BROJ I VIJABILNOST
VAGINALNIH
POLIMORFONUKLEARA
KAO POKAZATELJ RIZIKA
ZA PREVREMENI
POROĐAJ
Ppk dr med. mr sc. med DANE NENADIĆ
1
UNIVERZITET ODBRANE
VOJNOMEDICINSKA AKADEMIJA
Ppk dr med. mr sc. med.
DANE NENADIĆ
BROJ I VIJABILNOST VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA KAO POKAZATELJ
RIZIKA ZA PREVREMENI POROĐAJ
DOKTORSKA TEZA
mentor Brigadni general akademik Miodrag Čolić
Beograd, 14.11.2014. god.
2
3
SADRŽAJ
DOKTORSKA TEZA ................................................................................................................ 2
SAŽETAK .................................................................................................................................. 6
ABSTRACT ............................................................................................................................... 8
1.
2
3
UVOD .............................................................................................................................. 10
1.1
PREVREMENI POROĐAJ ....................................................................................... 11
1.2
ZAPALJENJSKI PROCES KAO SREDIŠNJI DOGAĐAJ TERMINSKOG I PP .. 14
1.3
INFEKCIJE I PREVREMENI POROĐAJ ................................................................ 16
1.4
VAGINALNE INFEKCIJE ....................................................................................... 23
1.5
MIKROBIOM VAGINE ........................................................................................... 26
1.6
LOKALNI IMUNSKI SISTEM IPOLIMORFONUKLEARI .................................. 33
1.7
APOPTOZA .............................................................................................................. 36
1.8
BROJ POLIMORFONUKLEARA U VAGINALNOM SEKRETU ........................ 38
1.9
CERVIKOMETRIJA................................................................................................. 40
RADNE HIPOTEZE ........................................................................................................ 45
2.1
CILJEVI..................................................................................................................... 45
2.2
PACIJENTKINJE I METODI ................................................................................... 47
2.3
PROCENA STANJA VAGINALNE FLORE - MIKROSKOPSKI NALAZ........... 48
2.3.1
Mikroskopski pregled nativnog preparata ( X400 ) .......................................... 48
2.3.2
Bojenje po Gramu .............................................................................................. 52
2.4
ODREĐIVANJE BROJA VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA ................. 87
2.5
ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA ... 94
2.6
ODREĐIVANJE KONCENTRACIJA ISPITIVANIH CITOKINA ........................ 97
2.7
MERENJE DUŽINE GRLIĆA MATERICE ............................................................ 98
2.8
STATISTIČKA ANALIZA ....................................................................................... 98
REZULTATI I DISKUSIJA .......................................................................................... 100
3.1 UPOREDNI REZULTATI - POSTOJEĆI DIJAGNOSTIČKI KRITERIJUMI U
ODNOSU NA NOVU PODELU ....................................................................................... 100
3.1.1
Poređenje rezultata–Nugentovi kriterijumi i NOVA PODELA ....................... 100
3.1.2
Poređenje rezultata - Amselovi kriterijumi i NOVA PODELA ....................... 105
3.1.3
Poređenje rezultata - kriterijumi po Nugentu, Ison/Hayu i NOVA PODELA 107
3.1.4
Poređenje rezultata – Claeysu, Nugentu; Ison/Hayu i Nova Podela ............... 113
3.2 MOGUĆI OMETAJUĆI ČINIOCI U DIJAGNOZI STANJA MIKROFLORE
VAGINE............................................................................................................................. 121
3.2.1
KVASNICE IZ RODA KANDIDA (Candida spp.) ........................................ 121
3.2.2
MORFOTIP KOKA ......................................................................................... 144
3.2.3
MORFOTIP LEPTO ........................................................................................ 150
3.2.4
MORFOTIP BIFIDO ....................................................................................... 155
4
3.3
BROJ, VIJABILNOST I APOPTOZA VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA
161
3.3.1
BROJ POLIMORFONUKLEARA- SEMIKVANTITATIVNE METODE .... 162
3.3.2
BROJ POLIMORFONUKLEARA- KVANTITATIVNE METODE ............. 170
3.3.3
APOPTOZA I VIJABILNOST VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA 187
3.4
UKUPNA PROCENA STANJA VAGINALNOG EKOSISTEMA ....................... 205
3.5
pH VAGINE U PROCENI STANJA VAGINALNOG EKOSISTEMA ................ 243
3.6
VREDNOST NALAZA KULTURE CERVIKOVAGINALNOG BRISA ............ 253
3.7
KONCENTRACIJE ISPITIVANIH CITOKINA ................................................... 257
3.7.1
IL-1 ................................................................................................................. 265
3.7.2
IL-6 ................................................................................................................... 266
3.7.3
IL-12 p70 .......................................................................................................... 269
3.7.4 KONCENTACIJE CITOKINA PO GRUPAMA NA OSNOVU RAZLIČITIH
DIJAGNOSTIČKIH KRITERIJUMA ........................................................................... 272
4
3.8
BIFIDO FORME I PREVREMENI POROĐAJ ..................................................... 291
3.9
DUŽINA GRLIĆA I PREVREMENI POROĐAJ .................................................. 306
ZAKLJUČCI .................................................................................................................. 321
LITERATURA ....................................................................................................................... 324
PRILOG 1 .............................................................................................................................. 365
PRILOG 2 .............................................................................................................................. 375
PRILOG 3 .............................................................................................................................. 380
PRILOG 4 .............................................................................................................................. 398
5
SAŽETAK
Uvod: Prevremeni porođaj (PP) je glavni uzrok perinatalnog morbiditeta i mortaliteta.
Učestalost PP nije se bitnije menjala poslednjih nekoliko decenija, a u Srbiji je između 6-9%.
Promene u sastavu vaginalne flore i posledično zapaljenje su početni i najvažniji događaj u
etiopatogenezi prevremenog porođaja (PP) udruženog s infekcijom, a polimorfonuklearni
leukociti (PMN) kao primarne efektorske i imunoregulatorne ćelije igraju značajnu ulogu u
ovim zbivanjima.
Cilj: Utvrditi međusobnu povezanost broja, vijabilnosti i apoptoze vaginalnih PMN sa
rezultatima mikroskopskih, mikrobioloških, ultrazvučnih nalaza i koncentracija različitih
citokina, a potom i utvrditi vrednost svih ovih parametara u proceni rizika za PP.
Pacijentkinje i metodi: Prospektivna studija, 732 trudnice bez znakova i simptoma PP, u
periodu između 24. i 28. nedelje trudnoće. Određivana je vijabilnost i apoptoza PMN i
kvantitativno određivan broj PMN (n=217). Mikroskopske analize su obuhvatale
semikvantitativno određivanje broja PMN i pregled brisa vaginalnog sekreta nativnog preparata
i preparata bojenog po Gramu na osnovu standardnih dijagnostičkih kriterijuma i
mikroskopskih uvećanja na x400 i x1000 i dve nove metodologije mikroskopsko pregleda
(NMMP) na uvećanju x200 za procenu stanja vaginalne flore i za semikvantitativno određivanje
broja PMN. Ispitivane su i koncentracije 13 citokina i merena dužina grlića transvaginalnim
ultrazvukom.
Rezultati: NMMP daje bolje rezultate u proceni stanja vaginalne flore i određivanju broja PMN
u odnosu na standardne i kvantitativne metode. Ovakvim pristupom detektovana grupa
pacijentkinja (n=50) sa mikroskopskim nalazom BIFIDO formi imala je 9,8 puta veći relativni
rizik (RR=9,8; 95% CI 2,7-34,6) za PP u odnosu na pacijentkinje sa normalnim nalazom ili BV.
U ovoj grupi procenat apoptoze i koncentracije antiinflamatornog IL-10 bile su statistički
značajno niže (p<0,001 i p<0,05), a vaginalni pH>4,5. Pacijentkinje sa BV imale su povećan
stepen apoptoze, ali i povećane koncentracije IL-1β i IL-6. Utvrđeno je postojanje negativne
korelacije između broja PMN stepena apoptoze i dužine grlića materice. Procenat apoptoze je
bio manji kod pacijentkinja sa povećanim broj PMN. Samo su pacijentkinje sa povećanim
brojem PMN na uvećanju x200 imale značajno kraći grlić (p<0,05), a kraći grlić je bio povezan
sa povećanim rizikom za PP. Drugi poremećaji vaginalne flore i koncentracije ispitivanih
citokina nisu pokazali povezanost sa incidencijom ili rizikom od PP. Pre 37 n.g se porodilo se
3,4% (21/619) pacijentkinja, od kojih se preko polovine (n=11) porodilo posle 35 n.g.
6
Zaključak: Različiti bakterijski morfotipovi daju slične mikroskopske nalaze na preparatu
bojenom po Gramu, a trenutni dijagnostički kriterijumi uvažavaju samo tri bakterijska
morfotipa i dijagnostikuju BV. Za bolju procenu rizika za PP potrebna je pažljivija analiza
bakterijskih morfotipova, njihova semikvantitativna procena i istovremena primena drugih
jednostavnih metoda poput pH vagine koji, primenjeni zajedno, obezbeđuju veću senzitivnost
u otkrivanju vaginalne disbioze. Asimptomatske trudnice između 24-28 n.g. kod kojih NMMP
detektujemo BIFIDO forme i povećan broj PMN, a imaju i manji procenat apoptoze, povišen
pH vagine i kraći grlić materice predstavljaju grupu sa visokim rizikom za PP. NMMP kao
jednostavna, jeftina i brza procedura omogućava precizniju procenu broja vaginalnih PMN i
kvantitativni i kvalitativni biodiverzitet vaginalne mikroflore i tako bolje prepoznavanje
pacijentkinja sa rizikom za PP. Zajedno sa još dva jednostavna testa (pH i KOH) i
cervikometrijom, NMMP možemo iz populacije asimptomatskih trudnica izdvojiti najveći broj
onih sa povećanim rizikom za PP i adekvatnim lečenjem značajno smanjiti učestalost PP (3,4%)
kao što je to pokazano u ovom ispitivanju.
7
ABSTRACT
Introduction: Preterm birth (PB) is a major cause of perinatal morbidity and mortality.
Incidence of PB has not substantially changed over the past decades, and in Serbia ranges from
6 to 9%. Alterations in the composition of vaginal microflora and accompanying inflammation
are initial and most important events in etiopathogenesis of PB associated with infection.
Polymorphonuclear leukocytes (PMN) as primary effector and immunoregulatory cells play a
prominent role in the process.
Aim: Determine possible relationships between numbers, viability and apoptosis of vaginal
PMN, and cytokines’ levels, results of microscopic, microbiologic and ultrasonographic
findings. Establish the value of the parameters in the PB risk prediction.
Patients and methods: The prospective study enrolled 732 pregnant women without signs and
symptoms of PB, examined between weeks 24 and 28 of gestation. Viability, apoptosis and
numbers of PMN were determined in a quantitative fashion (n=217). Microscopic analyses
comprised semiquantitative PMN determination, native and Gram-stained vaginal smear
analysis according to standard diagnostic criteria at magnifications x400 and x1000, and two
newly described methods at a magnification of x200. Concentrations of 13 cytokines were
measured and length of uterine cervix was assessed by transvaginal ultrasound.
Results: Microscopic examination of Gram-stained samples at x200 offers better results in
vaginal microflora assessment and PMN quantification than standard and quantitative methods,
respectively. This approach enabled us to detect a group of patients (n=50) with a microscopic
finding of BIFIDO forms which had a 9.8 higher relative risk (RR=9.8; 95% CI 2.7-34.6) for
PB in comparison to patients with normal findings or bacterial vaginosis (BV). In this group of
pregnant women the percentage of apoptosis of PMN and levels of IL-10 were significantly
lower (p<0.001 and p<0.05), and vaginal pH was 4.5. Women with BV had higher apoptosis
of PMN and elevated levels of IL-1 and IL-6. Patients with elevated PMN numbers,
determined at a magnification x200, had significantly shorter cervix (p<0.05). Apoptosis and
number of PMN were inversely correlated. The shorter cervix means a higher risk for PB. Other
disorders of vaginal microflora and cytokines’ concentrations have not shown any association
with the incidence or risks for PB. PB was registered in 3.4% of our women (21/619) with more
than a half (n=11) gave birth after week 35.
Conclusion: Diverse bacterial morphotypes produce similar microscopic images on Gramstained samples but presently widely used diagnostic criteria take into account only three
8
morphotypes primarily to diagnose BV. For a better assessment of risks for PB, a careful
analysis of more bacterial morphotypes and their semiquantitative determination are required
along with the use of other simple tests like vaginal pH which, used together, offer higher
sensitivity in detection of vaginal dysbiosis. Pregnant women with BIFIDO forms, elevated
PMN numbers and decreased apoptosis, higher vaginal pH and shorter cervix represent a group
with a high risk for PB. The newly described method of microscopic analysis of vaginal smears
is cheap, simple and rapid procedure to estimate numbers of PMN, and quantitative and
qualitative biodiversity of vaginal mircoflora, and thus better identification of women with
higher risks for PB. Along with two simple screening tests (vaginal pH and KOH) and
cervicometry, this microscopic method enables us to select from the population of
asymptomatic pregnant women most of those in risk for PB. Consequently, appropriate
treatment may result in decreased incidence of PB (3, 4%) as we showed in this study.
9
1. UVOD
Prevremeni porođaj (PP) je vodeći uzrok perinatalnog morbiditeta i mortaliteta, čija se
učestalost uprkos napretku dijagnostičkih i terapijskih postupaka nije značajnije menjala u
poslednjih trideset godina. Nepotpuno razumevanje mehanizama koji dovode do terminskog i
prevremenog porođaja svakako su jedan od osnovnih razloga slabih rezultata na polju
prevencije, predviđanja, rane dijagnoze i lečenja ovog sindroma. Klinički i eksperimentalni
podaci pokazuju da infekcija i/ili zapaljenje igraju središnju ulogu u mehanizmu PP i
predstavljaju jedan od najvažnijih faktora rizika za oštećenje fetusa. U najvećem broju
slučajeva, početni korak je promena normalne u patološku vaginalnu mikrofloru, koja onda
ascendentnim putem može da dovede do intrauterne infekcije (IUI). Polimorfonukleari (PMN)
kao deo urođenog imunskog sistema prva su linija odbrane protiv najvećeg broja patogena, a
pokazano je da oni, pored efektorskih, imaju i regulatornu ulogu u pokretanju imunskog
odgovora domaćina. Prepoznavanje patogena i vezivanje za „uzbunjivačke“ receptore (TLR;
engl. toll-like receptors) koji prepoznaju molekularne uzorke tipične za mikroorganizme,
dovodi do aktivacije untarćelijskih signalnih puteva i transkripcionih faktora koji pokreću
ekspresiju grupa gena, i oslobađanje brojnih proinflamatornih medijatora, među kojima citokini
igraju veoma važnu ulogu. Adekvatan zapaljenjski odgovor domaćina podrazumeva niz
mehanizama u kojima će patogen biti savladan, a domaćin će pretrpeti najmanju moguću štetu.
U konkretnom slučaju to podrazumeva kontrolu imunskog odgovora tokom njegovog trajanja,
kako u kvalitativnom tako i kvalitativnom smislu tako da ne dođe do pojačanog oslobađanja
prostaglandina i drugih faktora koji bi uzrokovali kontrakcije uterusa, promene na grliću i
aktivaciju fetalnih membrana, odnosno PP. Da bi se sve povoljno završilo po domaćina odgovor
na patogen treba pravovremeno da se pokrene, ali ništa manje nije važno da se ovaj proces
pravovremeno i zaustavi i tako spreče negativne posledice po domaćina. U imunskom odgovoru
domaćina apoptoza PMN je svakako jedan od važnih mehanizama koji upravlja njegovim
početkom, trajanjem i završetkom.
Imajući u vidu ove činjenice naše ispitivanje je imalo za cilj da otkrije promene u
vaginalnoj mikroflori, sa posebnim osvrtom na PMN kao najvažnije imunske ćelije u odgovoru
na infekciju različitim mikroorganizmima, da detektuje promene u lokalnim koncentracijama
citokina, kao i da utvrdi stepen apoptoze vaginalnih PMN. Naime, po našem mišljenju je
paradoksalno da je u poslednjih tridesetak godina napravljen veliki broj studija koji ispituju
koncentracije različitih proinflamatornih ili antiinflamatornih medijatora, dok se broj PMN
10
najčešće i ne pominje, uprkos činjenici da je takav pristup jeftin i brz i pacijenti ga dobro
prihvataju. Danas se ne zna koliki je fiziološki broj PMN u vaginalnom sekretu, a raspon u
broju PMN koji neki autori smatraju normalnim ili patološkim ponekad je zapanjujući. Zbog
toga je primarni cilj našeg ispitivanja da, korišćenjem nekoliko različitih metoda, pokušamo da
definišemo fiziološki broj PMN, a onda da utvrdimo njegov odnos sa rezultatima
mikroskopskih i mikrobioloških ispitivanja vaginalne flore, lokalnim koncentracijama 13
različitih citokina, vijabilnosti i apoptozom vaginalnih PMN.
1.1
PREVREMENI POROĐAJ
Kod većine vrsta interval između začeća i porođaja varira vrlo malo, za razliku od ljudi gde do
porođaja može doći nedeljama pre očekivanog datuma. Kompleksna povezanost i međusobnu
zavisnost signala koji dolaze od majke, ploda i posteljice svakako su razlog što još nemamo
odgovor na pitanje kako započinje normalan porođaj [1, 2].
Slika 1.1: Shema termina porođaja po preporuci Svetske zdravstvene organizacije
Po preporuci Svetske zdravstvene organizacije prevremeni porođaj se definiše kao
porođaj koji se događa pre napunjene 37. nedelje gestacije ili pre 259. dana od prvog dana
poslednje menstruacije (WHO 1993). Završetak trudnoće pre navršene 23. n. g. smatramo
abortusom.
Nije jednostavno precizno odrediti gestacionu starost. Sigurno je da je ultrazvučni (UZ)
pregled u ranoj trudnoći najprecizniji parametar za određivanje gestacione starosti, i da je UZ
gestaciona starost u proseku niža od gestacione starosti određene na osnovu prvog dana
poslednje menstruacije što dovodi do povećanja učestalosti PP i smanjenja učestalosti
prenesenih trudnoća. Tako studija Yanga i sar. [3] ukazuje na značajan porast prevalencije PP
kada se gestaciona starost određuje UZ, i potvrđuje da je kasna ovulacija češća od rane. Jasno
je da ovi podaci mogu bitno da utiču na učestalost PP u različitim zemljama ili istim zemljama
u različitim vremenskim periodima (pre korišćenja UZ).
11
U okviru PP razlikujemo nekoliko podgrupa u odnosu na period kada je do PP došlo:

kasni PP (34-36,6. n.g.)

umereno rani PP (31-33,6. n.g)

rani, pre 28-30,6. n.g.

izuzetno rani, pre 27. n.g.
Dalje, PP ne predstavlja homogeno stanje nego je posledica sadejstva različitih faktora
koji utiču na etiopatogenezu, terapiju i krajnji ishod. Tako je PP kod pacijentkinje sa teškom
preeklampsijom u 30. nedelji gestacije bitno različit u etiologiji, obstetričkom pristupu i
krajnjem ishodu od prevremenog prskanja vodenjaka u 36. n. g. ili PP u 27. n.g. zbog
antepartalnog krvarenja. Smatra se da se oko 10% PP dešava između 20-27.n.g., drugih 10%
između 28-33.n.g., a oko 80% između 34-36.n.g. Oko 5% ekstremno ranih PP čine više od 40%
mrtvorođenosti ili neonatalne smrtnosti, dok preko 50% rođenih posle 35. n.g. čine manje od
10% perinatalne smrtnosti. PP može da bude spontan ili se radi o elektivnom porođaju zbog
komplikacija kod majke ili ploda (eklampsija ili intrauterinog zastoja u rastu). Kada govorimo
o spontanim PP, opet je bitno da li je do njega došlo zbog razvoja prevremenih kontrakcija,
prevremenog prskanja plodovih ovojaka (PPPO) ili antepartalnog krvarenja. Dalje, kada se
govori o PP vrlo je važno razlučiti tri grupe: 1) pacijentkinje sa višeplodnim trudnoćama; 2)
pacijentkinje sa urođenim anomalijama i intrauterinom smrću ploda i 3) jednoplodne trudnoće
sa vitalnim plodom.
Klinički kriterijum PP podrazumevaju dokumentovane uterusne kontrakcije (4 za 20
minuta ili 8 za 1 čas), intaktne plodove ovojke, skraćenje grlića za oko 80% i dilatacija cerviksa
najmanje 2 cm. Prevremenim porođajem se smatraju i oni slučajevi kod kojih je došlo do PPPO
bez obzira na aktivnost materice i stanje grlića. Uterine kontrakcije koje mogu da dovedu do
promena na cerviksu traju 40-60 sekundi sa uterusom koji je tvrd na palpaciju. Dilatacija se
odnosi na nivo unutrašnjeg materičnog ušća ili cervikalnog kanala, odnosno moguća je
palpacija fetalnih membrana. Faktori udruženi sa PP dele se najčešće u tri grupe: sociobiološke,
ranija obstetrička istorija i komplikacije u aktuelnoj trudnoći. Sociobiološki faktori obuhvataju:
starost majke i broj prethodnih porođaja, bračno stanje, rasnu i etničku pripadnost, posao,
ishranu, stres, gojaznost, pušenje, konzumiranje kafe, alkohola ili droga, interval između
trudnoća. Meta-analitička studija Shaha i Brackena [4] je pokazala da pušenje može imati
uzročnu ulogu u nastanku PP. Ranija obstetrička istorija obuhvata podatke o toku i ishodu
prethodnih trudnoća a najvažniji je podatak o ranijim PP i spontanim abortusima, što su
pokazali Mercer i sar. [5]. Naime oni su našli značajnu udruženost ranijeg spontanog PP i
12
ponovnog prevremenog porođaja u aktuelnoj trudnoći, kao i veću verovatnoću ponovnog PP sa
manjom gestacijskom starosti prethodnog PP. Raniji PP uzrokovan PPPO, skraćen grlić i
pozitivan fetalni fibronektinski test (FFT) pokazuju visoku udruženost sa PP uzrokovanim
PPPO i u aktualnoj trudnoći [6]. Raniji PP, uz FFT i skraćen grlić, predstavljaju najznačajnije
prediktore PP [7]. Komplikacije u tekućoj trudnoći podrazumevaju elektivni PP zbog
komplikacija kod majke ili fetusa, zatim multiple trudnoće, kongenitalne anomalije i infekcije
[8]. Tako su Meis i sar. [9] našli da je najbolji način za prevenciju PP pronalazak boljih načina
prevencije i terapije hipertenzivne bolesti u trudnoći. Pokušaji da se na osnovu ovih faktor rizika
izgrade bodovni sistemi za određivanje stepena rizika za PP pokazali su se neuspešnim jer se
ovakvim pristupom nije mogao idenfikovati veliki broj žena koje su se porodile pre vremena.
Više od 50% svih PP dešava se kod žena kod kojih se ne mogu ustanoviti faktori rizika [10,
11].Tako su Mercer i sar [12] u studiji rađenoj u 10 centara ukupno 2929 žena našli da ovakav
sistem skora može identifikovati mali broj žena koje će se poroditi pre vremena (senzitivnost
24,2%, PPV 28,6%).
Morbiditet i mortalitet ploda i rane i kasne sekvele u obrnutoj su korelaciji sa vremenom
u kome je došlo do PP. U etiološkom smislu PP se najčešće dele u tri kategorije: 1) indukovani
zbog komplikacija kod majke ili ploda u trudnoći (25%), 2) PP koji započinju prskanjem
plodovih ovojaka (25%) i 3) idiopatski PP, odnosno oni u kojima je početni događaj spontano
započinjanje porođaja uz očuvane plodove ovojke (50%). Ipak kako su dve poslednje kategorije
veoma slične, suštinska razlika postoji između indukovanog (25%) i spontanog PP (75%) [14].
PP je najvažniji pojedinačni uzrok perinatalnog morbiditeta (75%) i neonatalnog mortaliteta
(85%). Učestalost PP u svetu kreće se od 5-12%, a u Srbiji je ovaj procenat između 6- 8% [15
- 19]. Godišnje se oko 15 miliona beba rodi pre vremena, a oko 1 milion umre zbog
komplikacija, a PP je najčešći pojedinačni uzrok smrtnosti prevremeno rođene dece [15].
Poslednjih nekoliko decenija značajno je smanjen procenat smrtnosti prevremeno rođene dece,
što je, pre svega, posledica napretka u postnatalnoj nezi prevremeno rođenih [16, 17]. S druge
strane, povećano preživljavanje, posebno onih koji su rođeni pre 32. n. g. dovelo je do veće
prevalencije sindroma respiratornog distresa, periventrikularne hemoragije i leukomalacije,
hroničnih plućnih bolesti, nekrotizujućeg enterokolitisa, retinopatije nedonoščadi, povećane
osetljivosti na infekcije (septikemija), kao i različitih kasnih neuroloških i psiholoških sekvela
kao što su cerebralna paraliza, problemi sa vidom i sluhom, epilepsija i smanjena inteligencija
[20 - 22]. Pretpostavlja se da je bar 10% PP potencijalno preventabilno, što bi smanjilo broj
prevremeno rođene dece za oko 1,5 miliona [23 - 25]. Nažalost, u poslednjih nekoliko decenija
učestalost PP nije se bitnije menjala, a u nekim razvijenim zapadnim zemljama imala je i trend
13
porasta. Veliki broj ispitivanja i pokušaji da se izdvoje žene koje bi imale povećan rizik za PP,
uglavnom su ostali neuspešni.[26 - 32].
U poslednjih tridesetak godina ispitivano je preko 200 različitih biomarkera u
predviđanju PP, ali ni jedan od njih za sada nije našao širu primenu u kliničkoj praksi. Preko
polovine žena koje se porode pre vremena, nemaju ni jedan nama poznati činilac rizika za PP
[32 - 35].Većina autora se slaže da PP nije nikada uzrokovan jednim etiološkim faktorom, nego
da različiti patološki procesi i stanja majke, ploda i posteljice dovode do aktivacije plodovih
ovojaka, promena na grliću materice i miometrijumu i otpočinjanja PP [36 -38].
1.2
ZAPALJENJSKI PROCES KAO SREDIŠNJI DOGAĐAJ TERMINSKOG I PP
Kao i kod većine vrsta i kod čoveka je materica u većem delu trudnoće u fazi mirovanja.
Povremene kontrakcije su kratkog trajanja, slabo sinhronizovane, niskih amplituda tako da ne
dovode do značajnijeg porasta intrauterinog pritiska. Ovakva aktivnost se kod životinja naziva
kontrakturama, a kod čoveka su poznate kao Braxton-Hicksove kontrakcije. Ova faza obuhvata
oko 95% trajanja trudnoće i to je faza u kojoj se uterus nalazi u stanju mirovanja koje je
omogućeno aktivnošću jednog ili više inhibitornih sistema. Ovi inhibitori uključuju pre svega
progesteron, zatim prostaciklin i azot oksid kao i mnoge druge supstance. Dakle, miometrijalna
aktivnost tokom trudnoće prigušena je supstancama koje deluju preko različitih mehanizama,
mada uopšteno dovode do povećanja unutarćelijskog nivoa cikličnih nukleotida koji inhibišu
oslobađanje Ca2+ iz unutarćelijskih depoa, ili smanjuju aktivnost kinaze lakog lanca miozina.
Prestanak delovanja jednog ili više takvih činilaca može da dovede do započinjanja bilo
terminskog bilo PP. Okidač za prevagu kontrakcija nad kontrakturama dešava se kao normalan
fiziološki proces u terminu ili može da bude pokrenut različitim patološkim stanjima. Od
značaja je i činjenica da se ovaj prelaz sa kontraktura na kontrakcije najčešće dešava noću i da
mu prethodi obrazac povećane noćne materične aktivnosti u smislu kontrakcija. Ciklični
dnevno-noćni obrazac ukazuje na činjenicu da se materična aktivnost nalazi i pod kontrolom
neuromehanizama, jer su neuroni jedine ćelije za koje je poznato da imaju ovakav nezavisan
cirkadijalni ritam. Danas još nemamo odgovor na pitanje da li pad u koncentraciji relaksirajućih
supstanci ili porast supstanci koje stimulišu uterusnu aktivnost dovode do započinjanja
porođaja, a najverovatnije je da porođaj nastaje koda dođe do prevage jednih ili drugih supstanci
koji se tokom trudnoće nalaze u stanju dinamičke ravnoteže. S kliničkog aspekta započinjanje
porođaja obuhvata tri različita elementa: 1) promenu obrasca kontraktilnosti miometrijuma od
kontraktura (kratkotrajne kontrakcije, niskih amplituda i male frekvencije) do kontrakcija
(dužeg trajanja, viših amplituda i veće učestalosti), 2) skraćivanje i širenje grlića, i 3) prskanje
14
plodovih ovojaka. Osim toga, u najvećem broju slučajeva, postoji vremenski određena
zavisnost između ovih događaja i biohemijske promene u tkivu grlića obično prethode
kontrakcijama materice koje onda dovode do dilatacije grlića. Ovi događaji najčešće prethode
prskanju plodovih ovojaka i smatra se da u svega oko 10% slučajeva dolazi do spontanog
prskanja ovojaka pre započinjanja materične aktivnosti.
Većina autora se slaže da i terminski PP suštinski predstavljaju zapaljenjski proces [43 - 47].
Na osnovu dosadašnjih ispitivanja većina autoriteta na polju prevremenog porođaja slaže se da
se PL i TL dva fundamentalno ista događaja koji se dešavaju u različitim periodima trudnoće.
