřipojen k vzdálenějšímu kinetochoru. Při anafázi je pak tato chromatida tažena
k oběma pólům a zůstane uprostřed ekvatoriální roviny, což povede k její ztrátě.
Výsledkem je jedna aneuploidní buňka, kde tento chromosom chybí (respektive
je tam jen jeho homolog).
Paradoxně nejhorší poruchou je merotelické připojení, protože závažné chyby
syntelického připojení jsou detekovány kontrolními mechanismy metafázního
checkpointu a jsou opraveny, zatímco metorelické připojení detekované není
(mikrotubuly vyvíjejí správný tah na sesterské kinetochory). Když je chybné
připojení rozpoznáno, uvolní se špatně přichycené mikrotubuly depolymerací, což
je řízeno kinázou Aurora B.
Walczak a Heald 2008
24
Anafáze, čili vlastní rozchod sesterských chromatid k opačným pólům dělího
vřeténka, lze rozdělit na anafázi A, kdy se zkracují k-mikrotubuly, a anafázi B,
kdy se od sebe vzdalují póly dělícího vřeténka.
25
Anafázi, ve které dochází k rozchodu sesterských chromatid, lze rozdělit na dvě
části: anafázi A a anafázi B.
V anafázi A jsou od sebe chromatidy odtahovány dvěma mechanismy: 1)
zkracováním K-mikrotubulů, 2) pohybem motorových proteinů. Zkracování Kmikrotubulů popisují dva modely: a) Pacman (podle slavné počítačové hry) kdy
dochází k depolymeraci K-mikrotubulů z + konce, čili v místech přichycení
kinetochoru. Jak při depolymeraci zůstane kinetochor přichycen na vlákno není
jasné, snad je tam jakási kruhovitá struktura, která po vlákně klouže směrem k –
konci. b) „Poleward flux“ (tok směrem k pólu) je model, podle kterého na + konci
jsou dimery tubulínu přidávány a na – konci se zase oddělují. Jednotlivé dimery
tak vláknem proplují. Když je polymerace na + konci zastavena, tok pokračuje,
vlákno se zkracuje a chromatidy se pohybují směrem k polům. Tyto modely se
uplatňují v různých organismech s jinou pravděpodobností. Většina obratlovčích
buněk používá model pacman, zatímco u embrya drozofily e to naopak.
26
Cytokineze u živočišných buněk probíhá tak, že se buňka od okrajů směrem ke
středu zaškrtí a tím přepůlí. Středová oblast dělícího vřeténka (spindle middle
zone) se skládá z mikrotubulů, které se vzájemně přesahují, z proteinů, které je
váží k sobě, i z jiných proteinů. Vzniká tak proteinová matrix, která se se
zvětšující se rýhou zmenšuje, až vznikne husté středové tělísko (midbody). To
obsahuje membrány Golgiho aparátu a endopazmatického retikula a zřejmě řídí
dopravu váčků k rostoucí rýze.
Otegui et al. 2005
27
Na rozdíl od živočišných buněk, rostlinné buňky se rozdělí tak, že se ve středu
začne formovat buněčná stěna, která buňku přepaží. Zásadním útvarem řídícím
formování buněčné stěny v rostlinných buňkách je fragmoplast. Sestává z
mikrotubulů a mikrofilament, kolmých k formující se buněčné stěně (plazmatická
destička, cell plate), po kterých jsou transportovány váčky se stavebním
materiálem. Jak růst buněčné stěny pokračuje, vlákna fragmoplastu se
přeskupují tak, aby materiál putoval k okrajům destičky.
Otegui et al. 2005
28
29
30
31
Download

04 Mitóza a buněčný cyklus