U oba slučaja mehanizam je isti i podrazumeva uterine kontrakcije, dilataciju cerviksa i
aktiviranje fetalnih membrana. Dakle, osnovna razlika između ova dva procesa je ta što je
terminski porođaj rezultat fiziološke aktivacije mehanizma porođaja, dok PL nastaje kao
posledica nekog patološkog stanja koje dovodi do aktivacije jedne ili više komponenti koji onda
pokreću porođajni mehanizam pre vremena
Postoji veliki broj podataka koji ukazuju da je terminski porođaj udružen sa aktivacijom
zapaljenjskog procesa u plodovim ovojcima, decidui i grliću, i da zapaljenjski medijatori igraju
ključnu ulogu u humanom porođaju [48, 49]..Tako je sazrevanje grlica, koje predstavlja rani
događaj u normalnom porođaju, poređeno sa zapaljenjskim procesom koji se karakteriše
infiltracijom leukocita u stromi grlića [50, 51]. Thomson i sar. [53] su pokazali da neutrofili i
makrofagi infiltrišu i miometrijum, predominantno donji uterusni segment tokom terminskog
porođaja. Aktivisani neutrofili i makrofagi su bogat izvor zapaljenjskih medijatora kao što su
aktivator plazminogena, eikosanoidi, kolagenaze, elastaze i proinflamatorni citokini. Ovaj
inflamatorni infiltrat ima različitu ulogu u različitim regijama uterusa. Tako bi u donjem
materičnom segmentu učestvovao u remodeliranju tkiva i sazrevanju grlića, dok bi u gornjim
partijama preko pomenutih medijatora direktno ili indirektno podsticao kontraktilnost uterusa
[55]. Winkler i sar. [56] su pokazali da infiltracija cervikalne strome neutrofilima posredovana
IL-8 igra važnu ulogu u porođaju. Dakle, razlika je u tome što kod terminskog porođaja
zapaljenjski proces biva pokrenut fiziološkim mehanizmima posle 37. n.g, dok kod PP
zapaljenje biva pokrenuto nekim od patoloških mehanizama i pre 37. n. g.
U fiziološkim uslovima najčešće uterusne kontrakcije prethode promenama na cerviksu
i aktivaciji plodovih ovojaka, da bi u jednom sinhronom, precizno kontrolisanom procesu došlo
do normalnog porođaja [57]. Kod PP se obično izolovano, neusklađeno aktiviše jedan od ovih
mehanizama (dilatacija grlića, pucanje plodovih ovojaka, uterusne kontrakcije) i uzrokuje PP.
Prelazak uterusa iz stanja mirovanja u stanje aktivnih kontrakcija i sledstvenog PP može biti
pokrenuto različitim patološkim mehanizmima kao što su: 1) infekcije; 2) uteroplacentna
15
ishemija i decidualna krvarenja, 3) prerastegnutost uterusa, 4) alergijski fenomeni, 5)
poremećaji u imunološkoj toleranciji ploda („fetus kao alograft“), 6) cervikalni faktor,
insuficijencija grlića, 7) stres majke i/ili fetusa, 8) hormonski poremećaji (misli se pre svega na
progesteron i hormon koji oslobađa kortikotropin i genetski i/ili epigenetski faktori.
Slika 1.2: Shematski prikaz patoloških mehanizama koji mogu dovesti do prevremenog porođaja
Dakle, mogli bismo reći da svaki od navedenih etioloških faktora, sam ili više njih, može da
predstavlja okidač koji će uterusnu sredinu iz antiinflamatarnog prevesti u proinflamatorno
stanje i dovesti do PP. Pošto infekcije predstavljaju najčešći uzrok PP, onda je to najbolji primer
za suštinski ista inflamatorna zbivanja koja se dešavaju i kod PP uzrokovanih drugim etiološkim
faktorima.
1.3
INFEKCIJE I PREVREMENI POROĐAJ
Od 25-40% svih PP dešava se kod trudnica sa IUI, a ovaj procenat raste sa manjom gestacionom
starošću i dostiže 80% ukoliko je do PP došlo pre 30. n.g [56, 57]. Infekcije predstavljaju ne
samo najčešći, nego i jedini etiološki faktor, za koji je utvrđena kauzalna povezanost sa PP [5860]. Na ovakvu uzročnu povezanost ukazuju mnogobrojni rezultati eksperimentalnih i kliničkih
ispitivanja. IUI ili sistemska primena mikrobioloških produkata kod gravidnih životinja dovodi
do PP [61-64]. Fetus i placenta miševa predstavljaju najbogatiji izvor antiinflamatornog
16
citokina IL-1ra, dok je uterus važan izvor proinflamatornih citokina IL-1, IL-6 i TNF-,
međutim nivo IL-1ra u uterusu nedovoljno je visok da bi mogao da poništi dejstva IL-1 tokom
infekcije [64-67]. Infekcije na udaljenim organima (paradontitis, pijelonefitis, pneumonija,
malarija, infekcije urinarnog trakta) često su udružene sa PP [68-71].
Kod ljudi je pokazano da je supklinička IUI udružena je sa PP [72-77].Pacijentkinje sa
intraamnionskom
infekcijom
ili
zapaljenjem
(na
osnovu
povećanih
koncentracija
proinflamatornih medijatora u amnionskoj tečnosti) u drugom tromesečju imaju povećan rizik
za PP [78-83]. Lečenje bakterijske vaginoze (BV) i asimptomatske bakteriurije smanjuje
učestalost PP [84-89]. U eksperimentalnom modelu lečenje antibioticima horioamnionitisa
izazvanog ascedentnom intrauterinom infekcijom može da spreči PP [90].
Mikrorganizmi mogu da stignu do amnionske šupljine i ploda i dovedu do IUI različitim
putevima: ascendentno iz vagine preko cerviksa, hematogena diseminacija kroz placentu,
transplacentarno, retrogradno iz peritonelne duplje preko jajovoda ili jatrogeno tokom
medicinskih procedura (amniocenteza). Svakako da je ascendenti put infekcije najčešći i one
su u preko 50% slučajeva početni događaj kod PP udruženog sa infekcijom, a ovaj procenat je
veći što je gestaciona starost manja [91]. Pretpostavlja se da postoji 5 faza procesa koji dovodi
do nastanak IUI. U prvoj fazi dolazi do poremećaja vaginalne flore, naseljavanja pojedinačnih
mikroorganizama i/ili polimikrobne infekcije u kome normalna preodominanta laktobacilarna
flora biva zamenjena patološkom florom (BV). Iz vagine ascedentnim putem preko grlića
mikroorganizmi dolaze do decidue i horiona, odakle infekcija može da prodre u fetalne sudove
ili kroz amnion u amnionsku šupljinu i dovede do intraamnionske infekcije. Iz amnionske
tečnosti, na različite načine, bakterije mogu da dospeju u plod [92]. Još jedan mogući put koji
može dovesti do fetalne sepse je širenje infekcije lokalizovane u parijetalnoj i bazalnoj decidui
odakle može direktno (preko horionskih čupica) dopreti u krvotok ploda. Bez obzira na put,
svaki prodor mikroorganizama dovodi do imunskog odgovora majke i/ili fetusa. Kada patogen
savlada fizičko-hemijske barijere na sluznicama, pokreće se više različitih signalnih puteva koji
aktivišu druge komponente imunske odbrambene mreže i sledstvenog akutnog zapaljenjskog
odgovora. Dolazi do povećanja propustljivosti krvnih sudova, ekstravazacije proteina akutne
faze i proteina komplementa i influksa velikog broja PMN. Svi ovi procesi odigravaju se
kontrolisano, a jedan od najznačajnijih kontrolnih mehanizama su različiti citokini koje
produkuju kako epitelne ćelije, PMN i druge ćelije, a dok ovi procesi napreduju, makrofagi i
dendritične ćelije prezentuju patogen T ćelijama, pokrećući tako i adaptivni imunski odgovor
[93]. Ukratko, uloga urođenog imunskog sistema je da brzo reaguje na patogen, započne
zapaljenjski i odgovor adaptivnog imunskog sistem. Najvažniju ulogu u aktivaciji urođenog
17
imunskog sistema imaju receptori koji prepoznaju uzorke (RPU) (engl. pattern-recognition
receptors, ) [94]. Ove receptore iskazuju različite ćelije i predstavljaju prvi korak u aktivaciji
urođenog imunskog sistema [95]. Na osnovu funkcije i lokalizacije mogu da se podele u tri
grupe: solubilni RPU koji uključuju proteine akutne faze kao što je C reaktivni protein koji
deluje kao opsonin i pomaže da se patogen eliminiše u saradnji sa sistemom komplementa i
fagocitima, transmembranski RPU (receptori za uzbunjivanje, TLR, receptori čistači (engl.
scavenger receptors,SR) i lecitin tipa C), i unutarćelijski RPU kao što su NOD1 i NOD2 koji
prepoznaju unutarćelijske patogene [96-98]. TLR su odgovorni za prepoznavanje molekulskih
obrazaca patogena (engl. pathogen-associated molecular patterns, PAMP) i danas je poznato
11 članova porodice TLR koji su specifični za različite komponente mikroorganizama i/ili
njihovih toksina [99-101]. RPU prepoznaju i druge opasne signale u oštećenim tkivima,
takozvane molekularne obrasce oštećenog tkiva (engl. damage associated molecular patterns,
DAMP) [102, 103]. Ova oštećenja mogu biti prouzrokovana različitim unutrašnjim fizičkim
faktorima, npr. blizanačke trudnoće ili polihidroamnion, odnosno kada je prerastegnutost
uterusa pokretač PP. S druge strane su činioci iz spoljašnje sredine: različita hemijska jedinjenja
i toksini. Ovakvi produkti mogu nastati u stanju hipoksije u vezi sa trombozama ili krvarenjem,
što takođe ukazuje da bi ovi receptori mogli imati značajnu ulogu u PP izazvanim decidualnim
hemoragijam i trombozama [104].
Slika 1.3: Inflamatorni biomarker ii etiopatogeneza preveremenog porođaja
18
Neodgovarajući imunski odgovor, bilo u smislu prekomernog ili nedovoljnog i aktivacija
sistema komplementa (alergijski fenomeni) takođe mogu dovesti do stvaranja produkata koji
mogu da aktivišu DAMP i pokrenu zapaljenjski proces. Dakle DAMP bi mogli da posmatramo
kao receptore koji igraju veoma važnu ulogu u započinjanju “sterilnog” zapaljenjskog odgovora
koji bi mogao da bude od značaja u etiopatogenezi PP koji nije udružen sa infekcijom [105108]. Zapaljenjski biomarker od značaja u etiopatogenezi PP udruženog sa infekcijom prikazani
su na Slici 1-3. Iz slike je jasano da većina patogena potiče iz vaginalne flore (ascedntni put
najčešći), TLR2 and TLR4 vežu se za komponente Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija
ali i drugih endogenih liganda i najznačajniji su faktor u inicijaciji imunskog odgovora, a svaki
član porodice TLR prepoznaje specifične patogene komponente. Aktivacija TLR dovodi do
signalne kaskade u kojoj dolazi do produkcije proinflamatornih citokina i aktivacije ne samo
urođenog nego i stečenog imunskog sistema. Različiti mikroorganizmi (bakterije, viruse,
gljivice, paraziti) i njihove komponente i produkti (liposaharidi i peptidoglikani) aktiviraju
TLR, koji onda pokreće transkripcione faktore od kojih je najvažniji NF-κB, što rezultira u
pojačanoj ekspresiji proinflamatornih citokina (IL-1β, IL-6, IL-8, i TNF-α) u tkivima majke,
fetusa i placente, koji dovode do pojačane sinteze PG i različitih matriksnih metaloproteinaza
(MMP), što sve može dovesti do PP. Ova zbivanja suštinski objašnjavaju etiopatogenezu PP
udruženu sa infekcijom. Alarmini, kao hronični inflamatorni biomarkeri verovatno igraju važnu
ulogu u zbivanjima u kojima je PP izazavan drugim ili nepoznatim etiološkim faktorima.
Vezivanje TLR dovod do aktivacije intraćelijskih signalanih puteva, aktivacije transkripcionih
faktora koji pokreći ekspresiju seta gena umešanih u imunski odgovor i zapaljenje, a pre svega
transkripcionog faktoraNF-κB [109]. On je uključen u regulisanje transkripcije brojnih gena
ključnih za zapaljenje i imunski odgovor. In vitro studije su pokazale važnu ulogu NF-κB u
regulaciji nekoliko zapaljenjskih gena povezanih sa porođajem [110-112]. Ovi geni
prvenstveno regulišu proizvodnju zapaljenjskih citokina i hemokina. Pored toga oni regulišu
produkciju enzima cikoloksigenaze-2 pod čijim se dejstvom iz arahidonske kiseline sintetišu
prostaglandini, koji su ključni medijatori u otpočinjanja porođaja [113-116]. Njihova ključna
uloga proizilazi iz činjenice da prostaglandini pokreću kontraktilnost miometrijuma, dovode do
promena i sazrevanja grlića materice, kao i aktivacije decidue i plodovih ovojaka. U stanjima
blokade NF-κB smanjena je ekspersija cikoloksigenaze-2, produkcija prostaglandina u
amnionskim i miometrijalnim ćelijama i aktivnost MMP u amnionskom i horiodecidualnom
tkivu [117,118]. NF-κB može biti aktivisan proinflamatornim citokinima kao što su TNF-α, IL1β i drugim što može dovesti do produženog intrauterinog zapaljenjskog odgovora [119-121].
Važno je napomenuti da stvaranje ovakvog proinflamatornog intrauterinog miljea ima još jednu
19
važnu posledicu, a to je da je u ovakvim uslovima značajno slabiji odgovor na antiinflamatorne
učinke progesterona [122-125]. Progesteron je, kao što je poznato, hormon odgovoran za
održavanje materice u stanju mirovanja, a kod mnogih vrsta pred sam porođaj detektuje se
značajan pad u koncentracijama progesterona [126]. Ovakav pad progesterona u serumu se ne
detektuje kod ljudi, ali se veruje da dolazi do takozvanog "funkcionalnog smanjenja
progesterona" odnosno izmena u koncentracijama različitih progesteronskih receptora i
njegovog lokalnog metabolizma, kao i pomenutog negativnog uticaja koji može imati
zapaljenjski proces, odnosno aktivacija NF-κB na progesteronske receptore [127-129]. In vitro
studije na ćelijama humanog miometrijuma pokazale su da je jedan od najvažnijih mehanizama
preko kojih progesteron ostvaruje svoju antiinflamatornu ulogu inhibicija NF-κB [130].
Ukratko, TLR prepozna mikroorganizam, aktivira transkripcioni faktor NF-κB koji
dovodi do sinteze proinflamatornih citokina (IL-1β, TNF-α, IL-8) i PG koji pokreću
zapaljenjsku kaskadu koja dovodi do PP. Pored toga TLR aktiviše ćelije koje prerađuju i
predstavljaju antigene, pojačava njihovu ekspresiju MHC i kostimulatornih molekula (CD40,
CD89, CD86 i CD70) sa krajnim ciljem da dovede do aktivacije i diferencijacije specifičnih
limfocita T. Poznato je da u drugoj fazi menstrualnog ciklusa, pod uticajem progesterona, dolazi
do značajnog smanjenja odnosa Th1/Th2 ćelija u pripremi za implantaciju oplođene jajne ćelije.
U ranoj trudnoći predominatan je Th2 tip imunskog odgovora što dovodi do pojačane
produkcije antiiinflamatornih citokina (IL-4, IL-6, IL-13) koji indukuju oslobađanje humanog
horionskog gonadotropina iz trofoblasta čija je uloga da spreči apoptozu žutog tela i stimuliše
proizvodnju progesterona u jajnicima. Progesteron dovodi do stimulacije trofoblastne sekrecije
Th2 citokina i uspostavljanja pozitivne povratne sprege, koja povoljno deluje na trudnoću [131].
Zapaljenje uzrokovano infekcijom dovešće do proizvodnje proinflamatornih citokina i nastanka
sredine koji vodi trudnoću u neželjen ishod. Trudnoća se smatra klasičnim primerom stanja u
kome dolazi do prevlade Th2 tipa imunskog odgovora. Ovakav zaključak proizilazi iz
eksperimenata na životinjama i bazira se na blagotvornom uticaju Th2 citokina na fetoplacentni rast i štetnom efektu Th1 citokina kao što su IFN-γ i TNF-α tokom istog perioda
gestacije [132, 133]. Mnogobrojni su primeri i za ostale citokine koji jasno ukazuju da je u
različitim periodima trudnoće optimalna (fiziološka) ravnoteža Th1/Th2 tipa imunskog
odgovora bitan uslov za održavanje i napredovanje trudnoće [134, 135]. Najnovija ispitivanja
ukazuju da su ovakva shvatanja pojednostavljena, jer neke novootkrivene subpopulacije
pomoćničkih ćelija (Th17, Th9, TREGs) svakako imaju značajnu, ali za sada nedovoljno
istraženu i definisanu, ulogu u ovim zbivanjima. Citokini imaju odlučujuću ulogu u procesu
diferencijacije naivnih ćelija [136]. Tako su IL-12 i IL-18 ključni citokini diferencijaciju Th1,
20
odnosno u promociji ćelijskog imunskog odgovora koji je najznačajniji odbrani od bakterija,
intracelularnih parazita, gljivica i nekih virusa [137]. Pomenuti mikroorganizmi ujedno
predstavljaju glavne induktore sinteze IL-12 u infekciji. IFN-γ je najmoćniji stimulator
produkcije IL-12 koji povratno stimuliše proizvodnju IFN-γ. S druge strane, inhibitori
produkcije IL-12 su IL-4, IL-10, TGF-β i IL-13. U Th1 subpopulaciji limfocita IL-12 indukuje
sintezu IFN-γ, IL-2 i TNF-. Pozitivni povratna sprega između IL-12 i IFN-γ je jedan od
mehanizama koji može da dovede do prekomernog zapaljenjskog odgovora i ima značajnu
ulogu u etiopatogenezi autoimunskih bolesti. Kao što je naglašeno, Th2 citokini su inhibitori
produkcije IL-12, ali u određenim okolnostima mogu dovesti i do povećanja koncentracije ovog
citokina, što govori da je proizvodnja IL-12 različito regulisana na različitim krakovima
imunskog odgovora. Iako IL-12 može da preusmeri Th2 u Th1 tip imunskog odgovora, IL-4 je
dominatan u odnosu na njega i u uslovima značajnih koncentracija oba citokina diferencijacija
se odvija pravcu Th2 tipa imunskog odgovora. Fiziološki izvor IL-12, in vivo, primarno su
antigen prezentirajuće ćelije, makrofagi, PMN, dendritične ćelije, keratinociti i B-ćelije [138].
Drugi važan član proinflamatornih citokina je IFN-γ koga proizvode aktivisane NK-ćelije
makrofagi i B-ćelije, dok Th2 subpopulacija ne luči IFN-γ. Antiinflamatorni citokini kao što su
IL-4, IL-10 i TGF-β su inhibitori produkcije IFN-γ. Moglo bi se reći da je osnovna uloga IFNγ imunomodulatorna jer on stimuliše aktivaciju PMN, fagocitozu, reguliše produkciju drugih
proinflanatornih i antiinflamatornih citokina kao i proces apoptoze [139-141]. IFN-γ ima važnu
ulogu u odbrani od intracelularnih patogena i, kao što smo rekli, regulaciji Th1 tipa imunskog
odgovora [142-144]. Dakle subpopulacija Th1 luči uglavnom proinflamatorne citokine kao što
su INF-γ, TNF- α, IL-12, IL-1, IL-2, IL-1β i IL-18. Diferencijacija u Th2 smeru dešava se u
prisustvu IL-4 i IL-2 i ova subpopulacija luči IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IL-6 i IL-8. Slično, Th17
efektorne ćelije mogu dovesti do zapaljenja i autoimunih bolesti. Funkcionalna uloga Th17
ćelija je u odbrani domaćina od vanćelijskih patogena tako što dovodi do nakupljanja PMN i
makrofaga u inficiranim tkivima, a poremećaji u regulaciji ovih ćelija imaju značajnu ulogu u
etiopatogenezi mnogih autoimunskih i zapaljenjskih bolesti. Produkcija Th-17 citokina, IL17A, regulisana je uglavnom IL-23, ali i IL-6, IL-21 i TGF-β. Th17 ćelije sintetizuju IL-17A,
IL-17F, GM-CSF, IL-6, TNF-α, IL-21 i IL-22. Ova populacija imala bi značaja kod hroničnih
zapaljenjskih bolesti, a kako neki autori smatraju da je PP hronični zapaljenjski događaj, ova
subpopulacija bi mogla biti od posebnog značaja [36].
21
Nedavno je otkrivena i Th9 subpopulacija T-pomoćničkih ćelija. Razvijaju se nezavisno
od Th1, Th2 i Th17 ćelijske linije. TGF-, koji je od presudne važnosti za diferencijaciju
regulatornih ćelija T (TREGs) i Th17 ćelije indukuju usmeravanje Th2 u Th9 ćelije koje se
karaterišu lučenjem IL-9. Ćelije Th9 mogu da nastanu i diferencijacijom iz naivnih CD4+ T
ćelija pod uticajem TGF- i IL-4. IL-9 je član familije citokina koja uključuje IL-2, IL-4, IL-7,
IL-15 i IL-21. IL-22 je član IL-10 familije citokina, i primarno ga luče Th17 ćelije. IL-23 i IL6 mogu direktno da stimulišu naivne T ćelije da luče IL-22. Pored IL-9, ove ćelije (Th9)
produkuju i IL-10, koji je najjači antiinflamatorni citokin koji inhibira produkciju
proinflamatornih Th1 citokina, što bi teoretski takođe moglo biti od velikog značaja i uticaja na
etiopatogenezu PP.
Slika 1.4: Shematski prikaz TH1/TH2/TH9/TH17 imunskog odgovora
Danas postoji veliki broj podataka koji ukazuju da je terminski porođaj udružen sa aktivacijom
zapaljenja u fetalnim mebranama, decidui i grliću i da citokini i drugi zapaljenjski medijatori
igraju ključnu ulogu u humanom porođaju.
Najvažniju ulogu u PP udruženim sa infekcijom imaju IL-1 i TNF-α [145-147].
Pokazano je da većina proinflamatornih citokina dovodi do manjeg ili većeg porasta sinteze
PG, kako u plodovim ovojcima tako i decidui i miometrijumu [148-150]. Humana decidua u
odgovoru na bakterijske produkte produkuje ove citokine [151-154]. Koncentracije IL-1, TNF i IL-6 u amnionskoj tečnosti su povišene kod žena sa PP i IUI i dobro korelišu sa nalazom
histološkog horioamnionitisa i kulture. Mnogi eksperimenti na životinjama pokazali su da ovi
citokini mogu da indukuju PP [155, 156]. TNF- stimuliše produkciju MMP i njegova primena
22
dovodi do sazrevanja grlića materice, a oba pojačavaju ekspresiju IL-8 na decidualnim ćelijama
tako da ovaj hemokin ima značajnu ulogu u etiopatogenetskim zbivanjima vezanim za normalan
porođaj, kao i PP udružen sa infekcijom [157-159]. Od posebnog značaja je uloga IL-8 u
promenama na grliću materice koje i u normalnom i patološkom porođaju verovatno prethode
pojačanoj kontraktilnosti uterusa, a koje suštinski takođe imaju karakteristike zapaljenjskog
procesa [160]. Novija ispitivanja pokazuju da su u ova molekularna zbivanja umešani i drugi
proinflamatorni i antiinflamatorni citokini kao i drugi medijatori zapaljenja samo što je njihova
uloga mnogo manje ispitana. Od citokina pomenućemo samo najvažnije: IL-6, IL-10, IL-16,
IL-18, CSF, MMIF i RANTES. Dakle, na osnovu podataka kojima danas raspolažemo, IL-1,
TNF-, IL-6 i IL-8 igraju najvažniju ulogu u etiopatogenetskim zbivanjima vezanim za PP
udružen sa infekcijom
Međutim, ispitivanja su pokazala da „isključivanje“ gena za određene citokine, ne
dovodi do „zaustavljanja“ bioloških efekata na koje oni značajno utiču što potvrđuje da su u
pravu oni koji ukazuju na značaj sadejstva ovih zapaljenjskih medijatora, odnosno mreže
citokina (MC). U ovakvoj mreži svaki član povezan sa drugim članovima uz mogućnost
postojanja brojnih signala koji regulišu međusobne interakcije, a sve to u jednom dinamičnom
sistemu, promenljivom i vremenskom, kvantitativnom i kvalitativnom smislu, koji opet ne
funkcioniše izdvojeno nego je kako pod uticajem lokalnih, tako i pod uticajem sistemskih
neuroendokrinih, imunskih, genetskih i epigenetskih mehanizama, i naravno bakterija i
bakterijskih zajednica. Znajući ovo ne čudi da i pored velikog broja ispitivanih citokina nijedan
od njih se nije izborio za „status“ koji bi preporučio njegovu primenu u kliničkoj praksi u
prevenciji ili predviđanju zbivanja vezanih za infekcije i PP.
1.4
VAGINALNE INFEKCIJE
U najvećem broju slučajeva početni događaj kod PP udruženog sa infekcijom predstavlja
promena normalne u patološku vaginalnu floru. Međutim, problem je u tome što mi danas ne
znamo pouzdano šta je to “normalana”, a šta “patološka” vaginalna mikroflora. Istorijski
gledano, prvi uvid u sastav vaginalne mikroflore omogućio je mikroskop, i još 1892. god.
profesor Albert Döderlein je podelio ispitivane trudnice u dve grupe, one sa normalnom
vaginalnom florom u kojoj dominiraju vaginalni bacili, i one sa patološkom vaginalnom florom
koja sadrži brojne druge mikroorganizme. Schroder 1920. god. govori o tri vrste vaginalnog
sekreta u zavisnosti od količine sekreta, odnosno stepena vaginalne čistoće. On je pokazao da
je prva grupa najmanje patogena i da sadrži pretežno Döderleinove bacile, druga grupa ima
23
mešanu floru sa malim brojem laktobacila, i treća grupa sa mešanom laktobacilarnom florom i
potpuno odsutnim laktobacilima. Harris i Brown su 1928. godine objavili rad u kome su našli
da 26 od 30 zdravih žena posle porođaja ima anaerobe kao deo vaginalne mikroflore, a studija
Weinsteina iz 1938. pokazala je da 93% trudnih i 90% žena koje nisu trudne imaju anaerobe u
vaginalnoj flori i pretpostavio da oni imaju najveći značaj i karakterišu normalnu floru vagine.
Naravno, nedostatak adekvatnih mikrobiloških metoda i nemogućnost da se kulturom preciznije
utvrdi i prisustvo obligatornih anaeroba imala je za posledicu i pogrešne zaključke. Tek 1950.
god. Weaver i sar. [161] ponovo ukazuju na značaj odsustva laktobacila i prisustva anaeroba
kod takozvanog nespecifičnog vaginitisa. Kada su Gardner i Dukes 1955. godine pokazali jasnu
udruženost Gardnerelle vaginalis i nespecifičnog vaginitisa, zaključeno je da je Gardnerella
vaginalis uzročnik nespecifičnog vaginitisa [162]. Iako pogrešan, ovaj zaključak je narednih 25
godina bio glavni razlog što je ignorisana uloga i značaj drugih mikroorganizama u nastanku
nespecifičnog vaginitisa. Konfuzija koja je vladala oko etiologije dovela je do toga da entitet
danas poznat kao bakterijska vaginoza (BV) dobije veliki broj imena. Neki autori smatraju da
bi vaginalna bakterioza bio lingvistički adekvatniji termin. Tek je napretkom mirobioloških
metoda sedamdestih godina prošlog veka uneseno više svetla, a najviše naravno razvoju tehnika
kultura kao i drugih metoda. Međutim, danas znamo da preko 99% postojećih mikroorganizama
ne možemo da kultivišemo, o čemu ćemo kasnije više govoriti. I danas mnogi kliničari
mikrobiološki nalaz tumače tako što određenu vrstu bakterija klasifikuje kao normalnu
(saprofitnu), a druge kao patogene, poštujući tako jedan od Kochovih postulata. Tako je Koch
ustanovio da za uzročnika neke zarazne bolesti može da se smatra samo onaj mikroorganizam
koji je kod bolesnika izolovan u čistoj kulturi, koji, inokulisan eksperimentalnim životinjama,
kod njih izaziva isto oboljenje kao i kod bolesnika kod koga je izolovan, i koji se iz tako
zaražene životinje opet može dobiti u čistoj kulturi. Ovako rigorozni kriterijumi imali su kao
posledicu usredsređenost na patogene bakterije, a samo sporadično na one koje pripadaju
nepatogenoj, odnosno normalnoj flori. Često u praksi kliničar i mikrobilog pokušavaju da
izoluju određenu vrstu bakterija da bi objasnili kliničke simptome bolesti i postavili dijagnozu,
ali su neretko razočarani izolacijom samo normalne flore. Ovakav isključiv stav previđa
postojanje potencijalne patogenosti kombinacije različitih mikroorganizama i između ostalog
zanemaruje i ključnu ulogu faktora domaćina i njegove imunokompetetntnosti. Najbolji primer
za to je G. vaginalis koja je jedan od najvažnijih mikroorganizama u etiopatogenezi BV. I ranija
ispitivanja (kultura) pokazala su da kod velikog broja žena koje nemaju BV, možemo izolovati
ovaj mikrorganizam, a najnovije molekularno biološke studije taj »veliki broj žena« definišu sa
preko 50-90% prisustva različitih sojeva ovog mikroorganizma [163, 164]. I studije
24
mikrobioma vagine su pokazale da su G. vaginalis i L.iners dva najčešće izolovana
mikroorganizma iz vagine [165, 166].
U razlikovanju normalne od patološke flore trebalo bi razlikovati mikroorganizme koji
su stalno prisutni, one koji su povremeno prisutni i prolazno naseljavaju određene regije od
onih koji su patogeni. To je i jedan od ciljeva projekta humanog mikrobioma. Najveći problem
u definisanju vaginalne flore svakako predstavlja činjenica da je to veoma dinamičan ekosistem
koji u kratkom vremenu može da se bitno promeni, pod uticajem mnogobrojnih faktora. Uvek
treba imati u vidu činjenicu da vaginalni bris koji uzimamo, bilo za preparat po Gramu bilo za
molekularno biološka ispitivanja, predstavlja trenutni odraz stanja vaginalne mikroflore.
Mnogobrojni faktori kao što su stres, godine, faze ciklusa, hormonski statusa, seksualne navika,
upotreba kontraceptiva ili drugih lekova mogu bitno da utiču na sastav i fluktuacije u vaginalnoj
mikroflori. Na ove činjenice ukazano je u longitudinalnim studijama (tada ograničenim na
analizu uzoraka kulturom) pri čemu je kod 78% žena došlo da značajnih promena u vaginalnoj
flori, kao da su te promene vezane za mesečni ciklus [167, 168]. Ove rezultate potvrdila su i
najnovija molekularnobiološka ispitivanja [169].
Danas, posle više od jednog veka, mogli bismo reći da je podela koju je uspostavio
Döderlein i dalje važeća i aktuelna. Da je to tako najbolje ukazuje činjenica da i danas u
najvećem broju studija koje se bave ispitivanjem vaginalne flore Nugentovi kriterijumi
predstavljaju zlatni standard, a po ovim kriterijumima se žene dele u iste te dve grupe, samo što
ovu sa „brojnim drugim mikroorganizmima“ definišemo kao BV, a imamo i treću grupu koja
je po Nugentu intermedijarna, odnosno predstavlja „nešto između“ ova dva stanja.
Shvatajući koliki značaj imaju mikroorganizami, Američki nacionalni institut za
zdravlje je 2008. godine pokrenuo veliki projekat određivanja ljudskog mikrobioma čiji je cilj
otkriti i definisati mikrobne zajednice koje se nalaze na različitim delovima ljudskog tela
(vagina, usna šupljina, creva, koža.) i otkriti kako promene u mikrobiomu utiču na ljudsko
zdravlje [170, 171]. Mikrobiom je pojam koji obuhvata sve mikroorganizme, njihov celokupan
genom, te međusobne interakcije mikroorganizama i domaćina. Kako čovek ima 10 puta više
mikroorganizama nego ćelija, jasno je da se radi o veoma kompleksnim zajednicama koje mogu
značajno uticati na zdravlje i bolest kod čoveka. Naše trenutno razumevanje interakcija između
mikroba i domaćina je veoma oskudno jer danas znamo da se većina mikrobioloških vrsta ne
može kultivisati u laboratoriji. Ovi autohtoni mikroorganizmi postoje i opstaju u zajedničkoj,
međusobnoj vezi sa svojim domaćinom, iako su neki od njih oportunistički patogeni koji mogu
da izazovu i hronične infekcije, a ponekad i bolesti opasne po život. Veruje se da ove zajednice
25
mikroba predstavljaju prvu liniju odbrane od infekcije konkurentnim, stranim, invazivnim
mikroorganizmima koji mogu da izazovu bolesti [172].
1.5
MIKROBIOM VAGINE
Među odbrambenim mehanizmima, jedan od najvažnijih je svakako sastav mikrobiološke
zajednice koja kolonizuje vaginu. Mikroorganizmi koji naseljavaju vaginu predstavljaju fino
uravnotežen ekosistem u kome vaginalna sredina kontroliše kolonizaciju bakterija, a mikrobioti
onda kontrolišu vaginalnu sredinu [173]. Ova dinamična zajednica mikroorganizama ima
ključnu ulogu u sprečavanju kolonizacije vagine neželjenim mikroorganizmima, a homeostaza
je rezultat obostrano korisnih interakcija između domaćina i velikog broja različitih
mikroorganizama koja, opet, može biti poremećena mnogobrojnim unutrašnjim i spoljašnjim
faktorima[174]. Ovo su ujedno i glavni razlozi što ne možemo preciznije da definišemo
pojmove i jasno povučemo granicu između onoga što bi definisali kao fiziološku ili patološku
vaginalnu floru. Veći deo našeg znanja o sastavu vaginalne mikrobiološke zajednice potiče iz
kvalitativnih i kvantitativnih studija, koje u metodologiji koriste kulturu, a ovakvim pristupom
može da se izoluje samo manji broj (3-5%) od sveukupnog broja mikroorganizama koji se
nalaze u vagini [175-177]. Razvoj i uvođenje novih molekularnobioloških metoda uneli su
pravu revoluciju u definisanju vaginalne mikroflore, otkrivanju novih bakterija, kao i
obezbeđivanju novih informacija o filogenetskoj raznovrsnosti mikroorganizama koji
sačinjavaju vaginalnu mikrofloru. Jedan od ciljeva projekta vaginalnog mikrobioma bio je da
se utvrdi da li u vagini većine zdravih premenopauzalnih žena postoji jezgro (eng. core
microbiom) vaginalnog mikrobioma, i da li i kako promene u tom jezgru mikrobioma koreliraju
sa zdravljem ili bolesti. Rezultati dosadašnjih molekularno bioloških studija sugerišu da u
vagini žene ne postoji takvo jezgro, nego bi pre mogli govoriti o više jezgara [178, 179].
Ova jezgra su najbolje definisali i podelili u 5 grupa Ravel i sar [180]. U svom istraživanju
asimptomatskih žena 4 najveće etnički grupe u SAD utvrdili su 5 glavnih bakterijskih zajednica:
u četiri od njih dominira jedna ili više vrsta roda Lactobacillus (1.grupa: L. crispatus; 2. grupa:
L. Gasseri,3. grupa: L. iners; i 4.grupa: L. jensenii ); dok u5. grupi nisu dominatni laktobacili,
nego je čini raznolika zajednica bakterija sa prevagom striktnih anaeroba kao što su Prevotella,
Megasphaera, Atopobium, Finegoldia, Peptoniphilus, Eggerthella i Mobiluncus, a ovu grupu
čini oko jedne četvrtine ispitanica. Otkriće Ravela i sar. [180].da laktobacili nisu dominantna
vrsta kod 27% ispitanica važan je i zanimljiv podatak pošto su one bile bez ikakvih simptoma,
a sastav vaginalne flore bio je sličan onome kod žena sa klinički ili mikroskopski
26
dijagnostikovanom BV. Ova studija je pokazala da su kod najvećeg broja belkinja i azijatkinja
predominantni laktobacili, dok je mali broj laktobacila znatno češći kod crnkinja i
latinoameričke populacije, koje između ostalog karakteriše i povišen pH vagine preko 4,5.
Takođe je pokazano da, pored laktobacila, mlečnu kiselinu proizvode i Streptococcus,
Megasphaera, Leptorichia i Atopobium i da su ove bakterije prisutne kod gotovo svih
pacijentkinja, tako da je stvaranje mlečne kiseline često očuvano uprkos razlikama u sastavu
mikroorganizama [181]. Dakle, raniji postulat po kome prevaga laktobacila i vaginalni pH ispod
4,5 znače zdravu vaginalnu floru po Ravelu i sar. ne može se primeniti bar na četvrtinu, odnosno
jednu polovinu (pH≥4,5) žena [180]. Kako laktobacili predstavljaju osnov Nugentovog zbira
za zdravo, a vaginalni pH je jedan od četiri Amselova klinička znaka, postavlja se pitanje koliko
su ovi dijagnostički kriterijumi verodostojni. Pri tome su Nugentovi kriterijumi “zlatni
standard” u laboratoriji i istraživačkim radovima (i u projektu mikrobioma vagine), a Amselovi
kriterijumi predstavljaju klinički “zlatni standard” u dijagnozi BV. Opisani nalazi naročito su
važni jer objašnjavaju prilično kontradiktorne podatke koji se odnose na BV i PP. Tako nemamo
jasne odgovore na pitanja kao što su: 1) da li je potreban skrining na BV u trudnoći? 2) da li,
kada i kako lečiti BV u trudnoći? 3) da li lečenje antibioticima dovodi do smanjenja broja PP?
Ako se složimo sa hipotezama Ravela i sar. [180] u prošlosti smo ne mali broj zdravih žena
lečili antibioticima, i obrnuto. Jasno je zbog čega se, između ostalog, razlikuju rezultati
dosadašnjih ispitivanja. Ova saznanja u pitanje dovode i dosadašnje epidemiološke studija koje
se odnose na učestalost BV [182]. Ako, dakle, znamo da je određen broj pacijentkinja bez
laktobacila i bez BV lečen, najčešće metronidazolom, onda se moramo upitati i da li je ova
terapija bila štetna? Naime, Atopobim vaginae , mikroorganizam za koji je nedavno pokazano
da ima značajnu ulogu u etiopatogenezi BV, rezistentan je na metronidazol [183]. Dakle,
lečenje metronidazolom može da dovede do promene vaginalne mikroflore i stvaranja boljih
uslova za rast i razvoj ovog mikroorganizma nego što je to bilo pre terapije i tako, možda,
dovede do većeg rizika za pokretanje PP. Ova i mnoga druga pitanja koja indirektno otvara
Ravelova [180] studija, jasno ukazuju da su potrebna nova istraživanja koja će u svojoj
metodologiji, pored kulture i mikroskopskog pregleda, imati i nove molekularnobiološke
tehnike. Ovakav pristup pokazaće nam da li će mikroskopski pregled nativnog preparata i
preparata po Gramu, zajedno sa kulturom otići u istoriju, i da li će primena novih metoda biti
neophodna za svakodnevnu kliničku praksu, podrazumevajući individualan dijagnostički i
terapijski pristup u prevenciji i lečenju poremećene vaginalne flore i štetnih posledica do kojih
ona može dovesti. Svakako da najveći značaj u onome što zovemo poremećaj vaginalne flore
ima BV.
27
BV je poremećaj vaginalnog ekosistema u kome normalno predominantnu
laktobacilarnu mikrofloru zamenjuju brojne anaerobne bakterije (G.vaginalis, Atopobium,
Prevotella, Megasphaera, Eggerthella, Mobiluncus,M. hominis, Porphyromonas, Bacteroides
spp., Finegoldia, Peptoniphilus, Peptostreptococcus spp., i druge koke) pri čemu ostaje nejasno
da li je smanjenje broja laktobacila ili povećanje broja anaeroba početni događaj u ovoj
tranziciji [184]. Treba napomenuti da u ove bakterije spada i čitav niz mikroorganizama koji
još nisu kultivisani, a koji se u literature imenuju sa bakterijskom vaginozom udružena flora“
BVAB1, BVAB2 i BVAB3 (bacterial vaginosis assocated bacteria) pri čemu treba da znamo
da se ovaj naziv često koristi za sve mikroorganizme udružene sa BV (BVAB) što ćemo i mi
najčešće koristiti [185]. Masivan porast BVAB udružen je sa porastom protelitičkih
karboksilnih enzima koji dovode do smanjenja i pretvaranja vaginalnih peptida u amine
(putrescina, kadaverina i tiramina) koji u sa porastom pH postaju isparljivi i uzrokuju neprijatan
miris [186]. Porast amina dovodi do pojačane transudacije i ćelijske eksfolijacije uzrokujući
tipičnu homogenu, mlečno beličastu sekreciju. U uslovima povišenog pH, G. vaginalis mnogo
lakše adherira za epitelne ćelije i tako obrazuje patognomonične ćelije poznate pod engleskim
nazivom clue cells. (CC). Pored toga, amini obezbeđuju povoljnu sredinu za razvoj nekih
mikroorganizama, npr. M. hominis. Učestalost BV u opštoj populaciji kreće se od 10 do 50%
[187], a u populaciji trudnica od 12 do 50%, u zavisnosti od ispitivane populacije [188]. BV je
udružena sa gubitkom trudnoće u prvom tromesečju [189, 190], 2-7 puta većim rizikom od PP,
prevremenog prskanja plodovih ovojaka, nastankom horioamnionitisa, manjom porođajnom
težinomi nastankom postpartalnog endometritisa [191-201]. Neke studije su pokazale da čak
oko 50% žena sa BV nema nikakvih simptoma [202, 203]. Dakle, mogli bismo reći da veći broj
do sada objavljenih studija ukazuje da je BV udružena sa povećanim rizikom za PP, ali
interventne studije u kojima su pacijentkinje sa BV lečene različitim antibioticima nisu
pokazale dobit od toga [204-206]. Nedavna metaanaliza [207] zaključuje da terapija
antibioticima dovodi do eradikacije BV u trudnoći ali da se ukupni rizik od PP ne smanjuje
značajnije, zbog čega neki autori smatraju da za sada nema osnova za skrining i lečenje BV kod
trudnica. Ukoliko se skrining kriterijumi prošire na žene sa patološkom vaginalnom florom
onda se broj PP smanjuje za oko 47% (ograničeno na dve studije). Dakle, danas u svetu ne
postoji opšta saglasnost o potrebi skrininga i lečenja BV u trudnoći, a većina smatra da je
najbolje da odluku o tome donese lekar u odnosu na svaku pacijentkinju pojedinačno. Različiti
genetski, imunski i epigenetski faktori delimično mogu objasniti zašto neke žene sa BV imaju
PP, a druge ne ili zašto je kod nekih terapija efikasna, a kod drugih nije, ili je čak štetna.
Kontradiktorni rezultati dosadašnjih studija posledica su metodoloških problema u dosadašnjim
28
studijama, kao što su značajna heterogenost (etnička) ispitivanih grupa, različite stope PP,
različiti metodološki pristupi u skriningu i lečenju BV. Svakako da je najvažniji metodološki
faktor nedostatak jedinstvenih i preciznijih kriterijuma za dijagnozu BV, kao i drugih stanja,
odnosno “mikroskopski slika” koji nisu BV, ali nisu ni normalna vaginalna flora. U većini ovih
studija dijagnostički kriterijumi za razlikovanje normalne od patološke vaginalne flore suštinski
podrazumevaju mikroskopski pregled preparata bojenog po Gramu i/ili nativnog preparata.
Preparat po Gramu nam otkriva koliko je u uzorku prisutno gram-pozitivnih štapića
(laktobacili),
gram-negativnih
i
gram-varijabilnih
štapića
i
koka
(G.vaginalis,
Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella) i zakrivljenih gram-negativnih štapića
(Mobiluncus) i po njemu su pacijentkinje razvrstane u tri grupe: 1. normalan nalaz;
2.intermedijaran nalaz i 3.pacijentkinje sa BV. Ipak, ovaj zbir po Nugentu uzima u obzir samo
tri bakterijska morfotipa tako da ne može u potpunosti precizno da definiše raznovrsnost i
kompleksnost vaginalne mikroflore i ne uključuje prisustvo drugih bakterijskih i nebakterijskih
tipova ćelija koje mogu da budu od značaja u proceni statusa vaginalne flore [208]. Još važnije,
ova podela dobro definiše pacijentkinje sa normalnim nalazom i BV, ali pacijentkinje sa
intermedijarnim nalazom su u najvećem broju studija nedefinisane u epidemiološkom,
kliničkom i terapijskom pogledu. Da je takav pristup neodgovarajući pokazala su i ispitivanja
u kojima su žene sa intermedijarnom bakterijskom florom i BV imala značajno veće
koncentracije sijalidaza i prolidaza, u odnosu na pacijentkinje sa normalnom florom, kao i da
je u ovoj populaciji pacijentkinja značajno veća učestalost ranog PP [209-212]. Najvažnija
praktična posledica ovakvog pristupa jeste da je preparat po Gramu i danas uglavnom ograničen
na dijagnozu BV, a što je još važnije, ovako se veliki broj žena sa vrlo različitom vaginalnom
florom svrstava u jednu kategoriju. Na primer, L. iners jedan od najčešćih mikroorganizama
izolovanih kod zdravih asimptomatskih žena i G. vaginalis najvažniji mikroorganizam u
etiopatogenezi BV, na preparatu po Gramu vide se kao mali gram-pozitivni ili gram-varijabilni
štapić, zbog čega ih je teško razlikovati, što može imati za posledicu da se određen broj
asimptomatskih, zdravih žena na osnovu Nugentovog zbira, svrsta u grupu sa BV, i obrnuto
[213]. Pošto je najveći broj studija u poslednjih 20 godina kao zlatni standard za dijagnozu BV
koristio zbir po Nugentu, jasno je koliko je samo ova činjenica mogla da utiče na rezultate ovih
studija. Posle Nugentovih kriterijuma najčešće korišćeni kriterijumi za dijagnozu BV bili su oni
po Amselu i sar. koji podrazumevaju pozitivna tri od četiri znaka: 1) homogena sivobeličasta
sekrecija, 2.) vaginalni pH preko 4,5; 3.) pozitivna proba sa 10% KOH i 4.) prisutne CC na
nativnom preparatu [214]. Neki autori koji smatraju da najmanje 20% ćelija na nativnom
preparatu treba da imaju osobine CC da bi se postavila dijagnoza BV, a naše mišljenje je da
29
mali broj laktobacila i odsustvo polimorfonukleara na nativnom preparatu predstavljaju još dva
bitna faktora u dijagnozi BV. Slična Nugentovoj je podela po Isonu i Hayu koja se na zasniva
na zbiru bodova nego na semikvantitativnoj proceni odnosa pomenuta tri bakterijska morfotipa
i pored tri grupe identične Nugentovoj podeli (normalni, intermedijarni i BV), ima još dve
grupe, jedna u kojoj predominiraju koke i druga u kojoj se vide samo epitelne ćelije bez
bakterijskih formi [215]. Nova klasifikacija Verhelst i sar. [216], koja se naziva i klasifikacija
po Claeysu, uvođenjem novih kategorija na bolji način odražava kompleksnost i različitost
vaginalne flore i razlikovanje normalnog od patološkog na preparatu po Gramu. Na osnovu
detaljnog posmatranja preparata bojenih po Gram i u kombinaciji sa specifičnim PCR
tehnologijama i kulture Claeys i sar. su napravili novu podelu u kojoj ima 6 grupa: I grupu
karakteriše prisustvo G+ štapićastih formi, a na osnovu njihovih morfoloških karakteristika ove
pacijentkinje su podeljenje u tri podgrupe. Grupu Ia definisali su kao grupu u kojoj su prisutni
G+, debeli uglavnom kratki štapići za koje je na osnovu kombinovanih tehnika (PCR/kultura)
pokazano da predstavljaju L. crispatus. Grupu Ib karakteriše prisustvo laktobacilarnih formi
koje su manje ili više izduženi i tanji; prisustvo i jednih i drugih formi definisali su kao Grupu
Iab. Posebnu grupu pacijentkinja nazvali su Grupa slična I koju karakteriše prisustvo Gram
pozitivnih oblika, koji mogu biti sasvim mali i kratki, ili izrazito dugački, ali nepravilnih oblika
sa tendencijom grananja, i obično širokim i debelim, zatupastim krajevima (clubbing) i
zakrivljenim ivicama, a često se i neregularne bojenja, raspoređeni tako da često prave oblike
slične kineskom pismu. U ovoj studiji autori su pokazali da je u ovoj grupi diverzitet
bakterijskih vrsta bio bliži grupi II (intermedijarne) nego Grupama Ia, Ib i Iab, gotovo potpun
nedostatak L.crispatusa i značajno veći broj Bifidobacteria u odnosu na druge grupe
Donders i sar. [217] su sačinili kriterijume za dijagnozu aerobnog vaginitisa (AV),
stanja koje se za razliku od BV odlikuje prevagom aeroba, pojavom PMN, dok i jedan i drugi
entitet imaju manje ili više smanjen broj laktobacila i povećan broj sitnih bakterijskih formi.
Pojačana vaginalna sekrecija je žućkasta nehomogena, vaginalni pH je preko 4,5, a neprijatan
miris prisutan je i bez probe sa 10% KOH. Ovakav pristup sa preciznijim i sveobuhvatnijim
dijagnostičkim kriterijumima treba da nam omogući tačnije podatke o učestalosti, kliničkom
značaju i terapijskim opcijama kod stanja koja nisu “čista” BV, ali verovatno jesu neki oblik
patološke vaginalne flore. Verovatno, jer u ovom trenutku ne možemo da isključimo ni
mogućnost da se radi o “različitoj” ali normalnoj flori kod određene grupe pacijentkinja, zbog
čega su neophodna dalja ispitivanja koja bi preciznije definisala ovu kategoriju pacijentkinja.
Ovaj interesantan poremećaj vaginalne flore gotovo i da se ne pominje u najnovijim
molekularnobiološkim ispitivanjima.
30
Tabela 1.1: Kriterijumi za postavljanje dijagnoze aerobnog vaginitisa (NPVS, uvećanje X400 na fazno
kontrastnom mikroskopu)
AV
skor
0
*
LBG
I i IIa
1
IIb
2
III
Broj
PMN
<10/VVP*
>10/VVP*
i <10/EC**
>10/EC**
Procenat
toksičnih
Procenat
Bakterijska flora
PMN
sporadično
<50% PMN
>50% PMN
parabazalnih ćelija
(PBC)
Beznačajan ili
Odsutne ili manje
prisutna citoliza
od 1% PBC
Mali koliformni
Manje od 10% PBC
bacili
Koke ili lanci
VVP: Veliko Vidno Polje X400; Leukociti (polimorfonukleari PMN);
Preko 10% PBC
EC: epitelna ćelija; LBG-
**
laktobacilarna flora
Iz samog naziva jasno je da se ovaj entitet razlikuje od BV u dva suštinska elementa: vrsti
bakterijske flore (aerobi ili anaerobi) i prisustvu odnosno odsustvu elemenata zapaljenjskog
procesa (vaginitis ili vaginoza). Prema dijagnostičkim kriterijumima Dondersa i sar.
pacijentkinje koje bi imale ukupan zbir 1-2 boda imale bi normalan nalaz; zbir 3-4 ukazivao bi
na blage forme AV; zbir od 5-6 bodova predstavljao bi srednje teške forme AV, dok bi
pacijentkinje sa zbirom preko 6 bodova (do maksimalno 10) predstavljale teške oblike AV. U
praksi bi zbir od 8-10 bodova odgovarao onome što je ranije opisivano kao deskvamativni
inflamatorni vaginitis. S obzirom da su PMN jedna od glavnih mikroskopskih karakteristika
ovog poremećaja vaginalne flore, kao i činjenicu da su PMN u centru našeg interesovanja u
ovom ispitivanju smatramo da je korisno ukazati na neke kliničke i mikroskopske aspekte AV.
Mada u svojim radovima Donders i saradnici ukazuju na činjenicu da se parabazalne ćelije kao
i toksični leukociti veoma teško raspoznaju na preparatu bojenom po Gramu, odnosno da je
njihova identifikacija mnogo lakša na nativnom preparatu, mi više nismo sigurni u takve
tvrdnje. Tako posle 20 godina iskustva u gledanju NPVS, na svim vrstama mikroskopa, ovo
ispitivanje nas je po prvi put primoralo da u poslednje dve godine intenzivno gledamo i preparat
bojene po Gramu. Tako, prvo nam nisu jasni razlozi zbog kojih bi lakše prepoznavali
parabazalne ćelije na NPVS nego na preparatu po Gramu. drugo, prisustvo ovih ćelija na
preparatu po Gramu i na NPVS, je veoma retko. Tako od 700 naših pacijentkinja (većina
preparata je još uvek sačuvana) mi imamo svega desetak pacijentkinja sa ovakvim nalazom.
Ove ćelije nalazili smo samo kod pacijentkinja (nismo ih imali među ispitivanim trudnicama)
sa slikom teškog AV, odnosno poremećaja koji je Sobel opisao kao deskvamativni inflamatorni
vaginitis. Tako da bih ja danas prihvatio samo postojanje takvog entiteta, dok je prisustvo
31
ostalih formi AV koje je opisao Donders, u najmanju ruku vrlo diskutabilno. Naime svoj
laktobacilarne grupe (LBG) autor definiše na sledeći način: Laktobacilarnu grupu I (LBG I)
karakteriše prisustvo velikog broja laktobacila različite veličine i potpuno odsutnim ili vrlo
malim brojem sitnih bakterijskih formi (SBF); LBG IIa čine pacijentkinje kod kojih su LB
dominantna bakterijska flora, ali su pomešani sa većim brojem SBF nego u prethodnoj grupi;
U LBG IIb broj SBF je podjednak ili veći od broja LB; LBG III karakteriše predominacija SBF
uz mali broj ili potpuno odsustvo LB, a ovakav nalaz ima suštinski iste karakteristike kao nalaz
pacijentkinja sa BV, izuzev što su kod AV prisutni PMN. Ovakvu podelu odnosa LB i SBF
smatramo svakako jednom od najboljih, preciznije podelom koja na najbolji način odražava
odnos LB i SBF. Ova podela je na neki način inkorporisana u našu metodologiju gledanja
NPVS, koja se suštinski i zasniva na odnosu broja LB i SBF, tako da smo pacijentkinje sa
Dondersovim nalazom LBG I i LBG IIa uvek svrstavali u normalne, bez obzira na rezultat pH
ili KOH test, kod pacijentkinja koje su imale Dondersovu grupu LBG IIb postavljali smo
dijagnozu normalnog nalaza ukoliko su oba testa bila negativna, a dijagnozu BV ukoliko je
jedan od dva testa bio pozitivan. Dondersova podela je na kraju bila i osnovni poticaj da u
ovome ispitivanju prisustvo cllue cels ne smatramo „obaveznim“ mikroskopskim parametrom
u dijagnozi BV. Dakle prisustvo PMN bio bio najvažniji pojedinačni parametar na osnovu koga
bi mogli razlikovati BV i AV. Međutim na osnovu naših novih iskustava, rekli bi da je u takvim
mikroskopskim nalazima najvažnije da ne kažemo imperativno isključiti prisustvo pre svega
CA, a zatim i T. vaginalisa. Kako mi u našem ispitivanju nismo imali nijednu pacijentkinju sa
infekcijom trihomonasom, fotografija je prikazana da se vidi koliko nalaz može da liči na AV.
Uvođenje savremenih molekularnobioloških tehnika unelo je pravu revoluciju u
definisanju vaginalne mikroflore, dovelo do otkrivanja novih bakterija i novih informacija o
filogenetskoj raznovrsnosti mikroorganizama, i sigurno će u skoroj budućnosti omogućiti
precizniju diferencijaciju u definisanju i razgraničavanju normalne od patološke vaginalne flore
[218-220]. Da ovaj zadatak neće biti nimalo lak i da će zahtevati još dosta napora, pokazali su
dosadašnji rezultati, od kojih ćemo navesti samo najvažnije: a) Mikrobiom vagine je mnogo
raznovrsniji i sa većim fluktuacijama nego što smo to ranije pretpostavljali; b) ne postoji jedno
jezgro mikrobioma vagine nego brojne bakterijske zajednice različitog sastava i stabilnosti koje
su prisutne kod potpuno zdravih žena, te se ove varijacije mogu definisati kao normalno stanje;
c) kod nekih žena vrsta i broj vaginalnih mikroba značajno se menja u kratkom vremenskom
periodu, dok se kod drugih vrlo malo ili gotovo nimalo ne menja, mikrobiom je izgleda
jedinstven za svaku ženu, a na njega značajno utiču rasa, navike, godine, faze menstruacionog
ciklusa, trudnoća, okruženje, stres i mnogi drugi faktori; d) kod oko četvrtine žena laktobacili
32
nisu predominantni u vaginalnom ekosistemu, i mogu biti zamenjeni drugim bakterijama koje
produkuju mlečnu kiselinu , kao što su Atopobium vaginae , Megasphaera spp i Leptotrichia
spp[180]. Dakle, mikrobiom vagine se pokazao kao znatno dinamičniji i složeniji nego što se
pretpostavljalo, a primena ovih novih metoda svakako će dovesti do novih saznanja o prisustvu,
promenljivosti, međusobnim interakcijama, značaju i ulozi pojedinih mikroorganizama u
održavanju zdravog vaginalnog sistema i/ili nastanka patoloških stanja, kao i redefinisanju
pojmova normalnog i patološkog u vaginalnom ekosistemu [221]. Velike varijacije među
pojedinim ženama i u kratkom vremenskom periodu, u sastavu mikrobima zdrave vagine
ukazuju na teškoće sa kojima ćemo biti suočeni u budućim studijama, koje bi trebalo da
preciznije definišu ove varijacije i njihov značaj u nastanku određenih patoloških stanja [222,
223].
1.6
LOKALNI IMUNSKI SISTEM IPOLIMORFONUKLEARI
Funkcija imunog sistema je da obezbedi odgovarajuće mehanizme odbrane od patogena. Zaštita
počinje na površinskim barijerama sastavljenim od mehaničkih, hemijskih i ćelijskih
komponenti. Mehaničke komponente podrazumevaju epitel i sluznice reproduktivnog trakta
koji obezbeđuju zaštitu od ulaska patogena [224-227]. Imunski sistem sluznica je sastavljen od
limfoidnog tkiva koje, za razliku od sistemskog limfoidnog tkiva, luče sekretorna IgA antitela,
sadrže T-ćelije sa specifičnim regulatornim osobinama i efektorskim kapacitetom i imaju
specifično organizovan ćelijski sistem koji dozvoljava limfocitima, aktivisanim u folikulima
sluznice, da selektivno migriraju u mukozno limfno tkivo. Funkcija ovih limfnih tkiva mukoze
(MALT, mucosa associaciated lympohoid tissue) je da obezbedi odbranu na sluzničnim
površinama i oni suštinski predstavljaju prvu liniju odbrane od stranih patogena [228, 229].
Odbrambenu ulogu MALT obavlja u saradnji sa drugim neimunološkim faktorima, kao što su
predominacija laktobacila i kiseli pH<4,5, mukozna motorna aktivnost cilija, stvaranjem
sekrecijskih barijera i produkcija različitih supstanci (laktoferin, lizozom, defensin i sl.) koji
smanjuju mogućnost nastanka infekcije [230, 231]. Cervikalne i vaginalne epitelne ćelije su
jedan od važnih izvor različitih citokina. Drugu, hemijsku, komponentu mukoznog sistema čine
solubilni ili ćelijski receptori koji usklađuju imunski odgovor domaćina. Treća, ćelijska
komponentu urođenog imunskog sistema podrazumeva epitelne ćelije, fibroblaste strome i
različite vrste inflamatornih leukocita, od kojih su najvažniji PMN [232, 233]. Urođeni imunski
sistem deluje nespecifično tokom rane faze imunskog odgovora. On ostvaruje prvi kontakt sa
antigenom i eliminiše ga ili ga predstavlja ćelijama adaptivnog imunskog sistema, odnosno
33
dovodi do aktivacije T i B limfocita. Funkcioniše neprestano i bez ikakvih posebnih priprema,
dakle nespecifično, ali nema sposobnost imunološke memorije o ranijem susretu sa patogenom.
Kada govorimo o sistemu urođene imunosti mislimo na imunske i neimunske mehanizme
odbrane. Imunski podrazumevaju ćelije koje čine sistem urođene imunosti, kao što su fagociti
(PMN, makrofagi i monociti), NK ćelije, denditrične ćelije i mastociti. Urođeni imunski sistem
dakle predstavlja prvu liniju odbrane od mikroorganizama, i integriše različite organske sisteme
ne samo u borbi protiv stranih mikroorganizama. Suštinski, urođeni imunski sistem je taj koji
određuje prirodu stečenog imunskog odgovora tako što oslobađa različite proinflamatorne i
antiinflamatorne medijatore. Najčešća komponenta zida bakterija je LPS i on je najčešći signal
domaćinu koji ukazuje na prisustvo infektivnog agensa. Fagociti su svakako najvažnija i prva
linija odbrane i oni podrazumevaju PMN, monocite u krvi, odnosno prelaskom u tkiva postaju
tkivni makrofagi. PMN svakako predstavljaju najbrojniju i najvažniju ćelijsku populaciju i
najvažniju komponentu urođenog imunog sistema.
Hematopoetske ćelije kostne srži su prethodnica PMN koji prolaze različite morfološke
faze tokom sazrevanja i diferencijacije. Zreli neutrofili su krajnje diferentovane ćelije koje se
ne mogu više deliti i koje se razvijaju iz CD34+ pluripotentnih matičnih ćelije u koštanoj srži.
U odsustvu infekcije telo proizvodi 1-2 x 1011 neutrofila dnevno. Međutim, infekcija može da
dovede do desetostrukog povećanja u proizvodnji neutrofila. Istovremeno u koštanoj srži pod
uticajem i kontrolom faktora rasta i različitih citokina iz pluripotentnih ćelija sazrevaju
neutrofili, polimorfonukleari (PMN). PMN se “naoružavaju” u koštanoj srži, a arsenal oružja
pakuju u granule. Oslobađanje neutrofila iz koštane srži regulisano je uglavnom hemokinima.
Zanimljivo je da su PMN u grupi ćelija sa najkraćim životnim vekom (6-8 h), mada evolucijski
razlozi ovome nisu jasni. Jedan od mogućih razloga je da sa tako sačuva integritet ovih ćelija i
spreči nekontrolisano oslobađanje njihovog sadržaja koji može biti opasan i po domaćina. Kako
onda PMN lociraju i identifikuju infekciju? Proces tranzicije, tokom koga neutrofili dobijaju i
integrišu veliki broj signala iz svoje okoline, poznat je pod nazivom aktivacija neutrofila.
Signali neutrofilima stižu od domaćina ali i od samog patogena. Da bi neutrofili pronašli
patogene oni moraju da pokrenu veliki broj ćelijskih mehanizama. Tako dolazi do mobilizacije
sekretornih vezikula i granula, identifikacije hemotaktičnog gradijenta (puta) kojim se kreću
dovodeći do reorganizacije aktinskog citoskeleta, penetriraju kroz endotelnu barijeru i
usmaravaju se prema bazalnoj membrani, te započinju transkripciju gena za citokine koji će
dovesti do regrutovanja novih imunskih ćelija. Kada dođu na mesto infekcije neutrofili
prepoznaju patogene i oslobađaju svoj smrtonosni sadržaj. Dakle, pokretanje ovih procesa
počinje u krvotoku, gde neutrofili predstavljaju stražare koji prate potencijalne opasnosti za
34
domaćina. Signal PMN može doći različitim putevima, npr. preko krvi ako je mikrorganizam
prisutan u njoj aktivira se sistem komplementa koji šalje signale PMN. Ipak najčešći slučaj je
da aktivirane i oštećene ćelije dovode do oslobađanja hemokina uz različite hemijske supstance
koje oslobađa mikroorganizam (LPS) i koji su najčešći i najpotentniji aktivatori PMN. Dakle,
na mestu zapaljenja postoji obilje signala koji dolaze kako od mikroorganizama tako i od samog
domaćina i stimulišu endotelne ćelije. Stimulansi kao što su LPS, klasični hemoatraktanti i
citokini (TNF, IL-1β, IL-17)pokreću produkciju adhezivnih molekula, za koje se vezuju PMN
i monociti, napuštaju krvne sudove i stižu na mesto infekcije već posle nekoliko minuta.
Svakako da je od najpotentnjih hemoatraktana IL-8, citokina koji ima najvažniju ulogu u
regulaciji zapaljenjskog ćelijskog “saobraćaja” [234, 235]. Interleukin-8 produkuju PMN,
makrofagi, monociti, limfociti, NK-ćelije, endotelne i druge ćelije, a proinflamatorni citokini
(IL-1 TNF-) podstiču, dok antinflamatorni (IL-10, IL-4 i TGF-β) slabe njegovu sintezu. Spada
u proinflamatorne citokine i sposoban je da indukuje selektivnu hemotaksiju i aktivaciju PMN.
PMN, koji su migrirali na mesto infekcije, mogu da budu aktivisani i drugim lokalno
produkovanim citokinima da oslobađaju i druge medijatore zapaljenja i pokrenu citokinsku
kaskadu. Izbegavanje ranog kontakta sa PMN mehanizmima inhibicije hemotaksije PMN i
monocita smatra se jednim od osnovnih mehanizama koji je odgovoran za nedostatak PMN kod
pacijentkinja sa BV, jednom masivnom polimikrobnom infekcijom. Pretpostavlja se BVAB
sinergistički dovode do inhibicije hemotaksije, najverovatnije tako što produkuju određene
supstance kao što su sukcinati i velike količine masnih kiselina kratkih lanaca (MKKL, short
chain fatty acids). Tako su sukcinati detektovani u povišenim koncentracijama kod žena sa BV,
a Prevotella spp. i Mobiluncus spp. su imali najjači inhibitorni uticaj na hemotaksu [236].
Takođe je pokazano da se MKKL nalaze u velikim koncentacijama kod pacijentkinja sa BV, i
da svojim antiinflamatornim i proapoptotičnim efektima dovode do odsustva PMN kod
pacijentkinja sa BV [237]. Naravno, logično je pretpostaviti da sukcinati i MKKL predstavljaju
samo neke od mnogih leukotoksičnih faktora koje produkuju BVAB.
Hemoatraktanti se vežu za receptore na PMN (najčešće G-proteini) koji pokreću
signalnu kaskadu MAPK/ERK. Dolazi do aktiviranja mašinerije koja dovodi do oksidativnog
praska koji je i glavno obeležje aktivacije PMN. Istovremeno se aktiviraju RPU i vežu za
molekule na membrani patogena od kojih su, kao što smo rekli, najvažniji TLR. Ekspresija svih
članova familije TLR prisutna je i na PMN, ali je za oksidativni prasak najvažnija ekspresija
TLR3. Često se aktivacija PMN poistovećuje sa oksidativnim praskom i fagocitozom.
Međutim, mora se imati na umu ogroman broj interakcija i kompleksnih signala koji se dešavaju
na putu PMN na mesto infekcije tako da se tokom toga putovanja odigravaju pripreme koje će
35
postepeno dovesti do kompletne aktivacije PMN, koji onda mehanizmima, kao što su fagocitoza
i degranulacija, uništavaju patogen [238]. PMN imaju karakteristike ne samo efektorskih nego
i imunoregulatornih ćelija. Ukratko, PMN brzo dolaze na mesto infekcije gde oslobađaju svoj
arsenal toksičnih produkata da ubiju i odstrane patogen procesima fagocitoze, degranulacije i
stvaranja reaktivnih kiseoničnih metabolita. Da se ne radi o nemilosrdnim »egzekutorima«
ukazuju podaci da PMN posle uspešno obavljenog zadatka menjaju svoj fenotip i počinju sa
podsticanjem antiinflamatornog miljea tako što produkuju i oslobađaju antiinflamatorne
medijatore (npr. lipokini). Oni takođe šalju signale okolnim makrofagima da ih lakše nađu i
uklone (engl. find me and eat me signals) [239-241]. Posle izvršenog zadatka započinje proces
gašenja zapaljenja koji je veoma važan za održavanje tkivne homeostaze. U ovom procesu
kolateralna šteta je neizbežna, ali mora da bude svedena na najmanju moguću meru, zbog čega
neutofili moraju pažljivo biti uklonjeni. Ovaj proces neophodan za tkivnu homeostazu
podrazumeva niz kontrolisanih mehanizama u procesu gušenja zapaljenja. To je kompleksan
proces koji uključuje produkciju antiinflamatornih medijatora i apoptozu PMN.
1.7
APOPTOZA
Apoptoza predstavlja važan mehanizam regulisanja ćelijske homeostaze i u fiziološkim
uslovima, dakle u odsustvu aktivacionih mehanizama PMN ulaze u proces takozvane spontane
apoptoze. Dakle, kada se fiziološka funkcija PMN u tkivima ispuni (npr. uništavanje
mikroorganizama), oni prolaze kroz proces apoptoze, programirane ćelijske smrti, koja se javlja
da bi se očuvao integritet ćelijske membrane neutrofila i sprečilo nekontrolisano oslobađanje
štetnih toksičnih supstanci iz ćelije [242]. Apoptoza ili programirana smrt ćelije je aktivan,
strogo kontrolisani genski regulisan proces koji ima vodeću ulogu u mnogim biološkim
procesima, a njeni poremećaji mogu dovesti do raznih oboljenja. Ključnu ulogu u procesu
apoptoze ima porodica enzima kaspaza koje izvršavaju program apoptoze. Postoje dva osnovna
puta koji dovode do aktivacije kaspaza, spoljašnji i unutrašnji. U procesu apoptoze učestvuje i
niz regulatornih protein (npr. Bcl-2). Pokretanje apoptoze je kompleksan proces koji se odlikuje
specifičnim morfološkim promenama. Kako ove promene često variraju u zavisnosti od tipa
ćelija i uslova u kojima ćelija raste, jedan od ciljeva našeg rada bio je da utvrdimo da li se
vijabilnost vaginalnih PMN, odnosno stepen apoptoze, razlikuje kod pacijentkinja sa
normalnom vaginalnom florom (predominacija laktobacila) u odnosu na pacijentkinje sa
patološkom vaginalnom florom (BV, CA, TV). U ovom aktivnom i dobro kontrolisanom
procesu ćelija prolazi kroz niz morfoloških promena, kao što su zgušnjavanje citoplazme i
36
unutarćelijskih organela, smanjenje zapremine ćelija, kondenzacija hromatina u jedru, nakon
čega dolazi do fragmentacije ćelije na apoptotična tela okružena membranom. Suština je da se
opasni sadržaj koji PMN nose ne oslobodi u okolinu i izazove zapaljenjsku reakciju koja može
da bude štetna po domaćina. Ovaj balans između preživljavanja i smrti PMN precizno je
regulisan mnogobrojnim mehanizmima koji potiču i od domaćina, a i od patogena [243-245].
Gubitak važnih funkcija neutrofila kao što su hemotaksija, fagocitoza, oksidativni prasak ili
degranulacija, posledica je pre svega promena na receptorskom nivou koji različitim
mehanizmima
(smanjena
ekspresija
receptora,
nemogućnost
vezivanja,
poremećaji
postreceptorskih signala i sl.) smanjuju ili onemogućavaju ove procese. Pored toga, pokazano
je da PMN mogu aktivno da produkuju i oslobađaju antiinflamatorne medijatore (lipoksin) koji
onda započinju ograničavanja intenziteta i trajanja zapaljenjskog odgovora. U zavisnosti od
uslova mikrosredine, životni vek neutrofila može biti produžen ili skraćen. Normalno, ostareli
PMN bivaju podvrgnuti procesu spontane apoptoze u odsustvu citokina i drugih inflamatornih
medijatora. Tako tokom zapaljenja životni vek PMN se produžava pod dejstvom različitih
agenasa, a sve u cilju poboljšanja antimikrobnog dejstva neutrofila. Mnogobrojne in vitro
studije pokazale su da zapaljenjski citokini kao što su IL-1β, IL-2, IL-8, IL-15, INF-γ, G-CSF,
GM-CSF i LPS mogu da produže opstanak neutrofila. Uloga IL-6 je kontradiktorna, dok je za
TNF-α pokazano da u zavisnosti od vremena i uslova okoline može imati i pro- i
antiapoptotičko delovanje. Pored ovog “direktnog” uticaja citokina na proces apoptoze
pokazano je da IL-10, koji nema direktan uticaj na apoptozu, može blokirati anti-apoptotično
delovanje LPS i tako voditi ka apoptozi.
Dakle, ovaj proces “rađanja” i “umiranja” je stalan u fiziološkim uslovima kao deo
homeostatskih mehanizama organizma. Tako će kod većine bakterijskih ili autoimunskih
oboljenje, doći do npr. pojačane produkcije citokina (GM-CSF i G-CSF), odlaganja apoptoze i
nagomilavanja PMN. Pad koncentracija citokina u fazi rezolucije zapaljenja indukovaće
apoptozu [246, 247]. Mnogi proinflamatorni medijatori produžavaju vek PMN odlažući ili
smanjujući stepen apoptoze, a među njima su najvažniji: G-CSF, GM-CSF, LPS,C5a , fMLP ,
ATP , leukotrijen B4 , IL-1, IL-2 , IL-3 , IL-15 i interferon-ɣ [248-257]. Dakle broj PMN ne
zavisi samo od njihove produkcije u koštanoj srži nego je u značajnoj meri regulisan stepenom
apoptoze. Tako kod zapaljenja okolne ćelije ili sami PMN (autokrino) dovode do produkcije
prooinflamatornih citokina i tako odlažu svoju apoptozu. Zanimljivo, kortikosteroidi blokiraju
apoptozu PMN, a indukuju ovaj process kod većine drugih ćelija. Pored domaćina i samih
PMN, još jedan značajan faktor može da utiče na apoptozu PMN, a to su različiti patogeni [258261]. I dok ova patogenima indukovana apoptoza makrofaga može negativno da utiče na
37
imunski odgovor domaćina i ishod infekcije, kada je reč o patogenom indukovanoj apoptozi
PMN ovakav događaj je generalno povoljan za domaćina i ključan u okončanju infekcije [262].
Zbog toga se smatra da bakterije i njihovi produkti u najvećem broju slučajeva dovode do
indukcije apoptoze PMN, dok patogeni koji ometaju fagocitozom indukovanu apoptozu PMN
i produžavaju njihov vek mogu dovesti do bolesti. U odnosu ili borbi domaćina i patogena
principijelno imamo dva ishoda: prvi u kome PMN posle fagocitoze i uništenja patogena bivaju
podvrgnuti apoptozi i odstranjeni od strane makrofaga, i drugi, ređi, u kome neki patogeni
ometaju apoptozu PMN ina taj način prouzrokuju bolest. Uopšteno je prihvaćen stav po kome
u uslovima infekcije i/ili zapaljenja PMN duže opstaju jer se smatra da se produženjem životnog
veka i njihove aktivnosti smanjuje mogućnost da patogen nanese štetu domaćinu. Međutim,
kada se “neprijatelj” savlada aktivišu se mehanizmi rezolucije i apoptoze da bi se izbegle štetne
posledice po domaćina. S obzirom na navedene činjenice hteli smo da utvrdimo da li se stepen
apoptoze razlikuje kod pacijentkinja sa normalnom i patološkom vaginalnom florom, i da li i
kako korelira sa brojem PMN, kao i koncentracijama ispitivanih citokina.
1.8
BROJ POLIMORFONUKLEARA U VAGINALNOM SEKRETU
Kao što smo već opisali, centralni događaj i terminskog i prevremenog porođaja je zapaljenje
u kome PMN igraju jednu od najvažnijih uloga. Ispitivanja su pokazala da je infiltracija PMN
prisutna ne samo na lokalnom (grlić, miometrijumu, horiodecidui, amnion) nego i na
sistemskom (prajming i aktivacija PMN u
krvi majke) nivou. PMN i makrofagi imaju
značajniju ulogu u prevremenom nego u terminskom porođaju. S druge strane prisustvo PMN
u vaginalnom sekretu je jedan od najjednostavnijih i najjevtinijih postupaka koji bi mogao da
bude marker prisustva zapaljenja ne samo u vagini nego i u gornjim partijama genitalnog trakta,
u našem slučaju grlića i gravidne materice. Teoretski, povećan broj PMN kod pacijentkinja pre
37. nedelje gestacije (bez obzira na njihovo poreklo i uzrok) ukazuju na zapaljenje, a kako je
porođaj suštinski inflamatorni događaj, u ovom slučaju bi se to moglo tumačiti kao povećan
rizik za PP. Znamo da PMN igraju veoma važnu ulogu u urođenom i stečenom imunskom
odgovoru i odbrani domaćina od patogena i da utiču na koncentracije citokina i drugih
zapaljenjskih medijatora, a jedan su od najvažnijih faktora u rezolucije zapaljenjskog procesa i
apoptoze. Pored toga PMN su jedan od najznačajnijih pojedinačnih faktora u sva tri osnovna
procesa (sazrevanju grlića, kontrakcije uterusa, aktivacija fetalnih membrana) vezana za
započinjanje porođaja. Zato je čudno koliko je malo studija koje ispituju ovu povezanost ako
to, na primer, uporedimo sa brojem studija koje se odnose na vaginalne infekcije (BV), lokalne
38
koncentracije citokina i drugih inflamatornih medijatora i rizika za PP. Ovi podaci su još čudniji
kada se uzme u obzir činjenica da se dijagnoza BV zasniva na mikroskopskom pregledu
nativnog preparata (Amselovi kriterijumi) i/ili preparata bojenog po Gramu (Nugentovi
kriterijumi), a mikroskop je osnovno oruđe i da se utvrdi broj PMN u vagini ili grliću materice.
Jedan od najvažnijih parametara u histološkoj dijagnozi horioamnionitisa i uspostavljanju
kauzalne povezanosti infekcije i PP, takođe je broj PMN. Pitanje zašto u najvećem broju studija
u kojima se u dijagnozi vaginalnih infekcija koristi mikroskop, nemamo podatak o broju PMN,
ostaje otvoreno. Kada se radi o mikroskopskom pregledu nativnog preparata, činjenica da je
veoma mali broj ginekologa obučen da gleda nativni preparat verovatno je glavni razlog što
ovaj podatak najčešće nedostaje. S druge strane preparat po Gramu je “sveden” na Nugentov
skor i dijagnozu BV, tako da većina mikrobiologa, a i studija, prenebegava PMN kao relevantan
faktor u proceni stanja vaginalne flore. Dalje, već i letimičan pogled na studije koje se bave
brojem PMN u vaginalnom sekretu i/ili grliću materice ukazuje na značajne metodološke
razlike, od kojih su svakako najvažniji one koje se odnose na broj PMN. Na osnovu dosada
korišćenih metodoloških postupaka možemo zaključiti da danas ne postoje ni približno
definisani dijagnostički kriterijumi i granične vrednosti za normalan ili patološki broj PMN u
vaginalnom sekretu. Tako, na preparatu bojenom po Gramu, raspon normalnog broja PMN
kreće od 5 do 32 na 1 vidnom polju i uvećanju x1000 (imerzija). Još drastičnije razlike se
odnose na iste granične vrednosti pri različitim mikroskopskim uvećanjima. Tako npr. Hitii
[263] u svojoj studiji pregledom preparata na x 400 ima istu graničnu vrednost (preko 5 PMN)
kao i većina drugih na uvećanju x 1000. Zbog toga je jedan od ciljeva našeg rada bio da u
određivanju broja PMN, pored semikvantitativnih metoda koje podrazumevaju mikroskopski
pregled nativnog preparata vaginalnog sekreta (NPVS) ili preparat bojenog po Gramu,
koristimo i kvantitativne metode, ne bismo li preciznije definisali šta je to normalan, a šta
patološki broj vaginalnih PMN. S obzirom na značaj i ulogu PMN u zapaljenju smatrali smo da
bi bilo korisno ispitati kako broj vaginalnih PMN koreliše sa koncentracijama ispitivanih
citokina, stepenom apoptoze ili dužinom grlića materice merene transvaginalnom
sonografijom.
39
1.9
CERVIKOMETRIJA
U fiziološkim uslovima grlić 37 nedelja ostaje zatvoren kako bi fetusu omogući rast, razvoj i
sazrevanje organskih i funkcionalnih sistema i nesmetanu adaptaciju na vanmaterične uslove.
Mikrostrukturne promene u tkivu grlića materice pre 37.n. g. mogu dovesti do PP, a ukoliko se
ne dese do 42. n.g. uzrok su posterminskog porođaja. Dakle potpuno je fascinantno kako to
grlić materice, u najvećem broju slučajeva, „zna“ i može da se u tih 5 nedelja transformiše iz
jednog fibroznog, tvrdog, zatvorenog cilindra dužine 2-3 cm, sa kanalom prečnika 2-3 mm, u
elastičnu i meku formaciju dužine 2-3 mm i prečnika preko 10 cm. Uprkos velikom broju
ispitivanja koja su do danas urađena još nemamo odgovor na ovo pitanje. Naravno, ovo je
potpuno razumljivo jer ne znamo kako započinje normalan porođaj, a promene na grliću su
samo jedan od velikog broja događaja koji se dešavaju na gotovo svim organskim i
funkcionalnim sistemima u „projektu“ pripreme organizma za porođaj. Sigurno je da su
promene na grliću dinamične i kontinuirane i da se dešavaju tokom čitave trudnoće. Većina
ovih promena dešava se na molekularno-biološkom nivou i najveći broj izmiče rutinskim
kliničkim procedurama, kao što je ginekološki pregled ili transvaginalna sonografija. Ipak,
promene na grliću i donjem uterinom segmentu (razmekšanje vrha grlića i cerviko-uterusnog
spoja) mogu kliničkim pregledom da se detektuju već između 4. i 6.n.g., i pre pojave UZ bili
su najvažniji klinički parametri u dijagnozi rane trudnoće. Ovo samo potvrđuje rezultate
molekularnobioloških i histopatoloških ispitivanja koja su pokazala da se već od samog početka
trudnoće na grliću dešavaju velike mikrostruktuirne promene (povećanje kolagena,
hijaluronske kiseline, vode), kao i da su grlić materice i donji materični segment tokom cele
trudnoće jedan funkcionalni segment. Ovaj segment sa centralnom osom grlića (cervikalnim
kanalom) ima oblik slova »T« i karakterističan je za ranu trudnoću, koji sa početkom porođaja
dobija izgled slova »V« i na kraju slova »U«. Ovo samo pokazuje da grlić na nivou unutrašnjeg
materičnog ušća i donji uterini segment predstavljaju dve anatomski zasebna dela, ali da su
funkcionalno jedna celina.
Grlić materice je uglavnom vezivno tkivni organ, koji ima oko 10% mišićnog tkiva, 2%
elastina, a ostalo čine kolagen i proteoaminoglikani i drugi različiti glikoproteini kao što je
fibronektin [264]. Dakle, sposobnost grlića da ostane zatvoren tokom trudnoće nije vezana za
mišićno sfinkterske mehanizame, nego prvenstveno zavisi od regulacije fibrozno vezivnog
tkiva grlića. Još jedna od bitnih karakteristika tkiva grlića je da se u njemu nalazi velika količina
vanćelijskog matriksa (VĆM), čija je glavna komponenta kolegen, i promene u količini i
metabolizmu kolagena su najvažnija komponenta koja utiče na stanje grlića tokom trudnoće.
40
Tkivo grlića odlikuje se velikom količinom VĆM koji okružuje pojedinačne ćelije. Glavna
makromolekularna komponenta VĆM je kolagen i on određuje tenzione sile fibroznog
vezivnog tkiva. Promene karakteristika cerviksa u trudnoći odraz su promena u količini i
metabolizmu kolagena. Proteoglikani takođe učestvuju u fiziološkim zbivanjima u grliću
matrice, i tako jedan od proteoglikana dekorin koji ima veliki afinitet za kolagen stabilizuje
molekularnu strukturu grlića, dok drugi proteoglikan biglikan, može dovesti do dezorganizacije
kolagenih fibrila [265-267]. Biohemijski događaji koji karakterišu sazrevanje grlića materice
su pad u ukupnoj količini sadržaju kolagena i povećanje njegove solubilnosti, uz pojačanu
kolagenolitička aktivnost i kolagenaza i leukocitnih elastaza. Promene u VĆM grlića materice
suštinski imaju karakteristike zapaljenjskog procesa jer tokom sazrevanja grlića materice dolazi
do influksa zapaljenjskih ćelija (makrofaga, PMN, mast ćelija, eozinofila i dr.) u stromu grlića
materice. Ovo dovodi do povećanih koncentracija hemokina i drugih proinflamatornih citokina,
zatim pojačane produkcije PG, što sve dovodi do promena u VĆM grlića materice, njegovog
sazrevanja i pripreme za porođaj [268-272]. Lokalno povećanje koncentracije hijaluronske
kiseline
pojačava
migraciju
inflamatornih
ćelija
(PMN)
i
posledično
povećanje
proinflamatornih citokina i hemokina (IL-1, TNF- i IL-8), koji pozitivnom povratnom
spregom dovode do daljeg povećanja hijaluronske kiseline pojačane kolagenolitičke aktivnosti
i značajnog smanjenja količine kolagena u grliću. IL-1 podstiče proizvodnju kolagenaza, IL-8
privlači PMN koji oslobađaju elastaze koje imaju važnu ulogu u razgradnji kolagena, što sve
dovodi do daljeg sazrevanja grlića i pripreme za porođaj [273-278]. Svakako da i drugi
mehanizmi imaju uticaj na sazrevanje grlića materice, a pomenućemo samo neke. MMP su
familija potentnih enzima koji razgrađuju molekule VĆM, uključujući i kolagen. Aktivnost
MMP je regulisana njihovim specifičnim tkivnim inhibitorima. MMP-1 i MMP-8 deluju na
prirodni, nedenaturisani kolagen i razgrađuju ga na manje fragmente, dok MMP-2, MMP-3,
MMP-7, MMP-9, i MMP-10 primarno cepaju denaturisani kolagen, proteoglikane i različite
komponente bazalne membrane. Ova proteoliza igra važnu ulogu tokom cele trudnoće, a
počevši od implantacije [279-281]. Poznato je da povećan broj i aktivnost makrofaga u cerviksu
dovode do dalje amplifikacije zapaljenjskog procesa, nagomilavanje PMN, pojačane sinteze
imunskih aktivatora kao što su inducibilne forme sintetaze azot monoksida (NO),
prostaglandina i proinflamatornih citokina, povećanja koncentracija MMP što sve može dovesti
do promena na grliću materice, uterinih kontrakcija i porođaja [282-285]. Preliminarni rezultati
dobijeni biopsijom grlića materice pokazali su da dolazi do nagomilavanja PMN u blizini
kapilara i malih vena u grliću žena pred kraj trudnoće. Aktivacija njihovih enzima koji razaraju
VĆM dovodi do remodeliranja grlića materice neophodnog za porođaj. Najnovija ispitivanja
41
su pokazala da se promene u grliću materice dešavaju polako i nedeljama pre očekivanog
terminskog porođaja [286]. Da li ovakav »pripremni period« postoji i kod pacijentkinja sa PP
za sada nemamo precizan odgovor. Wood i sar. su bili prvi koji su primetili da skraćen grlić
predstavlja faktor rizika za PP, što je kasnije i potvrđeno mnogobrojnim ispitivanjima dužine
grlića, naročito onim u kojima je korištena transvaginalna sonografija [287-289]. Kako su
promene u cerviksu trudnica u terminu udružene s migracijom leukocita, logično je
pretpostaviti da povećan broj PMN kod pacijentkinja sa cervikovaginalnim infekcijama može
imati uticaja u etiopatogenezi PP udruženog sa infekcijom [290-298]. Povećan broj makrofaga
koreliše sa povećanom produkcijom proinflamatornih citokina od kojih su najznačajniji IL-1,
IL-6, IL-8 i TNF-, dakle onih citokina za koja su dosadašnja ispitivanja pokazala da imaju
najznačajniju ulogu u etiopatogenezi PP udruženog sa infekcijom. Proinflmatorni citokini
dovode do aktivacije transkripcionog faktora NF-κB koji onda između ostalog dovodi do
blokiranja efekata progesterona, što je jedan od centralnih mehanizama započinjanja i
terminskog i preterminskog porođaja. Dakle isti ovaj signalni put se pokazao kao veoma važan
i molekularnim zbivanjima koja se odnose i na grliću materice, i to kako u terminskim, tako i
PP.
Takođe je pokazano da hormoni imaju značajnu ulogu u regulisanju promena na grliću
materice. Tako je poznato da estradiol (razgradnja kolagena) indukuje sazrevanje grlića, dok
progesteron ima suprotne efekte. Prostaglandini (PG) se godinama koriste u praksi za
sazrevanje grlića materice pre indukcije porođaja ili abortusa. Međutim ono što poslednjih
godina zaokuplja pažnju istraživača svakako su dejstva progesterona na grlić jer se prethodnih
godina pod dejstvom progesterona uglavnom mislilo na miometrijum. Na značaj progesterona
ukazuju mnogobrojne studije koje su pokazale da antiprogesteronski preparati ili blokatori
progesteronskih receptora dovode do sazrevanja grlića materice, kao i da su ova dejstva
izraženija ukoliko je gestacijska starost veća. Progesteronska aktivnost dovodi do povećane
sinteze NO koji je jedan od glavnih faktora mirovanja materice, smanjuje produkciju PG kao i
formiranje Ca++ kanala i oksitocinskih receptora. U cerviksu progesteron dovodi do porasta
tkivnog inhibitora MMP 1 (TIMP-1) inhibirajući tako kolegenolizu [299]. U eksperimentu na
pacovima inhibicija sintetaze azot monoksida potencira sposobnost antiprogesteronskih
supstanci da dovedu do PP [300]. Pokazano je da progesteron inhibira, a mifepriston stimuliše
produkciju IL-8 koji je najvažniji hemoatraktant [301]. Najnovija ispitivanja pokazuju da su
dejstva progesterone na grlić i uterus odvojena, što potvrđuju rezultati ispitivanja da
antiprogestini dovode do sazrevanja grlića materice ali ne i porođaja. Ovo smatramo važnim
jer je nekoliko randomizovanih kliničkih studija pokazalo da progesteron može značajno da
42
smanji učestalost PP kod pacijentkinja kod kojih se UZ transvaginalnom sonografijom nađe
skraćen grlić [301-315]. Danas bi mogli reći da progesteron predstavlja glavni faktor
održavanja miometrijuma u mirovanju i očuvanja integriteta grlića materice i da faktori koji
dovode do porođaja moraju da nadjačaju efekte progesterona.
Do pojave UZ digitalni pregled je bio jedini način da se proceni dužina grlića materice, a
celokupan nalaz je procenjivan takozvanim Bishopovim skorom, kasnih devedesetih od prvih
radova Iamsa i sar. [322] urađen je veliki broj ispitivanja koja su trebala da pokažu vrednost
UZ u predviđanju PP. Studije koje su poredile digitalni pregled i transvaginalnu sonografiju
(TVS), takođe su pokazale da je TVS superiorna u odnosu na klinički pregled u predviđanju
PP. Ovo je razumljivo ako znamo da digitalnom pregledu »izmiče« stanje unutrašnjeg
materičnog ušća i donjeg uterusnog segmenta koji nesumnjivo imaju najveći značaj [316, 317].
Prosečna dužina grlića materice pre 28. n.g. iznosi od 40-60 mm. Tačnije, percentili za
dužinu grlića između 22-30. n.g. su: 2,0 cm: 5. percentil; 2,5 cm: 10. percentil; 3,5 cm: 50.
percentil; 4,5 cm: 90. percentil. Dužina grlića smanjuje se sa napredovanjem trudnoće tako da
je između 16. i 20. n.g. 4,0 – 4,5 cm;24-28. n.g. 3,5 – 4,0 cm; 32-36. n.g. 3,0 – 3,5 cm.
Dosadašnja ispitivanja pokazala su da dužina grlića u prvom trimestru trudnoće ne može da se
koristi u predviđanju PP. Dakle, počevši od Iamsove studije [322], veliki broj autora merio je
dužinu grlića tokom trudnoće i došao do zaključka da je dužina grlića u obrnutoj korelaciji sa
trajanjem trudnoće, odnosno da kratak grlić predstavlja rizik za PP. Naravno, ne treba izvući
zaključak da se pre vremena porode sve žene koje imaju kratak grlić [318-321]. Uopšteno,
trudnice čija je dužina grlića do 24. n.g. manja od 25 mm imaju veći rizik za PP [322]. Pomenuta
studija Iams i sar. [322] iz 1996. je pokazala obrnut odnos između dužine grlića materice i rizika
za PP. To je ujedno bio i podsticaj za veliki broj ispitivanja koja su imala za cilj da utvrde da li
bi se ultrazvučni pregled grlića materice mogao koristiti kao skrining metoda u prevenciji PP.
Naime, merenje dužine grlića materice predstavlja brz, relativno jednostavan i jevtin
dijagnostički metod koji se bez rizika može primeniti kod najvećeg broja pacijentkinja. Danas
je transvaginalna sonografija jedini pristup kojim na adekvatan i precizan način možemo
izmeriti dužinu grlića materice i tako proceniti rizik. I najvažnije, izdvajanjem rizične grupe
trudnica otvorena je mogućnost za primenu terapijskih procedura, kao što su terapija
progesteronom ili aplikacija serklaža. Brojna istraživanja ispitivala su mogućnost da dužinu
grlića koristimo kao skrining u prevenciji PP [322]. Skraćen grlić meren TVS predstavlja
najpouzdaniji pojedinačni markera u predviđanju PP [323-327]. Tako su ova ispitivanja
pokazala da će se oko 15% trudnica čija je dužina grlića manja od 15 mm poroditi pre 32.
nedelje trudnoće [325, 328]. Trudnice koje prethodno nisu imale PP, a čija je dužina grlića pre
43
20. n.g. kraća od 25 mm imaju 4 puta veći rizik od PP. U populaciji trudnica koje su već imale
PP ovaj rizik je značajno veći (RR-11,3) [329]. Kada je dužina grlića preko 25 mm negativna
prediktivna vrednost je preko 95% za porođaj pre 32.n.g [330]. Ako je u blizanačkoj trudnoći
dužina grlića između 20 i 24.n.g. veća od 25 mm, NPV je takođe preko 95% [331]. Kombinacija
TVS i FFT daje najbolje rezultate u predviđanju PP [332]. Naravno da se i neki drugi faktori
moraju uračunati jer se rizik povećava kod pacijentkinja koje su imale prethodni PP [333].
Generalno možemo reći da grlić duži od 25 mm i negativan FFT u periodu između 24. i 32. n.
g. znači da je mala verovatnoća porođaja pre 37. n.g [334]. Terapija progesteronom ili stavljanje
serklaža značajno smanjuje učestalost PP [335-339]. Fonseca i sar. [340] su pokazali da
primena vaginalnog progesterona kod trudnica sa dužinom grlića ˂15 mm, smanjuje rizik od
PP za oko 44%. Druga randomizovana klinička studija kod pacijentkinja čija je dužina grlića
bila između 10-20 mm i koje su lečene vaginalnom primenom progesterona pokazala je
smanjenu učestalost PP pre 33. n.g. za 45%, za 38% smanjen je procenat PP pre 35. n.g., dok
je ovaj procenat za PP pre 28. n.g. iznosio 50%. Metaanaliza pet randomizovanih kliničkih
ispitivanja pokazala je da vaginalna primena progesterona ne smanjuje samo učestalost PP nego
i ukazuje na smanjenu učestalost respiratornog distres sindroma i mnogo manje komplikacija u
postnatalnom periodu [341-351]. Dosadašnja ispitivanja (ne uzimajući u obzir fetalni
fibronektin) nisu pokazala nikakvu značajniju udruženost ili bolje rezultate kada se TVS
kombinuje sa drugim prediktorima PP. Poslednjih decenija uloženi su ogromni napori i urađena
brojna ispitivanja u pokušajima da se pronađe biohemijski marker koji bi mogao predvideti PP.
Svakako da po broju prednjače različiti markeri infekcije i/ili zapaljenja s obzirom na
epidemiološke podatke i infekciju kao najvažniji faktor rizika za PP. Ipak interesantno je da se
u tom „moru“ različitih supstanci veoma retko, bolje rečeno sporadično, pojavljuju PMN za
koje smo videli da su jedan od najznačajnijih faktora u svakom zapaljenskom odgovoru. Tako
smo našli samo jednu studiju koja se odnosi na broj PMN u grliću materice i TVS, a nekoliko
drugih studija koje upoređuju ova dva parametra odnose se na broj PMN u amnionskoj tečnosti
kod pacijentkinja kojima je rađena amniocenteza [352-355].
44
2 RADNE HIPOTEZE
1. Novi metod mikroskopskog pregleda preparata vaginalnog sekreta bojenog po Gramu
na uvećanju x200 omogućava preciznije određivanje broja i vrsta ćelijskih morfotipova
u odnosu na trenutne metode na mikroskopskim uvećanjima x400 (Amsel) i x1000
(Nugent, Ison/Hay i Claeys), a time bolje rezultate u proceni stanja vaginalne flore i
rizika od PP.
2. Povećano preživljavanje vaginalnih PMN, zbog smanjene apoptoze kod trudnica
između 24. i 28. nedelje trudnoće, pozitivno koreliše sa prisustvom vaginalne infekcije
i/ili zapaljenja, koncentracijama prozapalјenjskih citokina (IL-1β i TNFα) i lokalnog
Th17 (IL-17A, IL-22) i Th9 (IL-9) imunskog odgovora, a u negativnoj je korelaciji sa
nivoom imunoregulatornog citokina IL-10.
3. Metodologija semikvantitaivnog određivanje broja PMN na preparatu bojenom po
Gramu i mikroskopskom uvećanju x200 je bolji metod u proceni broja PMN u brisu
vaginalnog sekreta od semikvantitativnih metoda na uvećanjima x400 i x1000 i dve
kvantitativne metode.
4. Broj i vijabilnost vaginalnih PMN bolji su pokazatelji rizika za PP od dijagnostikovanih
poremećaja vaginalne flore, koncentracije ispitivanih citokina i dužine grlića materice
2.1
CILJEVI
1. Na osnovu nalaza novog metoda mikroskopskog pregleda preparata vaginalnog sekreta
bojenog po Gramu na uvećanju x200 i semikvantitativne procene prisustva, broja i
odnosa različitih bakterijskih morfotipova, predložiti novu klasifikaciju vaginalne
mikroflore i uporediti je sa postojećim dijagnostičkim kriterijumima i podelama po
Amsel-u, Nugent-u, Ison/Hay-u i Claeys-u.
2. Utvrditi i uporediti broj PMN u vaginalnom sekretu trudnica između 24. i 28. nedelje
trudnoće pomoću semikvantitativnih metoda na mikroskopskim uvećanjima x200, x400
i x1000 i dve kvantitativne metode.
3. Utvrditi i uporediti vijabilnost, apoptozu i broj vaginalnih PMN dobijen različitim
kvantitativnim i semikvantitativnim metodama.
4. Utvrditi povezanost između stepena apoptoze vaginalnih PMN i grupa pacijentkinja sa
različitim stanjima vaginalne mikroflore definisanih na osnovu standardnih i
novopredloženih kriterijuma.
45
5. Izmeriti koncentracije Th1 (IL-2, IFN-γ, IL-12 p70), Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13), Th17
(IL-17A, IL-22), Th9 (IL-9), proinflamacijskih citokina (IL-1β, TNFα) i
imunoregulatornog IL-10.
6. Utvrditi međusobnu povezanost broja, vijabilnosti i apoptoze vaginalnih PMN sa
koncentracijama ispitivanih citokina i rezultatima mikroskopskih ispitivanja preparata
vaginalnog sekreta i ultrazvučnog merenja dužine grlića materice.
7. Utvrditi međusobnu povezanost broja, vijabilnosti i apoptoze vaginalnih PMN,
koncentracija ispitivanih citokina, rezultata mikroskopskih ispitivanja preparata
vaginalnog sekreta i ultrazvučnog merenja dužine grlića materice sa učestalošću PP u
ispitivanoj populaciji trudnica.
46
2.2
PACIJENTKINJE I METODI
Prospektivna studija u koju su bile uključene 732 trudnica između 24. i 28. nedelje trudnoće.
Svim pacijentkinjama pregled smo zakazivali jedan do dva meseca unapred i sve pacijentkinje
su bile bez znakova i simptoma PP ili drugih tegoba. U studiju nisu uključivane trudnice mlađe
od 18 i starije od 40 godina, trudnice sa multiplom trudnoćom, anomalijama uterusa,
prethodnom konizacijom ni one koje su već imale jedan ili više PP, one koje su koristile bilo
kakvu terapiju dve nedelje pre uzimanja uzoraka ili imale seksualne odnose 7 dana pre
uzimanja uzorka. Pre bilo kakvog vaginalnog pregleda u vaginu smo stavljali sterilan spekulum
bez upotrebe lubrikansa i kliničkim pregledom konstatovali količinu, konzistenciju i boju
vaginalnog sekreta i površinu ektopije grlića materice. Odmah posle uvođenja spekuluma u
početni deo cervikalnog kanala stavljali smo štapić sa dakronom tokom 1 min do saturacije. Sa
bočnog vaginalnog zida uzimali smo 3 uzorka

Prvi uzorak nanosili smo na mikroskopsku pločicu dimenzija 76,2x25,4 mm blagim
kotrljanjem štapića po dužini, stavljali jednu kap fiziološkog rastvora i preko nje
pokrovno staklo, posle čega smo preparat pregledali pod faznokontrastnim
mikroskopom na uvećanju x400. Po završetku mikroskopskog pregleda na isti preparat
dodavali smo kap 10% KOH u cilju lakše vizuelizacije spora i/ili hifa gljivica. Pri
istovremenom stavljanju fiziološkog rastvora i 10% KOH na dva kraja pločice sa dva
pokrovna stakalaca, u najvećem broju slučajeva 10% KOH prolazio i do drugog dela
pločice i činio preparat neupotrebljivim za dalje ispitivanje.

Drugi uzorak smo na isti način razmazivali na pločicu, sušili na vazduhu, bojili po
Gramu i arhivirali.

Treći uzorak sa bočnog vaginalnog zida smo stavljali u epruvetu sa 1 ml fiziološkog
rastvora i odnosili u citološku laboratoriju radi kvantifikativnog određivanja broja PMN
(QPMN-B)
- Proba sa 10% KOH: Kod svih pacijentkinja radili smo probu sa 10% KOH tako što smo na
štapić sa uzorkom sa bočnog vaginalnog zida stavljali 1 kap KOH i konstatovali ili isključili
prisustvo mirisa pokvarene ribe.
- Vaginalni pH određivali smo papirnim testovima (Merck pH raspona od 4,0 do 7,0).
Saturisani dakronski štapić iz grlića stavljali smo u 1 ml odgovarajućeg medijuma i najduže
posle 2 časa odnosili u imunološku laboratoriju, centrifugirali i zamrzavali na temperaturi 80
do određivanja koncentracija citokina.
47
Potom smo uzimali bris iz grlića istim štapićem sa bočnog vaginalnog zida i u roku od
najduže 3 časa odnosili u mikrobiološku laboratoriju gde su ga zasejali na podlogu sa krvnim
agrom, a sa istog uzoraka pravi razmaz na mikroskopskoj pločici sušili na vazduhu i bojili po
Gramu, posle čega ga je tumačio nadležni mikrobiolog.
Na kraju, posle uzimanja vaginalnih i cervikalnih briseva, u vaginu smo ubrizgali 20 ml
sterilnog fiziološkog rastvora, ostavili 5-10 s i potom aspirirali delom infuzionog seta
napravljenim za ovo ispitivanje, stavljali u veliku epruvetu i najduže posle 3 h slali u nadležnu
imunološku laboratoriju radi kvantitativnog određivanja broja PMN (QPMN-A) i procenta
apoptoze, odnosno vijabilnost PMN.
Po završenom pregledu kod svih pacijentkinja je urađen ultrazvučni pregled radi
određivanja gestacione starosti trudnoće, kao i pregled vaginalnom sondom radi merenja dužine
grlića materice.
2.3
PROCENA STANJA VAGINALNE FLORE - MIKROSKOPSKI NALAZ
2.3.1 Mikroskopski pregled nativnog preparata ( X400 )
Preparat razblažen jednom kapi fiziološkog rastvora posmatran je pod faznokontrastnim (FK)
mikroskopom na uvećanju x400 tako što je na preparatu gledano najmanje 50 vidnih polja (VP),
na sredini i dva kraja preparata i procenjivan odnos između broja laktobacilarnih i sitnih
bakterijskih formi i detektovano prisustvo specifičnih uzročnika infekcije kao što su T.
vaginalis i C. albicans, citolize, parabazalnih ćelija, eritrocita, i broj polimorfonukleara (PMN).
Preparat NPVS smatrali smo odgovarajućim ako je najmanje 8 epitelnih ćelija (EĆ) prisutno u
VP na uvećanju x400.
- Laktobacilarne forme (LBF): Forme koje se na faznokontrastom mikroskopu vide kao ravni
ili blago zakrivljeni štapići, ravnih krajeva, nepokretni, različite širine ili dužine, koji ponekad
adheriraju ili su smešteni u obliku palisada definisali smo kao štapićaste forme (ŠF) i oni
odgovaraju laktobacilima ili laktobacilarnoj flori drugih autora.
- Sitne bakterijske forme (SBF): Ovaj termin smo koristili da opišemo prisustvo različitih
morfoloških formi sitnih bakterija, kao što su kokobacili, vrlo mali bacili (engl. tiny rods) i
pokretni zakrivljeni bacili (engl. mobile curved rods) koji se često nalaze zajedno. One su
znatno manje od laktobacila i često prianjaju jedni za druge formirajući grudvice ili splavu
slične formacije koje plutaju između epitelnih ćelija. Vaginalne EĆ čije se ivice ne vide jasno
48
jer su prekrivene velikim brojem kokobacila koji adheriraju za njihovu površinu identifikovali
smo kao clue ćelije (engl. clue cells, CC). Sitne zakrivljene bakterije, koje se kreću praveći
spiralne putanje pretpostavljali smo da predstavljaju Mobilncus species.
NORMALAN NALAZ – Predominaciju LBF u odnosu na SBF uvek smo svrstavali u
normalan nalaz i u slučajevima kada je jedan od dva testa (KOH test, pH˃4,5) bio pozitivan,
nismo imali slučajeve sa oba pozitivna testa i predominatnom laktobacilarnom florom (Slika
2.1).
BAKTERIJSKA VAGINOZA - Dijagnozu BV postavljali smo na osnovu
modifikovanih Amselovih kriterijuma. Originalni Amselovi [214] kriterijumi podrazumevaju
pozitivna tri od četiri znaka: 1) pojačana, homogena sivo beličasta sekrecija; 2) pozitivan test
sa 10% KOH (neprijatan miris ribe); 3) vaginalni pH preko 4,5; 4) mikroskopski nalaz: najveći
broj autora podrazumeva prisustvo CC, a neki smatraju da broj CC treba da bude veći od 20%
posmatranih ćelija (najmanje jedna od pet ćelija, na najmanje četiri vidna polja), da bi se
postavila dijagnoza BV (Slika 2.2). S obzirom na višegodišnje iskustvo u gledanju NPVS
odavno smo primetili da se značajan procenat pacijentkinja (20-30%) nalazi između ova dva
nalaza, definisanih kao predominantna LBF ili prisutne CC. Ove pacijentkinje bi mogli da
podelimo u dve grupe.
Prvoj bi pripadale one koje imaju manji broj LB i SBF, obično podjednak ili sa malo
većim brojem jednih ili drugih formi (Slika 2.3).
Drugoj grupi bi pripadale pacijentkinje sa izrazito smanjenim brojem i LBF i SBF tako
da preparat deluje kao ispran fiziološkim rastvorom, čist, samo sa EĆ (hipocelularan nalaz), sa
vrlo malim brojem laktobacila i sitnih bakterijskih formi.
U slučajevima kad su SBF brojnije ili čak podjednake sa LBF, ili kada je preparat hipocelularan
(mali broj ili potpuno odsutna LBF, kao i mali broj SBF), a pacijentkinja ima druga dva
pozitivna testa, vaginalni pH˃4,5 i pozitivna KOH test, postavljali smo dijagnozu BV, bez
obzira što nije bilo CC ili pojačane homogene sivobeličaste sekrecije. Dakle, prisustvo CC na
NPVS i pojačana homogena sivobeličasta sekrecije nisu bili deo našeg dijagnostičkog skora za
dijagnozu BV. Sve pacijentkinje su na osnovu nalaza NPVS dobijale odgovarajuću terapiju.
Tako su pacijentkinje sa BV i prisutnim clue cells lečene metronidazolom 2x500 mg 7 dana uz
istovremenu lokalnu primenu prebiotika + acidifikant, dok su pacijentkinje bez clue cells i
hipocelularnim nalazom bez obzira na dva pozitivna ili negativna testa (pH i KOH) takođe
dobijale prebiotik sa acidifikantom. Pacijentkinje kod kojih su na NPVS sa 10% KOH
detektovane spore ili hife gljivica tretirane su antimikotičkom terapijom.
49
Slika 2.1: Predominatna laktobacilarna flora, nalaz normalan (NPVS, FK X400)
Slika 2.2: Tipične clue cells (CC), nema laktobacila, bakterijska vaginoze (NPVS, FK X400)
50
Slika 2.3: Podjednak broj laktobacila i sitnih bakterijskih formi, nalaz graničan i dijagnoza zavisi od
rezultata pH i KOH testa (NPVS, FK X400)
Slika 2.4: Hipocelularan preparat sa malim brojem bakterijskih formi, izgleda kao ispran, čist; dijagnoza
zavisi od rezultata pH i KOH testa (NPVS, FK X400)
51
Pacijentkinje sa povećanim brojem PMN kod kojih nismo detektovali gljivice a kod kojih smo
mikroskopski našli predominaciju SBF ili podjednak broj laktobacila i sitnih bakterijskih formi
dobijale su terapiju Eritromicin 500 mg 4x1 7 dana jer smo smatrali da se kod ovih pacijentkinja
radi o aerobnom vaginitisu (AV).
2.3.2 Bojenje po Gramu
Preparat osušen na vazduhu fiksirali smo u metanolu ili na plamenu, potom na preparat stavljali
kristal violet (1 min), isprali ga blagim mlazom destilovane vode, pa naneli Lugolov rastvor (1
min), isprali pod blagim mlazom vode, zatim obezbojili acetonom ili 96% alkoholom (5-15 s),
isprali vodom, stavili sarfarin (1 min), isprali vodom i osušili. Pregled mikroskopskog preparata
bojenog po Gramu na uvećanju x1000 rađen je na osnovu kriterijuma po Nugentu, Ison-Hayu i
Claeysu.
2.3.2.1 Metodologija po Nugentu
Pod imerzijom (uvećanje x1000) gledali smo 5 nesusednih, slučajno odabranih VP na kojima
smo beležili prisustvo i broj štapićastih Gram pozitivnih morfotipova (laktobacili), zatim Gram
negativnih ili Gram varijabilnih kokobacilarnih morfotipova (Gardnerella, Bacteroides
morfotip) kao i broj zakrivljenih Gram varijabilnih formi (Mobilluncus morfotip). Površina VP
mikroskopa na kome smo gledali preparate (Leica DM 2000 LED, okular 10x22, sočivo
100x1,25, prečnik 0,21mm) iznosi 0,035 mm2. Broj bakterijskih morfotipova razlikuje se u
odnosu na originalnu Nugentovu podelu [208] jer je određivan za površinu vidnog polja od
0,035 mm2 kako je to predloženo od strane Larssona i sar. [356] (Tabela 2.1). Gleda se 5 VP, i
na osnovu broja morfotipova određuje broj bodova, da bi u konačnom zbiru pacijentkinje bile
podeljene u tri grupe: Normalan nalaz (0-3 bodova); Intermedijaran nalaz ( 4-6 bodova) i
Bakterijska vaginoza (7-10 bodova) (Slike 2.5 - 2.8).
Tabela 2.1: Nugentov skor sa brojem morfotipova za površinu vidnog polja 0,035 mm2,
adaptirano na osnovu Larssona i sar. [356]
Broj
Laktobacili
Bodovi
0
0-2
2-8
10-49
˃50
4
3
2
1
0
Broj
Gardnerella
Bacteroides
˃50
10-49
2-8
0-2
0
Bodovi
4
3
2
1
0
Broj
Mobiluncus
bodovi
˃10
2-10
0
2
1
0
Nugentov
zbir
10
8
5
3
0
Dijagnoza
BV= 7-10
INT= 4-6
NOR= 0-3
LB: Gram pozitivne štapićaste forme, laktobacilarna flora; GV: Gardnerela vaginalis; BS: Bacteroides spp; MB: Mobiluncus spp.,
zakrivljeni Gram varijabilni morfotip
52
Slika 2.5: Predominantna laktobacilarna flora, zbir po Nugentu = 0, nalaz normalana (Gram X1000)
Slika 2.6: Zbir po Nugentu = 6, nalaz intermedijaran (Gram X1000)
53
Slika 2.7: BV full
Slika 2.8: Nugentov zbir=9;Bakterijska vaginoza, bez clue cells
54
2.3.2.2 Metodologija po Ison i Hayu
Metodologija po Ison i Hayu [357] slična Nugentovoj kada se radi o ćelijskim morfotipovima
samo se ovde oni ne broje nego se radi o semikvantitativnoj proceni odnosa pomenuta tri
bakterijska morfotipa. Pored tri kategorije koje su identične Nugentovoj podeli (normalan,
intermedijaran i BV), autori su dodali još dve: jedna definisana kao nulta (grade 0) koja se
karakteriše prisustvom samo EĆ bez bakterija u našim tabelama „ČIST NALAZ“. Druga (grade
IV) koju opisuju kao grupu kod koje su EĆ prekrivene samo G+ kokama, u našim tabelama
„KOKE“ (Slike 2.9 i 2.10).
2.3.2.3 Metodologija po Claeysu
Verhelst i sar. [216] su napravili novu podelu poznatu i kao klasifikacija po Claeysu koja ima
6 grupa. Ova klasifikacija suštinski predstavlja modifikaciju klasifikacije po Ison i Hayu, u
kojoj su je izostavljena grupa pacijentkinja koju su Ison i Hay definisali kao grade 0, a
uspostavljene su i dve nove grupe. Prva, koja originalno nosi naziv grupa I PMN ili grupa Ilike, a koja je u našim tabelama označena kao “SLIČAN NORMALNOM” a koja se karakteriše
prisustvo Gram pozitivnih oblika, koji mogu biti sasvim mali i kratki, ili izrazito dugački, ali
nepravilnih oblika sa tendencijom grananja, i obično širokim i debelim, zatupastim krajevima
(clubbing) i zakrivljenim ivicama, a često se i neregularno boje, raspoređeni tako da često prave
oblike slične kineskom pismu (Slika 2.11). Druga grupa se karakteriše prisustvom velikog broja
PMN uz istovremeno prisustvo normalnog broja laktobacila, koju autori nazivaju i idiopatskom
leukorejom, a koja je u našim tabelama obeležena kao “LEUKOREJA”. Da bi pacijentkinju
svrstali u ovu Grupu neophodno je isključiti gljivični infekciju (Slika 2.12)
55
Slika 2.9: Podela po Ison/Hayu originalno Grade 0, u našem ispitivanju i tabelama “ČIST NALAZ”
Slika 2.10: : Podela po Ison/Hayu originalno Grade IV, u našem ispitivanju i tabelama “KOKE”
56
Slika 2.11: Podela po Claeysu- Originalno Grupa I-like, u našem ispitivanju ; “sličan normalnom” i
BIFIDO forme; štapićaste forme sa zatupastim (batičastim krajevima koje se neravnomerno boje (x1000)
Slika 2.12: Podela po Claeysu- Originalno Grupa I-PMN, u našem ispitivanju i tabelama “LEUKOREJA”
57
Mikroskopski pregled preparata po Gramu (X200) – nova podela (NP)
Svakako najznačajnija razlika naše metodologije u odnosu na postojeće je činjenica da se
preparat bojen po Gramu posmatra na uvećanju od x200 za razliku od pomenutih metodologija
koje koriste uvećanje x1000. Površinu naše mikroskopske pločice na koju razmazujemo
vaginalni bris je 1935 mm2 (25,4x76,2 mm). Ako pretpostavimo da je prosečno najmanja
obojena površine na takvoj pločici oko 1/3 njene ukupne površine, onda je to oko 600 mm 2.
Druge merne podatke koje smo izračunali, a za koje smo smatrali da bi mogli biti korisni za
naše ispitivanje prikazali smo u Tabeli 1.2.
Pošto su svi preparati nekoliko puta (3-5 puta) gledani pod imerzijom, radi dobijanja adekvatne
mikroskopske slike i na uvećanju x200 stavljali smo imerziju i onda mikroskopirali. Imerzija
nije neophodna ukoliko se preparat po Gramu gleda prvi put, ali mi je stavljamo i u takvim
slučajevima jer tokom pregleda uvek određen broj VP gledamo i na uvećanju x1000. Na dva
kraja i sredini preparata gledali smo 50-70 VP, dakle ukupno oko 150-200 VP (200/700 =
0,28%), što je oko 286x veći broj VP nego kada gledamo 20 VP na uvećanju x1000 (20/17000
= 0,001%). Dakle, površina obojenog dela preparata koju gledamo ovom metodologijom je za
oko 200 do 300 x veća od površine na uvećanju x1000. (Slika 2.13)
Slika 2.13: Površina jednog vidnog polja uvećanja X200 odgovara površini 25 vidnih polja uvećanja
X1000
58
Daljim ispitivanjima i morfometrijskim analizama na 50 preparata bojenih po Gramu došli smo
do zaključka da je najmanja dužina koja se na mikroskopskom uvećanju x200 još može
raspoznati kao štapićasta forma (ŠF) iznosi 1,5 μm (Slika 2.14 i 2.15). Na različitim uvećanjima
granica da li se nešto vidi ili ne vidi kao štapić je različita i ona je na x200 oko 1,5 μm, na x400
je oko 1 μm, a na uvećanju x1000 oko 0,5 μm (Slike 2.16 i 2.18).
Slika 2.14: Na uvećanju X200 forme dužine do 1,5 mikrona se raspoznaju kao štapićaste (vidi kursor)
59
Slika 2.15: Na uvećanju X200 forme manje od 1,5 mikrona se ne raspoznaju kao štapićaste već kao
neštapićaste forme (NŠF) (vidi kursor)
Slika 2.16: Na uvećanju X400 i forme dužine do 1 mikrona se vide kao štapićaste tako da je na ovom
uvećanju generalno teža diferencijacija štapićastih od neštapićastih formi (vidi kursor)
60
Slika 2.17: Na uvećanju X1000 i forme dužine 0,5 mikrona se raspoznaju kao štapići (vidi kursor)
Slika 2.18: Na uvećanju X1000 i forme dužine 0,5 mikrona se raspoznaju kao vrlo kratki štapići , a dužina
oko 2 mikrona kao duže štapićaste forme (vidi kursor)
61
Slika 2.19: Flora udružena sa bakterijskom vaginozom (BVAB) većina formi je manja od 1,5 mikrona
(Gram preparat, X1000)
Slika 2.20: Preparat po Gramu uvećanje X200: ne vide se štapićaste forme ili su retke, većina manja od
1,5 mikrona, prdominacija NŠF - nalaz karakterističan za BV-FULL
62
Slika 2.21: Uvećanje X200 vidi se dosta Grampozitivnih štapićastih formi, nalaz odgovara Normal FULL
Slika 2.22: Uvećanje X200 vidi se nešto manje Grampozitivnih štapićastih formi, nalaz odgovara Normal
MID
63
Slika 2.25: Kompjuterska analiza slike i merenje dužine bakterijskih morfotipova kod pacijentkinja sa
bakterijskom vaginozom (GSA Image Analyser (GSA Gesellschaft für Softwareentwicklung und Analytik
mbH, Germany)
Slika 2.24: Kompjuterska analiza slike i merenje dužine bakterijskih morfotipova kod pacijentkinja sa
normalnim nalazom (GSA Image Analyser (GSA Gesellschaft für Softwareentwicklung und Analytik
mbH, Germany)
Slika 2.23: Deo izveštaja dobijen nakon analize slike primenom GSA Image Analysera
64
Morfometrijskim i uporednim ispitivanjima na uvećanjima x200 i x1000 merili smo dužinu
bakterijskih morfotipova kod pacijentkinja s normalnim nalazom i pacijentkinja sa BV, i
utvrdili da je prosečna dužina bakterijskih formi kod pacijentkinja sa normalnim nalazom oko
3 µm, dok je kod pacijentkinja sa BV dužina manja od 1µm (Slike 2.19 – 2.22).
Mada je merenje na mikroskopu precizno da bi isključili faktor subjektivnosti odlučili smo se
za kompjutersku analizu slike kod pacijentkinja sa normalnim nalazom i onih sa BV. U
ispitivanju
smo
koristili
softver
GSA
Image
Analyser
(GSA
Gesellschaft
für
Softwareentwicklung und Analytik mbH, Germany). Analizirane su fotografije 10 pacijentkinja
kod kojih je na osnovu Amselovih kliničkih kriterijuma i Nugentovih kriterijuma postavljena
dijagnoza BV ili normalnog nalaza. Naši rezultati su pokazali da je dužina bakterijskih formi
kod pacijentkinja sa normalnim nalazom uvek preko 2µm, dok kod pacijentkinja sa BV nikada
nije bila veća od 1,3 µm  još jedna potvrda da dužina može biti jedini parametar u razlikovanu
normalne (laktobacilarne) od patološke vaginalne flore (BVAB). Ovi rezultati su takođe
potvrdili važnost činjenice da se na mikroskopskom uvećanju x200 forme duže od 1,5 µm
prepoznaju kao štapići, dok gledanjem na uvećanju x400 forme dužine 1 µm se vide kao štapići
što onda otežava razlikovanje laktobacila od BVAB (Slike 2.23 – 2.25).
Tabela 2.2: Površina VP mikroskopa na kome smo mi radili na različitim uvećanjima i površine od značaja
za naše ispitivanje
P
Broj EC/
Broj
Broj VP/
Prečnik R
Leica DM
kruga=r2π
Površine
2
2000 LED
VP
PMN/VP 600 mm
(mm)
2
(mm )
X1000
0,035
3-17/4
700/4
≈17 500
0,21
Pločica=1935 mm2
X 400
0,22
20-110/24
4/400
≈2 800
0,53
EĆ ≈ 0,002 mm2
X 200
0,88
70-425/100
≈ 700
1,06
PMN ≈0,00005
mm2
65
Kako smo na osnovu merenja i kompjuterske analize mikroskopskih fotografija utvrdili da
dužina bakterijskih formi može biti jedini, i dovoljan, parametar u razlikovanju zdrave i
patološke flore sve pacijentkinje su podeljene u dve kategorije:
Štapićaste forme (ŠF)- Forme koje se na uvećanju x200 prikazuju kao štapićaste i lako
zakrivljene forme, različite dužine (podrazumeva se da je dužina veća od 1,5 µm) debljine, i
intenziteta bojenja, tumačili smo kao zdravu vaginalnu floru, odnosno laktobacile. Dakle, iako
verujemo da u najvećem broju slučajeva ove forme predstavljaju različite sojeve laktobacila,
namerno smo izbegli naziv laktobacilarna flora, jer na osnovu mikroskopskog nalaza ne
možemo, tvrditi da sve ove štapićaste forme predstavljaju laktobacile, zbog čega smo mislili da
je korektnije koristiti naziv ŠF.
Neštapićaste forme – (NŠF) Forme koje se na uvećanju na x200 ne prikazuju kao štapići, nego
su kokobacilarnog ili kokoidnog oblika, a čija je dužina kao što smo rekli manja od 1,5 μm,
nazvali smo neštapićaste forme (NŠF), i pod ovim uglavnom podrazumevamo bakterijsku floru
udruženu sa BV (BVAB) ali ne i koke (vidi kasnije, koke).
Ova podela na ŠF i NŠF može da se primeni samo na mikroskopskom uvećanju x200, ali ne i
na x400 i x1000, jer se tamo i kraće bakterijske forme prikazuju kao štapići, tako da se
mikroskopski kriterijumi na ovim uvećanjima drugačiji.
Dakle odnos ove dve forme na neki način predstavlja podlogu ili pozadinu svakog
mikroskopskog preparata i na ovaj način razlikujemo dva entiteta, normalan nalaz i BV, a sve
ostale bakterijske forme ili ćelijski elementi nalaze se kao „nadgradnja“ ovoj podlozi. Tako
spore i/ili hife gljivica možemo naći na svakoj od naših 6 „pozadina“, a zajedno sa gljivicama
se može naći veći ili manji broj PMN i time imamo značajan problem u pokušaju da
pacijentkinje razvrstamo u homogene grupe. Pored ove dve osnovne forme tokom
mikroskopskog pregleda beležili smo prisustvo još tri bakterijska morfotipa koji su se nametnuli
tokom ispitivanja svojom učestalošću i/ili karakterističnom mikroskopskom slikom:
MORFOTIP BIFIDO – Ove mikroskopske forme najbliže su mikroskopskom nalazu koje su
Verhelst i sar. [216] u svom ispitivanju definisali kao grupu I-like (vidi podela po Claeysu).
Kako su autori u svom radu [216] pokazali da je u ovoj grupi nađen značajno veći broj
66
Bifidobacteria (preko 50% u odnosu na druge grupe, mi smo u našem ispitivanju pacijentkinja
sa ovakvim ili sličnim nalazom definisali kao „BIFIDO“ grupu (Slike 2.27- 2.36)
Slika 2.26: I na uvećanju x200 vide se Gram pozitivne forme različite veličine i oblika, od koka do dužih
štapića, utisakj grananja, zakrivljen, oblici V, T, Z, X, mrljaste forme tako da je čitava slika polimorfna
67
Slika 2.27: Uvećanje X1000 forme nepravilnog oblika, neravnomerno se boje, sa zatupastim (batičastim)
krajevima, neke oblici formiraju lance
Slika 2.28: Uvećanje X 200 polimorfana nalaz sa Gram pozitivnim formama različitih veličina i oblika,
polimorfana nalaz koji ukazuje na prisustvo Bifido ili Coryneobacteria
68
Slika 2.30: Kinesko pismo” Bifidobacteria ili Corynebacteria
Slika 2.29: Nalaz “sličan normalnom” , predominiraju Gram pozitivne ŠF; može se uočiti da je čitava
slika polimorfna (Gram X200), ali se razlika može uvideti tek na uvećanju x 1000 “
69
Slika 2.31: Isti nalaz na uvećanju X1000 štapićaste Gram pozitivne forme sa batičastim krajevima koje se
neravnomerno boje
Slika 2.32: I na uvećanju x200 i X1000 tesko je razlikovati laktobacile od bifdobakterija, korinebakterija,
aktinomiceta. Dosta PMN. (Gram x200)
70
Slika 2.34: Isti nalaz na uvećanju X1000 štapićaste i zakrivljene Gram pozitivne forme ravnih krajeva
koje ukazuju na laktobacilarnu floru
Slika 2.33: Izrazito Gram pozitivne forme, sa tendencijom grananja , nepravilnih oblika, zakrivljeni ,
polimorfnog izgleda (X1000)
71
MORFOTIP LEPTO Štapićaste ili manje ili više zakrivljene forme, različite debljine i
različitog bojenja po Gramu (G+ ili G-) čija je dužine preko 20 μm (Slike 2.36-2.40).
Slika 2.35: Ravne i blago zakrivljene forme koje se neravnomerno boje sa zatupastim krajevima
raspoređene u parovima i palisadama (X1000)
72
Slika 2.36: LEPTO forme (Gram X1000)
Slika 2.37: “Biopsija” preparata po Gramu i uzorak za PCR bi možda mogle da definišu šta
vidimo?Sneathia sanguinegens, Actinomyces, Fusobacteriumili ekstremno dugačke laktobacile? (Gram
X200)
73
Slika 2.38: “Biopsija” preparata po Gramu i uzorak za PCR bi možda mogle da definišu šta vidimo
Sneathia sanguinegens, Actinomyces, Fusobacterium; vidi se i dosta PMN (Gram X200)
MORFOTIP KOKE Pod ovim morfotipom podrazumevali smo nalaz na kome vidimo izrazito
Gram pozitivne, okrugle (tačkaste) forme, veličine od 0,2-1m. Na uvećanju x200 vide se kao
sitne, tačkaste forme, brojne, ali nisu slepljene, kao što je to slučaj sa BVAB (Slika 2.41 i 2.43).
Na sledeće tri fotografije (Slika 2.44-2.46) vidimo kako u susednim “regionima” broj koka
može bitno da se razlikuje. Ćelije prekrivene kokama koje smo nazvali koka ćelije (coccae
cells) treba razlikovati od clue cells kod BV. Tokom ispitivanja primetili smo da se na uvećanju
x200 mogu videti ćelije koje su obojeno plavo koje smo nazvali plavim ćelijama („blue cells”),
a koje su patognomonične za prisustvo koka na uvećanju x200 preparata bojenog po Gramu. U
ovom ispitivanju mikroskopskim nalazom pozitivnim na koke smatrali smo pacijentkinje kod
kojih smo na oko 100 vidnih polja nalazili preko 5 regiona bogatim kokama.
74
Slika 2.39: Bakterijska vaginoze sa tipičnim clue cells, tako da se rubovi epitelnih ćelija ne raspoznaju, a
često se vidi
Slika 2.40: Veliki broj koka, ali se rubovi ćelija jasno vide, tako da treba razlikovati “clue cells” od
koka ćelija (“coccae cells”) kako su nazvane u ovom radu
75
Slika 2.41: Veliki broj koka, ali se rubovi ćelija jasno vide, tako da treba razlikovati clue cells od koka
ćelija (coccae cells) kako su nazvane u ovom radu
Slika 2.42: Veliki broj koka, ali se rubovi ćelija jasno vide, utisak o broju koka bolji na uvećanju x200, jer
su koke često raspoređene po “regionima” (vidi dalje)
76
Slika 2.43:Vidno polje uvećanje x200: epitelne ćelije i Gram pozitivne štapićaste forme, koke retke
(“region bez koka”), ali odmah do njega susedno vidno polje
Slika 2.44: …susedno vidno polje sa velikim brojem koka, što objašnjava raspored koka po regionima i
potvrđuje značaj gledanja preparata na manjem uvećanju
77
Slika 2.46: Koke se nekad veće nepravilnih oblika ili se ne boje, ali su najšešće izrazito Gram pozitivne
Slika 2.45: Plave ćelije (blue cells) patognomonične za prisustvo koka na preparatu, često idu sa
povećanim brojem PMN i CA
78
Na osnovu semikvantitativne procene broja bakterijskih formi koje se na uvećanju x200 vide
kao štapićaste forme (ŠF) i neštapićaste forme (NŠF) svi mikroskopski nalazi podeljeni su u 3
grupe, koje smo nazvali „FULL“ , „MID“ i „NULL“ kao što je to prikazano na Slici 2.47.
„FULL“ - označava hipercelularni preparat, prisustvo velikog broja bakterijskih formi (ŠF ili
NŠF) koje se nalaze na čitavom preparatu, dakle kako u međuprostorima epitelnih ćelija, oko
EĆ, a i u samim nakupinama EĆ. (Slika 2.47:c i f).
„MID“ označava prisustvo manjeg broja ovih formi koje su ređe ili ih nema u međuprostorima
EĆ, uglavnom se nalaze oko i u nakupinama EĆ, ali u značajno manjem broju nego kod
prethodne grupe (Slika 2.47:b i e).
„NULL“ predstavlja hipocelularni preparata, kategoriju u kojoj on deluje kao “čist”,
međuprostori su sa malo ili bez bakterijskih formi, a veoma mali broj se nalazi oko i u
nakupinama EĆ (Slika 2.47: a i d).
Slika 2.47: Shema koja pokazuje razlike u semikvantitativnoj proceni različitih bakterijskih morfotipova u
našem ispitivanju definisane kao NULL , MID i FULL
79
NOVA PODELA-6 GRUPA (NP-6G) - Kombinacijom ova dva kriterijuma pacijentkinje su
razvrstane u 6 grupa, i ova podela nosi naziv NOVA PODELA-6 GRUPA (NP-6G), i od kojih
su tri grupe normalne (N) i koje smo označili kao: normal full (NF), normal mid (NM) normal
null (NN), a druge tri su sa patološkim nalazom koje smo iz praktičnih i didaktičkih razloga
označili kao bakterijska vaginoza full (BVF), BV-MID i BV-NULL.
NF – Slike:2.50 i 2.51
NM – Slike:2.52 i 2.53
NM – Slike:2.54 i 2.55
BVF –Slike: 2.56 i 2.57
BVM – Slike: 2.58 i 2.59
BVN - Slike: 2.60 i 2.61
NOVA PODELA-3 GRUPE (NP-3G) - Koristili smo i podelu u tri grupe označenu u daljem
radu kao NP-3G. U ovoj podeli pacijentkinje sa nalazom NF i NM čine grupu pacijentkinja sa
normalnim nalazom, one sa nalazom BVF i BVM su grupa sa BV, dok pacijentkinje sa našim
nalazom NN i BVN se spajaju u jednu grupu, koja bi suštinski odgovarala Nugentovoj
intermedijarnoj grupi.
NOVA PODELA - 2 GRUPE (NP-2G) - S obzirom da se sve pacijentkinje dele na one sa
normalnim nalazom i BV, koristili smo i podelu u dve grupe koja je u označena kao NOVA
PODELA-2 grupe (NP-2G) i u ovakvoj podeli su pacijentkinje sa nalazom NF, NM i NN
svrstavane u jednu grupu normalnih (NORMAL), a one sa nalazom BVF, BVM i BVN u grupu
sa BV.
80
Slika 2.48: NORMAL FULL, predominacija štapićastih formi ( X200)
Slika 2.49: NORMAL FULL, predominacija štapićastih formi ( X200)
81
Slika 2.50: NORMAL MID predominacija štapićastih formi ali je njihov broj znatno manji nego kod
pacijentkinja sa nalazom NORMAL FULL( X200)
Slika 2.51: NORMAL MID predominacija štapićastih formi ali je njihov broj znatno manji nego kod
pacijentkinja sa nalazom
82
Slika 2.52: NORMAL NULL retke štapićaste forme ali ih je više nego neštapićastih formi, najteža
diferencijacija između normalnog i patološkog nalaza (X200)
Slika 2.53: NORMAL NULL preparat izgleda kao potpuno čist retke ŠF i odsutne neštapićaste forme zbog
čega je nalaz definisan kao NORMAL NULL
83
Slika 2.54: BV FULL sa tipičnim slikama “arhipelaga” i “peščanih staza” na uvećanju X200, štapćaste
forme se ne vide
Slika 2.55: BV FULL uvećanje x 200
84
Slika 2.56: BV MID broj neštapićastih formi značajno manji nego kod pacijentkinja sa BV FULLL (x200)
Slika 2.57: BV MID broj neštapićastih formi značajno manji nego kod pacijentkinja sa BV FULLL
(X200)
85
Slika 2.58: BV NULL više neštapićastih od štapićastih formi, sve bakterijske forme u vrlo malom broju,
za precizniju diferencijaciju potreban nalaz kliničke slike, vrednosti pH i KOH testa (x200)
Slika 2.59: BV NULL štapićaste forme se ne vide, veći broj neštapićastih formi
86
2.4
ODREĐIVANJE BROJA VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA
Broj PMN na NPVS i uvećanje x400
Na uvećanju x400 gledali smo najmanje 10 VP, na sredini i dva kraja preparat, i na osnovu
semikvantitaivnog nalaza sve pacijentkinje podelili u 4 grupe:
Grupa 0: na preparatu nema PMN ili je njihov broj značajno manji od broja EĆ.
Grupa 1: PMN su prisutni na preko 50% vidnih polja, ali je njihov broj manji od broja EĆ.
Grupa 2: PMN se vide na većini vidnih polja i njihov broj je jednak ili nešto veći od broja EĆ
Grupa 3: PMN prisutni na većini vidnih polja i njihov broj je značajno veći od broja EĆ.
Grupe 0 i 1 smatrali smo normalnim nalazom, a grupe 2 i 3 patološkim nalazom.
2) Broj PMN na preparatu bojenom po Gramu, na uvećanjima x1000 i x200, određivan je po
istoj semikvantitativnoj formuli. Broj vidnih polja na uvećanju x1000 isti je kao kod Nugenta
(10 nesusednih VP), a na x200 kao u NPVS (na dva kraja i sredini preparat 50-70 VP). Ovakav
pristup zadržava isti proporcionalni odnos između EĆ i PMN, tako da su rezultati koje dobijemo
na različitim mikroskopskim uvećanjima lakše međusobno uporedivi. U literaturi nismo našli
podataka da je do sada broj vaginalnih PMN određivan na uvećanju x200.
Kvantifikacija CA
Činjenicu da su svi preparati po Gramu na uvećanju x1000 (3-4 puta) i x200 (2-3 puta) gledani
više puta iskorišćena je da pacijentkinje kod kojih su viđene spore ili hife gljivica podelimo u
tri kategorije full, mid i null. Podatak u kom gledanju smo videli CA na mikroskopskom
preparatu je bio najvažniji parametar u ovakvoj semikvantitativnoj podeli. Tako su u najvećem
broju slučajeva pacijentkinje kod kojih je CA viđena na uvećanju X1000 svrstane u kategoriju
CA FULL (CAF) i CA MID (CAM), dok su pacijentkinje kod kojih je CA nađena tek na
uvećanju x200 u najvećem broju slučajeva svrstane u grupu CA NULL (CAN). Pokušaji da na
neki način standardizujemo ovakav semikvantitativni pristup ostali su bezuspešni, jer se
pokazalo da je CA toliko neravnomerno raspoređena na mikroskopskom preparatu da ni broj
vidnih polja, ni odnos sa EĆ, niti bilo šta drugo ne omogućava da se napravi prihvatljiv obrazac
za semikvantifikaciju CA, kao što smo to uradili sa laktobacilima, BVAB ili PMN.
87
Slika 2.60: Polimorfonukleari grupa 0 ( PMN 0): na preparatu nema PMN ili je njihov broj značajno
manji od broja epitelnih ćelija (Gram x200)
Slika 2.61: Polimorfonukleari grupa 1 ( PMN 1): PMN su prisutni na preko 50% vidnih polja, ali je
njihov broj manji od broja epitelnih ćelija (Gram x200)
88
Slika 2.63: Polimorfonukleari grupa 2 ( PMN 2): PMN se vide na većini vidnih polja i njihov broj je
jednak ili nešto veći od broja epitelnih ćelija (Gram x200)
Slika 2.62: Polimorfonukleari grupa 3 ( PMN 3): PMN prisutni na većini vidnih polja i njihov broj je
značajno veći od broja epitelnih ćelija (Gram x200)
89
Slika 2.65: Polimorfonukleari grupa 1 ( PMN 1): PMN su prisutni na preko 50% vidnih polja, ali je
njihov broj manji od broja epitelnih ćelija (NPVS x400)
Slika 2.64: Polimorfonukleari grupa 0 (PMN 0): na preparatu nema PMN ili je njihov broj značajno
manji od broja epitelnih ćelija (NPVS x400)
90
Slika 2.66 Polimorfonukleari grupa 2 (PMN 2):PMN se vide na većini vidnih polja i njihov broj je jednak
ili nešto veći od broja epitelnih ćelija (NPVS x400)
Slika 2.67 Polimorfonukleari grupa 3 (PMN 3):PMN prisutni na većini vidnih polja i njihov broj je
značajno veći od broja epitelnih ćelija (NPVS x400)
91
Slika 2.68: Polimorfonukleari grupa 0 ( PMN 0): na preparatu nema PMN ili je njihov broj značajno
manji od broja epitelnih ćelija (Gram x1000)
Slika 2.69: Polimorfonukleari grupa 1 ( PMN 1): PMN su prisutni na preko 50% vidnih polja, ali je njihov
broj manji od broja epitelnih ćelija (Gram x1000)
92
Slika 2.71: Polimorfonukleari grupa 2 (PMN 2):PMN se vide na većini vidnih polja i njihov broj je jednak
ili nešto veći od broja epitelnih ćelija (Gram x1000)
Slika 2.70: Polimorfonukleari grupa 3 ( PMN 3): PMN prisutni na većini vidnih polja i njihov broj je
značajno veći od broja epitelnih ćelija (Gram x1000)
93
2.5
ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA
Priprema uzoraka
Uzorci vaginalnih ispiraka su sakupljeni u fiziološkom rastvoru u konusne tube od 50 ml.
Ćelijski elementi uzoraka su sakupljeni centrifugiranjem na 1600 rpm 10 minuta a supernatant
je odbačen. Na ćelijski pelet je dodat 1ml kompletnog RPMI medijuma sa 2% fetalnog telećeg
seruma (FCS, ICN, Costa Mesa, CA), Deo ćelija iz svakog uzorka je obojen 0.1% rastvorom
tripan-plavog u PBS-u što je omogućilo brojanje ćelija u komori po Bürker-Türk-u na
svetlosnom mikroskopu.
Metode detekcije apoptoze vaginalnih PMN
Procenat apoptotskih PMN je određen na osnovu više metoda koje uključuju analize ćelija u
ranom ili kasnom stadijumu apoptoze. Rani stadijumi apoptoze se odlikuju očuvanim
membranskim potencijalom i eksternalizacijom fosfatidil serina. Krajnji stadijumi apoptoze se
odlikuju kondenzacijom i fragmentacijom jedra kao i oslobađanjem apoptotskih tela. Stoga
ćelije u krajnjem stadijumu imaju manju količinu DNK od vijabilnih, diploidnih ćelija.
Metoda morfološke procene apoptoze
U prvom testu apoptoza PMN iz vaginalnog ispirka je određena morfološkom procenom na
svetlosnom mikroskopu. Ova metoda uključuje bojenje ćelija rastvorom Turk-a u 0.1%
sirćetnoj kiselini u fiziološkom rastvoru. Sirćetna kiselina fiksira i permeabilizuje ćelije, što
omogućava boji da se interaguje sa hromatinom (kompleksom proteina i nukleinskih kiselina).
Obojene ćelije su analizirane pod svetlosnim mikroskopom. Vijabilne ćelije su identifikovane
na osnovu prisustva euhromatina a apoptotične na osnovu kondenzovanog heterohromatina i
fragmentacije jedra.
Procenat apoptotičnih PMN je određen na osnovu ukupnog izbrojanih 500 ćelija po uzorku.
Protočna citometrija
Druga metoda za određivanje procenta apoptotičnih PMN se zasniva na detekciji kasne faze
apoptoze u kojoj ćelije formiraju apoptotska tela, te imaju hipodiploidnu količinu DNK u svom
sastavu. Za detekciju ovog vida apoptoze korišćena je protočna citometrija, a ćelije su obojene
propidijum jodidom (PI), fluorescentnom bojom koja se vezuje za DNK i na osnovu intenziteta
fluorescence je moguće odrediti količinu DNK. Obzirom da su uzorke vaginalnih ispiraka činile
različite ćelije (PMN, epitelne ćelije, mononukleari, bakterije i dr.), PMN su obeleženi pomoću
anti-CD45 antitela i granuliranosti. Ćelije su najpre isprane u PBS-u centrifugiranjem a na
ćelijski pelet je dodato anti-CD45-FITC antitelo (Invitrogen, USA) (1:10 u PBS), tokom
narednih 45 minuta. Ćelije su isprane, a zatim analizirane na protočnom citometru (Partec Cube
94
6). Na side scatter (SS)/CD45-FITC tačkastom dijagramu, PMN su obeleženi kao CD45
pozitivne ćelije, visoke granuloranosti. U cilju određivanja procenta apoptotičnih PMN, ćelijski
pelet je resuspendovan u hipotonom rastvoru (0.1% Na-citrat, 0.1% Triton X u destilovanoj
vodi) koji omogućava permeabilizaciju svih ćelija, živih i apoptotičnih. U 300 μl ćelijske
suspenzije je dodat propidijum jodid (PI) (40 μg/ml) i uzorci su inkubirani 6 sati na sobnoj
temperaturi ili preko noći u frižideru. Nakon inkubacije, ćelije su analizirane na protočnom
citometru unutar regiona koji odgovara CD45+/SSlogjako ćelijama. Unutar ove populacije ćelija
analizirana je količina DNK, a ćelije sa hipodiploidnim nukleusom (sub-G0 pik) su
identifikovane kao apoptotske ćelije.
Druga metoda za merenje apoptoze ćelija u najranijem stadijumu je određen pomoći Apoptosis
Detection Kit (R&D Systems) koji omogućava detekciju eksternalizacije fosfatidil serina
pomoću specifičnog solubilnog receptora Aneksina V. Pored toga dodat je i PI koji se vezuje
za DNK, onda kada uđe u ćelije koje nemaju očuvan membranski potencijal. Na osnovu ovoga
postupka je moguće proceniti procenat vijabilnih ćelija (Annexin V FITC-/PI-), rano
apoptotskih (Annexin V FITC+/PI-), kasno apoptotskih/sekundarno nekrotičnih (Annexin V
FITC*/PI*) i primarno nekrotičnih ćelija (Annexin V FITC-/PI*). U ovoj metodi su ćelije su
isprane u hladnom PBS-u i nakon toga resuspendovane u 1x vezujućem puferu (10mM
Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2), a zatim centrifugirane 10 min na 1000
rpm. Nakon centrifugiranja, na 50μl ćelijske suspenzije je dodat propidijum jodid (40μg/ml) i
Aneksin V FITC-a (10-100 μg/ml u skladu sa uputstvom proizvođača). Ćelije su zatim
inkubirane u mraku na sobnoj temperaturi 15 min. Po isteku inkubacije, ćelijama je dodat
vezujući pufer do ukupne zapremine od 300 μl, i uzorci su odmah analizirani na protočnom
citometru. Kontrolne ćelije su bile obojene samo Annexin-V FITC-om ili samo PI u cilju
određivanja prelivanja signala u susedne FL kanale.
Konfokalna mikroskopija
Pored toga, morfološka analiza apoptoze PMN je urađena konfokalnom mikroskopijom. Od
ćelijske suspenzije su pripremljeni citospinovi pomoću citospin centrifuge, pri čemu je oko
1x104 resuspendovano u 100 μl PBS-a po uzorku. Nakon sušenja, ćelije su obojene pomoću
anti-CD45-FITC antitela (1:10 razblaženje), inkubiranjem 1h u vodenom kupatilu. Ćelije su
isprane u PBS, a zatim obojene PI. Nakon dvojnog obeležavanja ćelija, na uzorke je dodat
medijum za sprečavanje fotoizbeljivanja i pokrovno stakalce. Uzorci su analizirani pod
različitim uvećanjima skenirajućom laserskom konfokalnom mikroskopijom (Zeiss 510)
koristeći podešavanja lasera i detektora karakteristična za FITC, odnosno PI. Osim toga, u cilju
preciznije analize morfologije jedra, ćelije su u suspenziji obojeni PI, a zatim nakapani na
95
mikroskopsku pločicu i prekrivene pokrovnim stakalcem, nakon čega su direktno analizirane
konfokalnom mikroskopijom.
Kvantitativno određivanje broja PMN u vaginalnom ispirku (QPMN-A).
U vaginalnom ispirku određivan je ukupan broj PMN tako što je najpre određen broj u 1 ml
brojanjem ćelija u Neubarovoj komori nakon bojenja rastvorom Turka a zatim su dobijene
vrednosti pomnožene sa 20 (ukupna zapremina vaginalnog ispirka). Pod mikroskopom
polimorfonukleari (slobodni ili adherentni za epitelne ćelije) se morfološki jasno razlikuju od
epitelnih ćelija i drugih elemenata. Srednji broj ćelija se izražava po mm3.
Kvantitativno određivanje broja PMN iz vaginalnog brisa (QPMN-B)
Štapić kojim je uzet bris sa bočnog vaginalnog zida se stavlja u epruvetu sa 1 ml fiziološkog
rastvora, ispere i iz epruvete se uzima 10 μl tečnosti i dodaje u Neubaurovu fazno kontrastnu
komoru za brojanje ćelija (dubina komore 0,01 mm) i uzorak odstoji 2-5 min. PMN se broje u
svih 25 polja, u centralnom polju površine 1x1 mm ili dok se ne izbroji najmanje 100 PMN.
Srednji broj ćelija se izražava po mm3.
Mikrobiološke analize
Cervikalni bris na kulturu i antibiogram: sterilnim štapićem iz cervikalnog kanala uzima se bris
koji se vraća u sterilnu suvu epruvetu (bez transportnog medijuma) i nosi u laboratoriju unutar
3 časa od uzimanja uzorka. Cervikalni bris za određivanje prisustva M. hominis, U. urealyticum
i C. trachomatis uzima se sterilnim šatpćem iz cervikalnog kanala, transportuje u laboratoriju
unutar 2-3 h u odgovarajućoj podlozi. Kultivacija i identifikacija obavljena je na kulturi krvnog
agra, na kojoj je identifikovana i C. albicans za čiju kultivaciju nije korišćena nikakva druga
specijalna podloga.
96
2.6
ODREĐIVANJE KONCENTRACIJA ISPITIVANIH CITOKINA
Sterilni štapić se stavlja u cervilkalni kanal, drži 60 s i potom vraća u sterilnu epruvetu tipa
"Eppendorf", zapremine 1,5 ml, sa 1 ml RPMI medijuma (ICN, USA). Uzorak se transportuje
u laboratoriju i po uklanjanju vrha štapića centrifugiran na 3000g, 15 min. na sobnoj
temperaturi. Supernatant se do testiranja skladišti u sterilnoj suvoj epruveti, tipa "Eppendorf"
zapremine 1,5 ml, na -70OC. Prethodnim gravimetrijskim ispitivanjem na 20 trudnica utvrđeno
je da je varijacija u količini sekreta grlića materice, uzetog na gore opisani način manja od 15%.
Određivanje koncentracije citokina citomiks testom
Nivoi citokina IL-2, IL-1β, IFN-γ, IL-12 p70 i TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17a,
IL-22 i IL-9 su određeni u uzorcima iz grlića materice korišćenjem Human
Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex FlowCytomix Multiplex 96 tests (eBioscience, SanDiego CA,
SAD). Pre početka obrade uzoraka pripremljeni su svi neophodni reagensi po uputstvu
proizvođača. Esej pufer (assay buffer) je pripremljen rastvaranjem koncentrata sa destilovanom
vodom u odnosu 1:10. Liofilizirani standardi su rekonstituisani dodavanjem destilovane vode
čime je dobijena preporučena koncentracija za sve citokine, a potom su napravljena njihova
dvostruka serijska razblaženja. Nakon pripreme standarda pripremljena je mešavina kuglica
(bead mixture). Za analizu svakog citokina korišćena je određena vrsta imunofluorescentnih
kuglica sa vezanim anti-citokinskim antitelima. Mešavina kuglica je pripremljena tako da
ukupni volumen bude jednak proizvodu 25 μl kuglica i ukupnog broja testova. Mešavina
sekundarnih antitela konjugovanih biotinom spremljena je na sličan način kao i mešavina
kuglica. Rastvor sa streptavidin-fikoeritrinom, koji se vezuje za biotinom-konjugovana
sekundarna antitela, pripremljen je rastvaranjem u esej puferu. Nakon pripreme reagensa, u
ploču od 96 mesta sa „V“-dnom (Sardstedt, Nemačka) dodavano je po 25 μl standarda i
uzoraka. Nakon toga dodato je po 25 μl mešavine kuglica i po 50 μl mešavine sekundarnih
antitela konjugovanih biotinom. Usledila je inkubacija u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi
na mešalici. Po isteku inkubacije, u svaki bunarić je dodato po 100 μl esej pufera i ploča je
centrifugirana 5 minuta na 200xg. Nakon toga iz svakog bunara je uzeto po 150 μl tečnosti.
Potom je dodato po 150 μl esej pufera i ploča je ponovo centrifugirana tokom 5 minuta na
200xg. Nakon uzimanja po 150 μl tečnosti iz svakog bunara dodato je po 50 μl rastvora sa
streptavidin-fikoeritrinom i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na mešalici. Po
isteku inkubacije ponovljen je prethodno opisan postupak ispiranja i sadržaj svakog bunarića je
prebačen u epruvete za protočnu citofluorimetriju i svaka je dopunjena sa po 500 μl esej pufera.
97
Uzorci su analizirani na protočnom citofluorimetru (EPICS XL-MCS, Coulter, Krefeld,
Nemačka), a rezultati su obrađeni pratećim softverom (FlowCytomix Pro Software).
2.7
MERENJE DUŽINE GRLIĆA MATERICE
Merenje dužine grlića materica rađeno je transvaginalnom sondom kod pacijentkinja sa
praznom mokraćnom bešikom. Sonda se uvodi u prednji vaginalni forniks bez jačeg pritiska
sondom na grlić materice, a ultrazvučna slika zauzima 75% ekrana. Debljina i ehogenost
prednje i zadnje usne grlića su podjednake, vizualizuje se cervikalni kanal i meri dužina od
unutrašnjeg do spoljašnjeg materičnog ušća. U slučaju proširenja unutrašnjeg materičnog ušća
u obliku slova „V“ ili „U“ meri se njegova dužina („funnel length“), a posebno se beleži
preostala dužina grlića materice, od dna slova „V“ ili „U“ pa do spoljašnjeg materičnog ušća.
Tokom pregleda koji traje 2-3 minuta povremeno se pritisne fundus uterusa i procenjuje da li
pri tome dolazi do dilatacije unutrašnjeg materičnog ušća. Vrše se tri merenja, a upisuje se
najmanja vrednost. Nakon pregleda grlića materice radi su kompletan ultrazvučni pregled i
utvrđuje starost trudnoće na osnovu biometrijskih parametara. Pacijentkinje sa grlićem ≤30 mm
smatrane su rizičnom grupom i svim pacijentkinjama je uvedena terapija 200 mg progesterona
vaginalno 1 uveče, dok su pacijentkinje sa grlićem ≤20 mm hospitalizovane u tercijarnu
ginekološku ustanovu radi tokolitičke terapije i eventualne aplikacije serklaža.
2.8
STATISTIČKA ANALIZA
Kompletna statistička analiza podataka izvršena je pomoću komercijalnog statističkog softvera
IBM SPSS Statictics 17 (IBM, SAD). Veliki broj varijabli predstavljen je u vidu frekvencija
pojedinih obeležja (kategorija), a statistička značajnost razlika proveravana je primenom Hi
kvadrat testa.
Stepen slaganja između kategorijskih parametara (skala merenja) utvrđivan je putem indeksa
kapa.
U slučaju kontinuiranih varijabli, podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna
devijacija (SD). Normalnost distribucije podataka utvrđivana je primenom KolmogorovSmirnov testa.
U zavisnosti od rezultata ovog testa, poređenja između grupa su vršena primenom analize
varijanse u 1. pravcu (ANOVA) ili putem Kruskal-Walis testa. Naknadna post hoc poređenja
izvedena su odgovarajućim testovima za poređenje parova.
98
Za procenu jačine povezanosti rizik faktora i klinički značajnih ishoda kao zavisnih varijabli,
korišćena je binarna logistička regresija. Jačina povezanosti pojedinačnih rizik faktora i
kliničkog ishoda prikazana je u vidu odds odnosa i njihovih 95%-nih granica poverenja.
Senzitivnost i specifičnost pojedinih parametara u diskriminaciji kliničkih ishoda određivana je
tzv. ROC analizom.
Međusobna korelacija pojedinih bitnih parametara utvrđivana je primenom Spermanove
korelacione analize.
Statistički značajna razlika procenjivana je na minimalnom nivou p<0,05.
99
3 REZULTATI I DISKUSIJA
3.1
UPOREDNI REZULTATI - POSTOJEĆI DIJAGNOSTIČKI KRITERIJUMI U
ODNOSU NA NOVU PODELU
3.1.1 Poređenje rezultata–Nugentovi kriterijumi i NOVA PODELA
S obzirom da je u proceni stanja vaginalne flore korišten nova originalna metodologija smatrali
smo da je najbolje da prvo proverimo njenu vrednost u odnosu na postojeće dijagnostičke
kriterijume. Da još jednom posetimo da je suština i zajedničko za sve ove metode što se
dijagnoza zdravo ili bolesno donosi na osnovu kvantitativnog ili semikvantitativnog odnosa
laktobacilarnih i drugih baterijskih morfotipova. Kako smo napomenuli u metodologiji NP-6G
podela može da se transformiše u 2 ili 3 grupe (NP-2G i NP-3G) tako što se sve pacijentkinje
iz grupa NF,NM i NN svrstaju u normalne, a pacijentkinje sa BVF, BVM i BVN u grupu BV.
Tri grupe (NP-3G) dobijamo kad pacijentkinje iz grupe NN i BVN “proglasimo”
intermedijarnim, a ostale četiri pretvorimo u normalne i BV. Kako su Nugentovi kriterijumi u
najvećem broju studija zlatni standard u Tabeli 1 i Grafikonima 1 i 2 su prikazani uporedni
rezultati dobijeni mikroskopskim pregledom preparata po Gramu na uvećanju x1000 na osnovu
kriterijuma po Nugentu u odnosu na rezultate mikroskopskog pregleda preparata po Gramu na
uvećanju x200 na osnovu nove podele na 6 grupa (NP-6G) i modifikacija i podele na tri (NP3G) i dve grupe (NP-2G).
100
3.1.1.1 Uporedni rezultati – Nugentovi kriterijumi i NOVA PODELA - 6 grupa (NP-6G)
Na Grafikonu 3.1 (za detaljniji uvid pogledati Tabela 1, Prilog 1) prikazani su rezultati
mikroskopskog pregleda (uvećanje X1000) na osnovu Nugentovih kriterijuma u kojima su sve
pacijentkinje razvrstane u tri grupe normalan nalaz (NORMAL), intermedijaran nalaz
(INTERMEDIAR) i bakterijska vaginoza (BV) i rezultati mikroskopskog pregleda preparata
po Gramu (uvećanje X200) razvrstanih u 6 grupa.
Nova Podela - 6 grupa u odnosu na Nugentov skor
(χ2=669,800; df=10; p<0.001)
120%
100%
99%
96%
80%
78%
80%
57%
60%
44%
40%
35%
31%
25%
19%
20%
8%
5%
0%
17%
4%
2%
0% 1%
0%
NORMALAN
INTERMEDIJARAN
BV
NUGENT
NORMAL FULL
NORMAL MID
NORMAL NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
Grafikon 3.1: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i nove podele u 6 grupa (NP-6G)
Primenom Hi kvadrat testa testirali smo asocijaciju između podele po Nugent i NP-6G.Na
osnovu dobijenih rezultata utvrđeno je postojanje dobre asocijacije između rezultata dobijenih
na osnovu Nugentovih kriterijuma i NP-6G (χ2=669,800; df=10; p<0.001) (Grafikon 3.1;
Tabela 1 Prilog 1). Ako posmatramo grupu sa normalnim nalazom, na očekivanih 61,1%
najbolja asocijacija postoji između grupe sa normalnim nalazom (po Nugentu) i NF (NP-6G)
96,0% i NM 80,3%. Grupa sa intermedijarnim nalazom po Nugentu u odnosu na očekivanih
15,9% je dala značajnu asocijaciju sa BVN 57,1% i NN 44,4% respektivno. Grupa BV je u
odnosu na očekivanih 21,0% najznačajniju asocijaciju pokazala sa BVF 98,5% i BVM 78,0%.
Kao što smo već opisali u metodologija NP-6G pretvaramo u NP-3G tako što pacijentkinje iz
BVN i NN grupe svrstavamo u grupu intermedijarnih, dok se NF i NM spajaju u NORMAL, a
101
BVF i BVM u BV. Iz Grafikona 3.1 se vidi da je preko 50% pacijentkinja iz Nugentove
intermedijarne grupe na osnovu NP-6G svrstano u kategoriju NULL, hipocelularni (NN+BVN).
3.1.1.2 Uporedni rezultati – Nugentovi kriterijumi i NOVA PODELA - 3 grupe (NP-3G)
Nova Podela - 3 grupe u odnosu na Nugentov skor
( χ 2= 6 3 4 , 4 4 2 ; d f = 4 ; p < 0 . 0 0 1 )
NP-3G NORMAL
NP-3G INTERMEDIAR
NP-3G BV
90,6%
88,8%
49,6%
28,9%
21,5%
9,0%
8,8%
2,4%
NORMAL
0,4%
INTE R M E DIAR
BV
NUGENT
Grafikon 3.2: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i nove podele u 3 grupa (NP-3G)
I ovde je najbolja asocijacija između pacijentkinja sa normalnim nalazom i onih sa bakterijskom
vaginozom, a slabija kod pacijentkinja sa intermedijarnim nalazom (Grafikon 3.2; Tabela 2
Prilog 1).
102
3.1.1.3 Uporedni rezultati - Nugentovi kriterijumi i NOVA PODELA u 2 grupe (NP-2G)
Nova Podela - 2 grupe u odnosu na Nugentov skor
( χ 2= 4 3 7 , 4 0 0 ; d f = 2 ; p < 0 . 0 0 1 )
NP-2G NORMAL
NP-2G BV
82,5%
73,6%
22,4%
13,8%
4,0%
NORMAL
3,8%
INTE R M E DIAR
BV
NUGENT
Grafikon 3.3: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i nove podele u 2 grupa (NP-2G)
Na Grafikonu 3.3 (Tabela 3, Prilog 1) su prikazani rezultati poređenja sa Nugentovim
kriterijumima, kada se osnovna podela od 6 grupa svede na dve grupe, dakle samo pacijentkinje
sa
normalnim
nalazom
(NORMAL=NF+NM+NN)
i
bakterijskom
vaginozom
(BV=BVF+BVM+BVN). Na ovaj način se NP-6G na neki način svodi na Amselove dve grupe,
normalne i BV. Ovo naglašavamo zbog činjenice da najveći broj do sada objavljenih studija
poredi Nugentove i Amselove dijagnostičke kriterijume, a u tim poređenjima Nugentova
intermedijarna grupa predstavlja njegovu veliku prednost. Ipak i pri ovakvoj podeli na samo
dve grupe utvrđeno je postojanje dobre asocijacije. Ova slabija asocijacija i manja podudarnost
nalaza upravo je posledica činjenice da Nugent ima intermedijarnu grupu i da se tako „rešava“
pacijentkinja sa graničnim nalazom, dok na osnovu Amselovih kriterijuma pacijentkinje
definišemo ili kao normalne ili kao bolesne (BV). Ni isključivanje ovih pacijentkinja iz
poređenja ne umanjuje Nugentovu prednost, jer tako isključujemo pacijentkinje koje su po
Nugentu imale graničan nalaz, a ne neke druge koje bi po NP imale takav nalaz, odnosno koje
bi svrstali u intermedijarnu grupu. Iz tabele se vidi da je 65% (73/112) pacijentkinja iz
Nugentove intermedijarne grupe imalo normalan nalaz, a 35% BV na osnovu mikroskopskog
pregleda preparata po Gramu na uvećanju X200. Ovi procenti su u skladu sa nalazima drugih
autora koji smatraju da oko 30% pacijentkinja iz Nugentove intermedijarne grupe ima patološki
nalaz.
103
Na osnovu iznesenih podataka možemo zaključiti da je statističkom obradom (Hi-kvadrat testa)
pokazana dobra asocijacija nove metodologije (NP-6G, NP-3G i NP-2G) u odnosu na
Nugentovu podelu (zlatni standard) i da se kao takva može uspešno koristiti u dijagnozi BV. Iz
Tabele 2, Prilog 1 u kojoj su pacijentkinje podeljene u tri identične grupe (NP-3G) kao i kod
Nugenta vidi se da je od 458 pacijentkinja sa normalnim nalazom nalaz bio podudaran kod njih
415 (90,6%) dok je kod 41 pacijentkinje na osnovu Nugentovih kriterijuma nalaz bio
intermedijaran, a mi smo ih svrstali u grupu normalnih. Dve pacijentkinje sa BV po Nugentu,
na osnovu mikroskopskog preparat po Gramu na uvećanju x200 imale normalan nalaz. Visoka
podudarnost nađena je i u grupi pacijentkinja sa BV 88.8% (111/125), dok je najmanja
podudarnost nađena u intermedijarnoj grupi(49.6%).
Tako ako pogledamo Tabelu 1, Prilog 1 i Grafikon 3.1 vidimo da su je podudarnost Nugentovih
normalnih nalaza i grupe NF 96%, a u grupi BVF 98% i da ovaj procenat opada u grupama NM
i BVM i iznosi 80 % i 78%, a da je najmanji u grupama NN i BVN 30% i 34%, respektivno.
Ovakva podela (NP-6G) dozvoljava nam da zaključimo da su pacijentkinje sa NF i BVF jasno
definisane kategorije, i da je nezavisno od toga koju metodologiju koristili teže je pogrešiti,
nego postaviti tačnu dijagnozu. Ovo je najlakše shvatiti ukoliko pogledate fotografija na kojima
su prikazane pacijentkinje sa BVF i NF preparat po Gramu ili NPVS. Kod pacijentkinja koje
po metodologiji NP-6G imaju nalaz NM ili BVM podudarnost je nešto manja i kreće se oko
80%, što takođe govori da su i ove dve grupe pacijentkinja dobro definisane i da je podudarnost
visoka.
Uzeto zajedno ovo nam govori da su ove dve grupe u kojima se u konkretnom slučaju nalazi
84% (592/704) pacijentkinja u stvari razlog što su rezultati visoko podudarni nezavisno od toga
koju od pomenutih metoda koristite. Međutim ukoliko pogledamo grupu koju Nugent definiše
kao intermedijaran nalaz, a kojoj po NP-6G pripadaju pacijentkinje NN i BVN, onda vidimo da
je tu podudarnost značajno manja, i da je glavni izvor dijagnostičkih neslaganja. Ovaj zaključak
je na prvi pogled isti kao onaj naveden u poređenju Nugenta i NP-3G, gde je intermedijarna
grupa glavni izvor neslaganja, međutim da smo zadržali NP-3G, ne bi imali po nama najvažniji
podatak, a to je da su pacijentkinje sa malim brojem bakterijskih formi (naša kategorija NULL),
osnovni izvor dijagnostičkih neslaganja.
Dakle, na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da postoji dobra asocijacija između
nove podele, bilo u njenoj osnovnoj varijanti (NP-6G) ili njenim modifikacijama (NP-3G i NP2G), i Nugentovih kriterijuma kao zlatnog standarda u dijagnozi BV, odnosno da se NOVA
PODELA može uspešno koristiti u dijagnozi BV. Ovako dobra asocijacija je rezultat visoke
104
podudarnosti rezultata u grupama NN, NM, BVF i BVM i Nugentovih pacijentkinja sa
normalnim nalazom i BV. S obzirom da ove grupe i čine najveći deo ispitivane populacije oni
u ukupnoj statističkoj obradi “brišu” (skrivaju) podatke o značajnim neslaganjima kod
pacijentkinja iz Nugentove intermedijarne grupe. I na kraju NP-6G je omogućila da ukažemo
na činjenicu da najveći broj pacijentkinja iz Nugentove intermedijarne grupe su u stvari
pacijentkinje sa malim brojem bakterijskih formi, te da su one suštinski osnovni izvor
dijagnostičkih nepodudarnosti (o ovome ćemo detaljno raspravljati u poređenju podele po
Ison/Hay-u i NP-6G).
3.1.2 Poređenje rezultata - Amselovi kriterijumi i NOVA PODELA
Mislimo da će Amselovi kriterijumi uskoro postati obavezni u projektu mikrobioma vagine.
Razlozi za takav naš stav su pre svega u činjenici da danas ni mikrobiolog ni molekularni biolog
u najvećem broju slučajeva ne mogu postaviti dijagnozu BV, ukoliko ne znaju i klinički nalaz.
Da je tako govore i rezultati iz Ravelove [180] studije u kojoj od 396 asimptomatskih
pacijentkinja laktobacili nisu nađeni kao predominantna flora kod 27%, a na osnovu
Nugentovih kriterijuma 24% je imalo BV. Pitanje je da li su one zdrave žene, bez predominacije
laktobacila ili imaju asimptomatsku BV. U ispitivanju je određivan i pH vagine, ali nije rađena
proba sa 10% KOH, niti klinički pregled pacijenta, odnosno nije mogla biti postavljena
dijagnoza BV na osnovu Amselovih kliničkih kriterijuma (pozitivna tri od četiri znaka). Sigurni
smo da bi ova dva znaka takođe značajno doprinela u raspoznavanju “zdrave” i “patološke”
vaginalne flore i tako doprinela i boljem tumačenju rezultata molekularnobiloških analiza. Tako
je poznato da neki od članova vaginalne flore imaju značajan uticaj na vaginalni pH, dok su
neke druge odgovorne za produkciju supstanci koje su uzrok neprijatnog mirisa ribe koji se
intenzivira probom sa 10% KOH, ali takođe je poznato da neki drugi poremećaji vaginalne flore
kao što je aerobni vaginitis (AV) uzrokuju neprijatan miris i bez probe sa 10% KOH. Tako bi
na primer, AV mogao biti odgovoran za lažno pozitivan test sa 10% KOH kod pacijentkinja
koje na mikroskopskom nalazu nemaju “sliku” BV [382]. Ipak, jedan najvećih nedostatak
Amselovih dijagnostičkih kriterijuma je što pacijentkinje sa različitim poremećajima vaginalne
flore svrstava samo u dve grupu.. Zato mislimo da bi budući nalazi NPVS trebali da razlikuju
mikroskopski nalaz na osnovu sličnih metodoloških principa kao što je to urađeno u NP-6G,
dakle semikvantitativna procena odnosa ŠF i NŠF, uz detekciju drugih bakterijskih morfotipova
i PMN, i naravno promenu kriterijuma u kojima su CC preduslov za dijagnozu BV.
105
3.1.2.1 Uporedni rezultati - Amselovi kriterijumi i NOVA PODELA - 6 grupa (NP-6G)
Nova Podela - 6 grupa u odnosu na Amsel skor
(χ2=426,168; df=5;p<0.001)
100,0%
99,6% 98,6%
96,8%
90,0%
78,5%
80,0%
74,1%
70,0%
59,6%
60,0%
50,0%
40,4%
40,0%
25,9%
30,0%
21,5%
20,0%
10,0%
3,2%
0,4%
1,4%
0,0%
NORMALAN
BV
Amsel
NORMAL FULL
NORMAL MID
NORMAL NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
Grafikon 3.4: Uporedni rezultati dijagnoze na osnovu Amselovih kliničkih kriterijuma (klinički „zlatni
standard“) i nove podele u 6 grupa (NP-6G)
Na Grafikonu 3.4 (Tabela 4, Prilog 1) prikazani su uporedni rezultati dijagnoze na osnovu
Amselovih kliničkih kriterijuma i NP-6G (χ2=426,168; df=5;p<0.001).
3.1.2.2 Uporedni rezultati - Amselovi kriterijumi i NOVA PODELA - 3 grupe (NP-3G)
Nova Podela - 3 grupe u odnosu na Amsel skor
(χ2=395,29; df=2;p<0.001)
120,0%
99,3%
100,0%
86,0%
80,0%
62,5%
60,0%
37,5%
40,0%
14,0%
20,0%
0,7%
0,0%
NP-3G NORMAL
NP-3G INTERMEDIAR
Amsel NORMALAN
NP-3G BV
Amsel BV
Grafikon 3.5: Uporedni rezultati dijagnoze na osnovu Amselovih kliničkih kriterijuma (klinički „zlatni
standard“) i nove podele u 3 grupe (NP-3G)
106
Na Grafikonu 3.5 (Tabela 5, Prilog 1) prikazani su uporedni rezultati dijagnoze na osnovu
Amselovih kliničkih kriterijuma i NP-3G (χ2=395,29; df=2;p<0.001).
Nova Podela - 2 grupe u odnosu na Amsel skor
(χ2=390,604; df=1;p<0.001)
100,0%
90,0%
80,0%
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
96,4%
78,6%
21,4%
3,6%
NP-2G NORMAL
Amsel NORMALAN
NP-2G BV
Amsel BV
Grafikon 3.6: Uporedni rezultati dijagnoze na osnovu Amselovih kliničkih kriterijuma (klinički „zlatni
standard“) i nove podele u 2 grupa (NP-2G)
Analizom Grafikona 3.6 i Tabele 6 (Prilog 1) se vidi da je od 641 pacijentkinje uključene u
ovu analizu, kod njih 17 (3,6%) na osnovu Amselovih dijagnostičkih kriterijuma postavljena
dijagnoza BV, a na osnovu NP-2G one su imale normalna nalaz (lažno negativne), a 36 (21,4%)
pacijentkinja sa normalnim nalazom po Amselu, imalo BV na osnovu NP-2G (lažno pozitivne).
Tako je senzitivnost: 88,6%,specifičnost: 92,6%;PPV:78,5%,NPV 96,4%, a sveukupna tačnost
u odnosu na Amsela kao zlatni standard iznosila je 91,7%. Na osnovu ovih rezultata možemo
zaključiti da je NP-6G; NP-3G; NP-2G pokazala dobro slaganje i sa kliničkim zlatnim
standardom i da se kao takva može koristiti u dijagnozi BV.
3.1.3 Poređenje rezultata - kriterijumi po Nugentu, Ison/Hayu i NOVA PODELA
3.1.3.1 Uporedni rezultati - kriterijuma po Ison/Hayu i Nugentu
Podela po Ison/Hayu, pored Nugentove tri, ima još dve grupe pacijentkinja. Prve su
pacijentkinje označene u tabeli kao “čist nalaz” i koje se karakterišu nedostatkom bakterijskih
formi, a druga grupa su pacijentkinje u kome na preparatu predominiraju koke, pa su tako
obeležene u tabeli (vidi Metodologiju).
107
Nugentova podela u odnosu na podelu po Ison/Hayu
(χ2=862,726; df=20; p<0.001)
Koke
Ison/Hay
BV
Intermedijaran
Normalan
Čist nalaz
0%
10%
20%
30%
NORMALAN
40%
50%
60%
INTERMEDIAL
70%
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.7: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i Nugentu
Ako pogledamo Grafikon 3.7 (Tabela 7, Prilog 1) videćemo da su neke od pacijentkinja iz
Nugentovih grupa raspoređene u nove dve grupe (“čiste” i “koke”) kriterijuma po Isonu i Hayu.
Ako bi, npr. u ovom ispitivanju određivali koncentracije citokina i pri tome koristili podelu po
Nugentu rezultati koje bismo dobili mogli bi značajno da se razlikuju u odnosu na rezultate koje
bi dobili kada bi iste pacijentkinje razvrstali na osnovu podele po Ison/Hayu jer bi na taj način
oko 10% od ukupnog broja pacijentkinja za Nugenta bilo “nepoznato”, a po Ison/Hayu bi
predstavljali dve nove grupe. Drugo, utvrđivanje podudarnosti ova dva metoda u dijagnostici
BV na osnovu vrednosti kappa indeksa podrazumeva da se moramo “rešiti” ove dve grupe, tako
što ćemo ih isključiti iz poređenja ili pripojiti pacijentkinjama koje nemaju BV, dakle ili
normalnim ili intermedijarnim. Treće, treba uočiti da je polovina ovih pacijentkinja iz
Nugentove intermedijarne grupe. Na kraju, nejasno je zašto ovakva podela koja je ne samo
jednostavnija i brža od Nugentove, nego i ukazuje na dve nove grupe pacijentkinja nikada nije
našla širu primenu ni u kliničkom radu, a ni u istraživačkim studijama. O ovome ćemo još
diskutovati kada prikažemo uporedne rezultate podele po Ison/Hayu i NP-6 i 3G.
108
3.1.3.2 Uporedni rezultati - kriterijumi po Ison/Hayu i NP-6G
Nova Podela - 6 grupa u odnosu na Ison/Hay
(χ2=862,726; df=20; p<0.001)
BV FULL 01
BV MID
65
1 3
8
2
21
NORMAL NULL
NORMAL MID
42
13
BV NULL
11
11
18
4
17
124
NORMAL FULL 1
Ison/Hay Čist nalaz
5
12
12
1
0%
0
23
281
10%
20%
30%
Ison/Hay Normalan
40%
50%
1 8
15 04
60%
Ison/Hay Intermedijaran
70%
80%
Ison/Hay BV
90%
100%
Ison/Hay Koke
Grafikon 3.8: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove
podele u 6 grupa (NP-6G)
Važno je na Grafikonu 3.8 (Tabela 8, Prilog 1) uočiti da od 37 pacijentkinja koje su na osnovu
kriterijuma po Ison/Hayu bile svrstane u grupu “čist nalaz” njih 34 (92%) nalaze u grupama
NN (n=21) i BVN (n=13). Preostale tri pacijentkinje u grupama NF, NM i BVM možemo
objasniti samo gledanjem male površine na uvećanju x1000 i da smo gledali deo preparata koji
je siromašan bakterijskim formama odnosno čist, dok podatak da nijedna pacijentkinja nije
nađena u grupi BVF samo potvrđuje činjenicu da je broj bakterijskih formi u ovakvim stanjima
i 1000 puta veći, tako da je praktično nemoguće naći deo preparata koji je “čist”. U Grafikonu
su prikazani isti rezultati kada je NP svedena na 3 grupe. Dakle, da smo se u našem ispitivanju
iz praktičnih razloga odlučili da pacijentkinje podelimo u 3 grupe (lakše poređenje sa
Nugentom) onda bi iz ovih tabela videli da su 34 pacijentkinje iz grupe čist nalaz po Ison/Hayu
svrstane u intermedijarnu grupu na osnovu NP-3G. Na ovaj način nalaz intermedijarne grupe
ostao bi na neki način nedefinisan, kao što je to slučaj kod Nugentove podele. Dakle mi znamo
da se radi o pacijentkinjama sa nalazom koji je između normalnog i BV, ali nemamo pred očima
mikroskopsku sliku takvog nalaza. Novom podelom na 6 grupa koja se zasniva na
semikvantitativnoj proceni ŠF i NŠF mi definišemo ovu grupu pacijentkinja i sad znamo da su
to u 92% slučajeva pacijentkinje iz grupa BVN i NN, dakle one sa malim brojem ŠF i NŠF, što
odgovara čistom nalazu po Ison/Hayu. Međutim u NP-6G 72 pacijentkinje su svrstane u grupu
109
NN, a njih 49 u BVN, dakle ovakvom podelom je 121 pacijentkinja svrstana u grupu NULL,
koja bi teoretski trebala da se slaže sa grupom “čist nalaz” u podeli po Ison Hayu. Trostruko
veći broj pacijentkinja u NP-6G je verovatno posledica s jedne strane procene šta u originalnim
kriterijumima podrazumeva autor kada kaže da su prisutne samo EĆ bez bakterijskih formi. Na
osnovu našeg iskustva, mikroskopski preparat samo sa EĆ a bez bakterijskih formi praktično
ne postoji. Moguće je, kada se gleda mala površina preparata, kao što je to slučaj sa uvećanjem
na x1000, da se naiđe na deo preparata koji je stvarno bez bakterijskih morfotipova i potpuno
čist, ali su ovakva vidna polja prava retkost. Gledanjem veće površine preparata uvek će biti
više vidnih polja sa malim brojem bakterijskih formi u odnosu na polja na kojima uopšte nema
bakterija. Ovih 37 pacijentkinja koje su svrstane u grupu čist nalaz u stvari su pacijentkinje kod
kojih smo mi na 20 VP na uvećanju x1000 nalazili najmanji broj bakterija. S druge strane, kada
bi umesto podele NP-6G koristili podelu po Ison-Hayu i gledali preparat na uvećanju x200 i
x1000 onda bismo većinu pacijentkinja iz grupe NN i BVN definisali kao čist nalaz.
Dakle, Ison/Hay su poodavno ukazali na ovu grupu pacijentkinja koju godinama
potpuno ignorišemo i mi nismo našli nijedan rad koji se ozbiljnije bavi ovakvim mikroskopskim
nalazom. S druge strane, naše ispitivanja pokazuju da ovakva grupa pacijentkinja ne samo da
postoji, nego čini oko 17,2% (121/704) od ukupnog broja pacijentkinja. Jedan od razloga što
ova grupa pacijentkinja nikada nije ozbiljnije analizirana svakako je i činjenica da najveći broj
studija koristi Nugentove kriterijume kao zlatni standard u dijagnozi BV. Ako pogledamo
Tabelu 6 u kojoj su dati uporedni rezultati po Ison/Hayu i Nugentu, videćemo da je i tu najveći
broj pacijentkinja sa čistim nalazom svrstan u intermedijarnu grupu (n=21) ili BV (n=14), dok
su samo dve pacijentkinje bili u grupi normalnih nalaza. Iz ovih rezultata, kao i iz rezultata NP6G, mogli bismo posredno da zaključimo da najveći broj pacijentkinja sa Nugentovim
intermedijarnim nalazom u stvari pripada kategoriji pacijentkinja sa malim brojem bakterijskih
formi. Ovo na neki način i objašnjava “nelogičnosti” i uske intervale u Nugentovom bodovanju
i zbrajanju. Tako u originalnim Nugentovim kriterijuma (bez modifikacije zbog površine
vidnog polja mikroskopa) :
0 bodova → prosečno = 0;
1 bod→0˂ prosečno ≤ 1;
2 boda →1˂ prosečno ≤ 4;
3 boda →4˂ prosečno ≤ 30;
4 boda →˃30.
Brojanje se vrši na 5-10 vidnih polja uvećanja x1000 zabeleženo kao interval na
ordinarnoj skali (raspona od 0-100 0000 bakterija po vidnom polju), a procena broja bakterija
110
u intervalima rađena je pretpostavljajući da broj bakterija od 1-30 izbrojan na delu vidnog polja
može da se koristi za približnu procenu broja bakterija na celom vidnom polju. Nelogično u
ovoj Nugentovoj podeli je to što pacijentkinje sa 4 ili manje bakterijskih formi nose 0, 1 i 2
boda, dok se preko 4 i preko 30 dodeljuju 3 i 4 boda. Dakle, 0 bodova će dobiti samo ona
pacijentkinja kod koje na 5 vidnih polja nismo našli ni jedan bakterijski morfotip: ako se radi o
laktobacilima onda je to 4+, a ako se radi o drugim morfotipovima onda je to 0 u konačnom
zbiru za Nugenta. Dakle, ako zamislimo nalaz koji Ison/Hay svrstavaju u grupu “čisti nalaz” i
na 5 VP ne nađemo ni jedan laktobacil pacijentkinja će dobiti 4 boda, ako smo na tih 5 VP našli
da je srednji broj morfotipa gardnerele veći od 4 (dakle ukupno 21 bakterijski morfotip;
21/5=4,2) pacijentkinja će dobiti još 3 boda, dakle ukupno 7 i po Nugentu će biti svrstane u
grupu sa BV. Ukoliko smo opet izbrojali 20 bakterijskih morfotipova onda će srednja vrednost
biti jednaka 4 i pacijentkinja će dobiti 2 boda i po Nugentu biti svrstana u intermedijarnu grupu.
Ipak, glavna karakteristika ovakvih nalaza je mali broj bakterijskih morfotipova. Verujemo da
je to mnogo važniji podatak od toga da li ćemo i koliko bakterijskih morfotipova izbrojati i
postaviti dijagnozu normalan, intermedijaran ili BV jer u koju god od tih grupa da je svrstamo,
dominantan mikroskopski nalaz je niska celularnost, odnosno mali broj bakterijskih formi. Ono
što još više umanjuje vrednost ovakvog “brojanja” svakako su već nekoliko puta ponavljani
podaci koji se odnose na nemogućnost mikroskopskog razlikovanja G. vaginalis i L. inersa,
kao i podataka koji se odnose na malu površinu pregledanog preparata. Rezultati našeg
ispitivanja ukazuju da grupa pacijentkinja koju su Ison/Hay definisali kao “čist nalaz”, a koja u
NP obuhvata pacijentkinje iz grupa NN i BVN, u budućim ispitivanjima treba da se posmatra
kao posebna grupa pacijentkinja.
111
3.1.3.3 Uporedni rezultati - kriterijumi po Ison/Hayu i NP-3G
Nova Podela 3 grupe u odnosu na podelu po Ison/Hayu
(χ2=819,4; df=8; p<0.001)
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
Čist nalaz
0%
10%
20%
30%
40%
NORMALAN
50%
60%
INTERMEDIAL
70%
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.9: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove
podele u 3 grupe (NP-3G)
Na Grafikonu 3.9 (Tabela 9, Prilog 1) prikazani su uporedni rezultati dijagnoze na osnovu
Ison/Hay kliničkih kriterijuma i NP-3G (χ2= 819,4; df=8; p<0.001).
Nova Podela 2 grupe u odnosu na podelu po Ison/Hayu
(χ2=470,20; df=4; p<0.001)
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
Čist nalaz
0%
10%
20%
30%
40%
50%
NORMALAN
60%
70%
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.10: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove
podele u 2 grupa (NP-2G)
Na Grafikonu 3.10 (Tabela 10, Prilog 1) prikazani su uporedni rezultati dijagnoze na osnovu
Ison/Hay kliničkih kriterijuma i NP-2G (χ2=470,20; df=4; p<0.001).
112
3.1.4 Poređenje rezultata – Claeysu, Nugentu; Ison/Hayu i Nova Podela
Ako pogledamo Tabele i Grafikone i uporedimo ih sa podelom po Nugentu ili Ison/Hayu
videćemo, iako sve tri podele imaju grupe sa BV, intermedijarnim i normalnim nalazom, da se
broj pacijentkinja u tim grupama razlikuje jer podela po Ison/Hayu ima još dve, a po Claeysu
još tri nove grupe pacijentkinja. Takođe treba primetiti da u podeli po Claeysu nema grupe koja
bi odgovarala grupi sa čistim nalazom po Ison/Hayu, da su četiri grupe identične u odnosu na
iste autore, a da su uvedene dve nove grupe, “sličan normalnom” i “leukoreja” (vidi
Metodologiju).
Ako pogledamo ove podatke, ono što „bode oči“ jeste da smo u podeli po Ison/Hayu imali 45
pacijentkinja sa nalazom koka, dok smo u podeli po Claeysu samo 4 pacijentkinje svrstali u
grupu koke. Napominjemo da je isti ispitivač gledao sve mikroskopske uzorke. Razlozi mogu
da budu različiti, a pokušaćemo na praktičnim primerima da ukažemo na neke od njih. Na
primer, ukoliko preparat po Gramu gledamo na uvećanju x1000 sa imerzijom na osnovu
kriterijuma po Nugentu, na 10 slučajno odabranih VP, posle pregleda postavićemo dijagnozu
intermedijarnog nalaza, a na preparatu je bio viđen mali broj bakterijskih formi. Ukoliko nešto
kasnije uzmemo isti preparat, verovatnoća da nađemo tih 10 polja je teoretska - gledaćemo 10
drugih vidnih polja na kojima će sada Nugentov zbir biti 7, dakle ne intermedijaran nalaz nego
BV. Što je celularnost (broj bakterijskih formi) preparata manja, mogućnost da se pri svakom
ponovljenom gledanju (ili ako isti uzorak analiziraju dve osobe) postavi drugačija dijagnoza je
veća, jer pacijentkinje sa BVF ili NF gotovo na čitavom preparatu imaju ista polja na kojima
predominiraju laktobacili ili BVAB. Ovde možemo da ukažemo i na još jednu mikroskopsku
zakonitost koja bi se mogla definisati na sledeći način: “homogenost preparata je upravo
srazmerna celularnosti”. Tako u grupama po NP-6G najveća homogenost preparata kod
pacijentkinja sa BVF, čak značajno veća i od pacijentkinja sa NF jer je broj bakterijskih formi
i do hiljadu puta veći, kao što se to jasno vidi na fotografijama. Dakle verovatnoća da ćemo kod
pacijentkinje sa nalazom BVF naći polja BVN je veoma mala (do 5%), a na preparatu BVM
nešto češće (10-15%). Grupa BVM i NF bili bi na drugom i trećem mestu po celularnosti, zatim
dolazi NM, i na kraju BVN i NN.
Tokom ovog ispitivanja isti mikroskopski preparati su gledani više puta na osnovu
različitih dijagnostičkih kriterijuma. U prvom analizama kada su korišćeni Nugentovih
kriterijumi i određivan broj PMN na uvećanju x1000, koke nismo ni detektovali jer,
jednostavno, nisu bile deo Nugentovog skora, a u literaturi nema rada koji govori o značaju
koka za stanje vaginalne mikroflore. Kada smo kasnije sve preparate ponovo gledali na osnovu
113
kriterijuma po Ison/Hayu i Cleaysu počeli smo da “tražimo” koke, jer su one posebne grupe u
podelama ovih autora.
Kako objasniti 45 pacijentkinja sa predominacijom koka u podeli po Ison/Hayu, a samo
4 pacijentkinje u podeli po Claeysu? Jedan od razloga svakako je činjenica da podela po Claeysu
ima dve grupe pacijentkinja (LEUKOREJA i SLIČAN NORMALNOM) koje nema podela po
Ison/Hayu, i u ove dve grupe pacijentkinja nalazi se 86 pacijentkinja. Podela po Ison/Hayu ima
grupu pacijentkinja kod kojih je nalaz “čist” (n=37), koje nemamo u podeli po Cleaysu. Među
ove 123 pacijentkinje nalazi se najveći broj od 41 pacijentkinje koje “nedostaju” u grupi KOKE
u podeli po Claeysu. Dakle, u takvim slučajevima smo nalaz povećanog broja PMN sa
laktobacilima (LEUKOREJA), prisustvo BIFIDO formi (sličan normalnom) ili čist nalaz,
smatrali “važnijim” od prisustva KOKA, i svrstavali pacijentkinje u odgovarajuće grupe.
Svakako da je i prethodno navedena mogućnost da ste gledali 10 drugih vidnih polja na kojima
nije bilo koka uticala u određenom broju slučajeva na ovu razliku. U ovo smo sada sigurniji jer
smo tokom ispitivanja i pregleda preparata na uvećanju x200 primetili da su KOKE raspoređene
po “regionima”, tako da su određeni delovi preparata bez koka, a na drugim su prisutne u
velikom broju. U našem ispitivanju nismo naišli na preparat koji je ravnomerno prekriven
kokama, kao što je to slučaj kod pacijentkinja sa BVF. Da smo ove pacijentkinje svrstali u
grupu koke, onda bismo imali 41 pacijentkinju manje u nekim drugim grupama. Ovo je
istovremeno dobar primer kako kategorizacija pacijentkinja može uticati na konačne rezultate
što je, kako će se videti u daljoj diskusiji, veoma važan problem koji prati svaku statističku
analizu i tumačenje dobijenih rezultata.
114
3.1.4.1 Uporedni rezultati - kriterijumi po Claeysu i Nugentu
Nugentova podela u odnosu na Claeys skor
(χ2=1155,27; df=10; p<0.001)
Sličan normalnom
Leukoreje
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
0%
10%
20%
30%
40%
NORMALAN
50%
60%
70%
INTERMED
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.11: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i Nugentu
Primenom Hi kvadrat testa utvrđeno je postojanje dobre asocijacije između podele po Nugentu
i podele po Claeys-u (χ2=1155,27; df=10; p<0.001) (Grafikon 3.11; Tabela 11, Prilog 1).
3.1.4.2 Uporedni rezultati kriterijumi po Claeysu i NP-6, 3, 2G
Na Grafikonima 3.12, 3.13 i 3.14 prikazani su rezultati koji, kao i prethodni, pokazuju dobru
asocijaciju između NP-6G (χ2=734,47; df=25; p<0.001); NP-3G (χ2=707,72; df=10; p<0.001);
NP-2G (χ2=464,27; df=5; p<0.001) i podele po Claeysu.
Nova Podela - 6 grupa u odnosu na Claeys skor
(χ2=1155,27; df=10; p<0.001)
Sličan normalnom
Leukoreje
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
0%
10%
NORMAL FULL
20%
30%
NORMAL MID
40%
50%
60%
NORMAL NULL
70%
BV NULL
80%
90%
BV MID
100%
BV FULL
Grafikon 3.12: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i NP-6G
115
Nova Podela 3 grupe u odnosu na Claeysovu podelu
(χ2=707,72; df=10; p<0.001)
Sličan normalnom
Leukoreje
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
0%
10%
20%
30%
40%
NORMALAN
50%
60%
INTERMED
70%
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.13: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i NP-3G
Nova Podela 2 grupe u odnosu na Claeysovu podelu
(χ2=464,27; df=5; p<0.001)
Sličan normalnom
Leukoreje
Koke
BV
Intermedijaran
Normalan
0%
10%
20%
30%
40%
50%
NORMALAN
60%
70%
80%
90%
100%
BV
Grafikon 3.14: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i NP-2G
U tabeli 3.1 su prikazane sve vrednosti Hi kvadrat testa u odnosu na sve poređene dijagnostičke
procedure i kao što se iz tabele vidi sve ove metode mogu se uspešno koristiti u dijagnozi BV.
Naravno za ovo ispitivanje je najvažnija činjenica da je NOVA PODELA i u osnovnoj varijanti
(NP-6G), a i modifikovana (NP-3G i NP-2G) pokazala da može uspešno da se koristi u
dijagnozi BV.
116
Tabela 3.1: Vrednosti Hi kvadrata u odnosu na sve poređene dijagnostičke metode
NP-6G
NP-3G
NP-2G
Nugent
χ2
Nugent
Ison/Hay
669,80
634,44
437,40
-
862,73
819,41
470,27
894,33
Claeys
Amsel
KOH
pH
734,47
707,72
481,25
1155,27
p<0.001
426,17
395,29
390,60
379,15
259,40
232,72
232,23
234,23
257,67
239,72
227,37
246,43
Da bi smo potvrdili ovu činjenicu tamo gde je to bilo moguće utvrđivali smo podudarnost NP
u odnosu na postojeće na osnovu kappa indeksa , a rezultati su prikazani u Tabeli 3.2.
Tabela 3.2: Podudarnost rezultata mikroskopskog pregleda vaginalnog sekrete različitih autora izražen u
vrednostima Kappa indeksa
NP-3G
κ
p
Nugent
κ
p
Nugent***
κ
p
Nugent
Ison/Hay
0.68
0.56
<0.001
<0.001
*
Ison/Hay (mod)
0.70
<0.001
Amsel
0,83
<0.001
Claeys
0.73
<0.001
Claeys**
0.90
<0.001
NP-2G
0,83
<0.001
*Grupe “čist” i “koke” pripojene normalnom nalazu
** Grupe “koke”, “leukoreja” i “sličan normalnom” pripojene normalnom nalazu
***Iz podele po Nugent-u isključene pacijentkinje sa intermedijarnim nalazom
Rangiranje kapa testa izvršeno je na osnovu kategorizacije po Byrtu kao što je to prikazano u
tabeli 3.3.
Tabela 3.3: Rangiranje kapa testa na osnovu kategorizacije po Byrt-u
Rangiranje po Byrtu
Odlično slaganje
Veoma dobro slaganje
Dobro slaganje
Umereno slaganje
Slabo slaganje
Vrednost κ indeksa
0,93-1
0,81-0,92
0,61-0,80
0,41-0,60
0,41
Prema datom rangiranju dobili smo sledeće rezultate:

Umereno slaganje
 NP-3G/Ison/Hay(κ=0,56; p<0.001);

Dobro slaganje
117
 NP-3G/Nugent: (κ=0,68; p<0.001);
 NP3G/ Claeys: (κ=0,73; p<0.001);
 Nugent/Ison/Hay: (κ=0,70; p<0.001);

Veoma dobro slaganje
 Nugent/Claeys : (κ=0,90; p<0.001);
 Nugent / Amsel: (κ=0,83; p<0.001);
 Nugent/NP3G : (κ=0,83; p<0.001).
Dakle, i vrednosti κ indeksa potvrđuju da su nalazi koje dobijemo NP dobro slažu sa nalazima
dijagnostičkih kriterijuma po Nugentu (zlatni standard), Ison/Hayu i Claeysu u dijagnozi BV.
Na osnovu iznesenih podataka možemo da zaključimo da je nova metodologija, koja
podrazumeva pregled mikroskopskog preparata na uvećanju x200, pokazala dobre rezultate u
odnosu na postojeće i da se kao takva može koristiti u dijagnozi BV. Pored toga, rezultati ovog
ispitivanja su pokazali da je NOVA PODELA (NP-6G) fleksibilna i da se može lako pretvoriti
u tri (NP-3G) grupe, bez značajnijeg uticaja na rezultate u dijagnozi BV. Dakle, pacijentkinje
iz NP-6G koje imaju mikroskopski nalaz NF i NM, kao i pacijentkinje sa nalazom BVF i BVM
predstavljaju jasno definisane kategorije, koje se u praktičnom i svakodnevnom kliničkom radu
mogu slobodno svesti u dve kategorije od kojih su jedne zdrave i ne zahtevaju terapiju, a druge
bolesne (BV) i zahtevaju terapiju. Međutim, pacijentkinje sa nalazom NN i BVN su prilično
nedefinisane u dijagnostičkom i terapijskom smislu i one zahtevaju dalja klinička ispitivanja.
Grafikon 3.15 je vizuelna potvrda koja govori o dobroj podudarnosti postojećih dijagnostičkih
kriterijuma u dijagnozi BV.
Grafikon 3.15: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda vaginalnog sekreta u dijagnozi bakterijske
vaginoze na osnovu različitih dijagnostičkih kriterijuma
118
Ali nam ovaj Grafikon ukazuje na još jednu važnu činjenicu, a to je da u svakom poređenju
različitih dijagnostičkih procedura moramo da se prilagođavamo zlatnom standardu odnosno
Nugentovoj podeli. Amselovi kriterijumi su klinički „zlatni standard i imaju dve grupe
pacijentkinja, Nugent kao „istraživački“ zlatni standard ima tri grupe pacijentkinja, Ison /Hay
pet, Claeys šest, a podela NP-G6 ima 6 grupa pacijentkinja i sve su, na ovaj ili onaj način,
morale da se prilagode poređenju sa zlatnim standardom da bi njihova dijagnostička vrednost
bila verifikovana. Uvođenje novih kategorija kao što su to uradili Ison/Hay i Claeys svakako je
poželjno jer je jasno da Nugentova klasifikacija veliki broj žena sa različitom vaginalnom
florom svrstava u tri grupe (zdrave/bolesne/neodređeno) i da je vaginalna flora, preciznije,
mikroskopski nalaz vaginalnog sekreta, mnogo kompleksniji nego što bi se to moglo zaključiti
iz Nugentovih kriterijuma koji uzimaju u obzir samo tri ćelijska morfotipa. Međutim, svako
uvođenje novih grupa ograničeno je činjenicom da svaka nova metodologija mora da „preživi“
poređenje sa zlatnim standardom, što je svakako jedan od razloga zbog kojih ni podela po
Ison/Hayu, a ni podela po Claeysu nisu našle širu primenu, ni u praktičnom ni u
naučnoistraživačkom radu. Tako su Claeys i sar. pokazali da bi neke druge bakterije (njihova
grupa „I-like“) i stanja vaginalne flore (leukoreja), različite od onih sadržanih u Nugentovom
skoru, mogle imati veći značaj u zbivanjima vezanim za PP udružen sa infekcijom i/ili
zapaljenjem. Uprkos tim činjenicama, veoma je mali broj radova koji je koristio Claeysovu
podelu. Jedan od retkih je rad Martinez-Martinez i sar [383] i bavi se poređenjem različitih
dijagnostičkih kriterijuma u dijagnozi BV.
Istovremeno, ovaj rad na najbolji način pokazuje probleme sa kojima se suočavamo u poređenju
metoda koje imaju različite grupe pacijentkinja. Tako su Martinez-Martinez i sar. [383] u svome
radu u dijagnozi BV koristili kriterijume po Amselu, Nugentu, Ison/Hayu i Cleaysu, dakle kao
što je rađeno i u našem ispitivanju, ali na manjem broju pacijentkinja (n=101). Da bi prevazišli
pomenute probleme i „ispoštovali“ zlatni standard (Nugent), oni su podelu po Ison Hayu i
Cleaysu sveli na tri „Nugentove“ grupe tako što su pacijentkinje iz drugih grupa smatrali
negativnim na BV. Ovakav pristup je prihvatljiv, posebno ako se mikroskopski nalaz svede
samo na dijagnozu BV, ali bi i neki drugi pristupi bili svakako prihvatljivi, a možda i bolji. Iako
se autor u svome radu ne bavi ovim pitanjima nego čitavu studiju svodi na ispitivanje
podudarnosti različitih dijagnostičkih kriterijuma u dijagnozi BV, mi ovaj problem raspodele
pacijentkinja i statističke analize smatramo veoma važnim za svaku studiju ovakvog tipa. Uvek
treba imati na umu činjenicu da Nugent ima dve suštinske prednosti u odnosu na sve druge
metodologije sa kojima se poredi. Prva je, kao što smo rekli, što je zlatni standard, a druga što
119
ima intermedijarnu grupu. Ako, na primer, poredite rezultate dobijene na osnovu Nugentovih
(3 grupe) i Amselovih kriterijuma (2 grupe) lako ćete doći do zaključka da je Nugent uvek u
prednosti. Već sama činjenica da ima intermedijarnu grupu je velika prednost, jer mu daje
mogućnost da se „reši“ nekih nejasnih i graničnih nalaza, dok Amselovi kriterijumi ne
dozvoljavaju takav „luksuz“ i pacijentkinja je ili zdrava ili ima BV. Svako ko ima imalo
iskustva u gledanju NPVS potvrdiće da ovakva “intermedijarna” grupa postoji i kad na
uvećanju x400 gledamo NPVS, te da bi u sličnom procentu (15-30%) bili veoma zadovoljni
ukoliko bi imali mogućnost da takve pacijentkinje svrstamo u intermedijaranu grupu.
Mislimo da bi korektna statistička obrada podataka u ovakvim studijama podrazumevala
statističke metode za nesavršeni zlatni standard ili, bolje, poređenje bez zlatnog standarda.
Takođe Martinez-Martinez i sar. [383] u svome radu ne pominju pacijentkinje sa leukorejom
(Claeys), što najverovatnije znači da ih u njihovom ispitivanju nije ni bilo, ili su kao u većini
studija PMN „zaboravljeni“.
120
3.2
MOGUĆI OMETAJUĆI ČINIOCI U DIJAGNOZI STANJA MIKROFLORE
VAGINE
U ovom delu biće prikazani rezultati i diskusija koji se odnose na mikroskopske forme koje su
se svojim fenotipskim karakteristikama ili učestalošću “nametnule” da budu uključene u ovo
ispitivanje. Ove podatke nećemo detaljnije analizirati, a oni pre svega treba da ukažu na
složenost u pokušajima da razgraničimo “normalan” od “patološkog” mikroskopskog nalaza
uvođenjem još tri moguća ometajuća (konfauding) činioca, KOKE, BIFIDO i LEPTO forme.
Na Grafikonima 3.20 i 3.21 prikazana je njihova raspodela u odnosu na mikroskopski nalaz
vaginalne flore (NP-6G) i broj PMN (normalan ili patološki).
3.2.1 KVASNICE IZ RODA KANDIDA (Candida spp.)
Tokom ovog ispitivanja nisu korišćene specijalne podloge za detekciju kvasnica iz roda
Candida (CA). Najvažniji razlog zbog koga to nismo učinili jeste stav da izolacija CA kulturom
ne znači i infekciju CA, odnosno da pacijentkinje kod kojih na NPVS sa 10% KOH
mikroskopski detektujemo prisustvo hifa i/ili spora gljivica, najverovatnije znači prisustvo
infekcije, odnosno da takvu pacijentkinju treba lečiti bez obzira na prisustvo simptoma.
Detekcija CA na podlozi krvni agar bio je usputni nalaz koji je stizao kasnije, a kao što smo
rekli osnovni način u dijagnozi i lečenju pacijentkinja bio je mikroskopski nalaz NPVS sa 10%
KOH. Tako smo na osnovu ovog nalaza CA detektovali kod 115/704 (16,3%) pacijentkinja, a
to su ujedno pacijentkinje koje su lečene zbog infekcije CA antimikoticima. Kulturom na
krvnom agru CA je identifikovana kod 82/704 (11,6%). Mnogo interesantnija su podaci koje
smo dobili pregledom preparata bojenog po Gramu. U prvom gledanju preparat po Gramu na
uvećanju x1000 (Nugentova metodologija i broj PMN) CA je otkrivena kod 99/704 (14,0%)
pacijentkinja, da bi svakim narednim gledanjem (Ison Hay, Claeys) na uvećanju x1000 taj broj
rastao, tako da smo na kraju CA detektovali kod 165 od 704 (23,4%) pacijentkinja. Kako smo
se tokom ispitivanja odlučili za metodologiju je po kojoj je preparat po Gramu gledan pod
imerzijom na uvećanju x200, broj pacijentkinja kod kojih smo detektovali CA dostigao je 241
od 704 (34%) pacijentkinja (Grafikon 3.16).
Dakle metodologija gledanja mikroskopskog preparata na uvećanju x200 omogućila je
detekciju CA kod oko još jedne trećine pacijentkinja. Takođe, treba podsetiti da je površina
vidnog polja na mikroskopskom uvećanju x200 oko 25 puta veća od površine vidnog polja na
uvećanju x1000.
121
Detekcija C. albicans kulturom na krvnom agru i različitim
mikroskopskim uvećanjima
Kultura
NPVS+KOH
Gramx1000(1x)
Gram x1000 (4X)
Gram x200
40,0%
34,0%
35,0%
30,0%
23,4%
25,0%
20,0%
16,0%
15,0%
14,0%
11,6%
10,0%
5,0%
0,0%
C. Albicans
Grafikon 3.16: Detekcija C. albicans kulturom na krvnom agru i različitim mikroskopskim uvećanjima
(1X): prvo gledanje na uvećanju x1000; (4X): isti preparat po Gramu posle četiri gledanja na uvećanju x1000;
Slika 3.1: C. albicans - hifa,PMN i “blue cells” (x200)
122
Slika 3.2: Podela na 25 jednakih polja
Slika 3.3: Da li na osnovu 20 VP na uvećanju X1000 možemo objektivno proceniti kakav je nalaz na
preostalih 17 500 VP
123
Ako sliku. 3.1 podelimo na 25 jednakih polja (krugova) (Slika 3.2) onda površina jednog kruga
odgovara površini 1 vidnog polja na uvećanju x1000. Znači ukoliko bismo ovaj preparat gledali
na uvećanju x1000, hife gljivica videli bi na najviše 4 vidna polja. Ako dijagnostikujemo BV
po Nugentovim kriterijumima obavezni smo da pregledamo 5-10 VP, dakle površinu koja je
manja od ove na Slici 3.3. Ako pri tome znamo da brojanje, sabiranje, deljenje i konačno
računanje Nugentovog zbira zahteva dosta vremena, onda je logično pretpostaviti da se u
takvim ispitivanjima veoma retko pregleda i 20 VP. Ako bi, dakle, površinu naše fotografije
gledali na uvećanju x1000 veća je verovatnoća da hifu ne nađemo. Pri tome ne treba zaboraviti
da je površina slike, površina jednog od 700 VP na uvećanju x200 (pretpostavljena površina
obojenog dela preparat je 600 mm2; Tabela 2-2, Metodologija), odnosno da na toj površini ima
17.500 VP na uvećanju x1000 (Slika 3.3). Ovi podaci, naša iskustva i rezultati dovode u pitanje
opšteprihvaćeni stav po kome je pregled NPVS sa 10% KOH senzitivniji u detekciji CA u
odnosu na preparat po Gramu ili PAPA testu [29]. Ono što je sigurno, 10% KOH značajno
povećava osetljivost u otkrivanju CA u odnosu na NPVS sa fiziološkim rastvorom i da je 10%
KOH glavni razlog za bolje rezultate u odnosu na preparat bojen po Gramu.
Slika 3.4: C. albicans – hife (FK, X400)
124
Međutim, treba imati u vidu da se nativni preparat uglavnom gleda na uvećanju x400, i načelno,
na mnogo većem broju vidnih polja nego što je to slučaj sa Nugentovom metodologijom, a i
kada se gleda isti broj vidnih polja površina vidnog polja na uvećanju x400 je 6,25 veća od one
na x1000. Verujemo da je veća površina pregledanog preparat na NPVS jedan od važnijih
faktora koji utiče na bolje rezultate u detekciji CA na NPVS u odnosu na druge metode na
kojima se preparat gleda na većem uvećanju, odnosno na manjoj površini. U literaturi nismo
našli ni jedno ispitivanje koje bi na ovaj način poredilo različite metode u dijagnozi CA. Uz
podatak da 5-30% pacijentkinja ima asimptomatsku vaginalnu kandidozu jasno je od kakvog je
značaja brza i jednostavna dijagnostika jedne od najčešćih vaginalnih infekcija. Svakako
mislimo da je površina pregledanog preparata najvažniji faktor zbog koga smo dobili ovakve
rezultata, ali mislimo da su još dva faktora tome značajno doprinela. Prvi se odnosi na primenu
imerzije na uvećanju x200 koja, iz nama nepoznatih razloga (najverovatnije se radi o optičkim
fenomenima), čini i spore i hife gljivica vidljivijim nego kada se radi pregled bez imerzije. To
najbolje ilustruju Slike 3.5 i 3.6, jer na prvoj vidimo masu PMN i EĆ bez mikroskopskih
elemenata koji bi ukazivali na prisustvo CA.
Međutim ukoliko na uvećanju x200 stavimo kap imerzije jasno se prikazuje hifa CA.
Drugi, možda još bitniji, faktor je činjenica da se CA najčešće „krije“ na delovima preparata
gde se nalaze nakupine EĆ. Zbog metodologije koju su predložili Ramsey i sar. ove nakupine
nismo ni gledali nego smo ih smatrali neadekvatnim za ispitivanje, a verujemo i da ih najveći
broj mikrobiologa preskače i smatra neadekvatnim za pregled. Ubeđeni smo da su nakupine EĆ
ne samo mesto gde se najčešće nalaze spore i hife gljivica, nego da ovi delovi preparata
predstavljaju važan, ako ne i najvažniji izvor informacija za odgovarajuću procenu preparata
po Gramu. Dakle, pored CA, nakupine EĆ su često »mesto okupljanja« PMN i koka, a i druge
mikroskopske forme i oblici se tu nalaze u većem broju. Ako imamo preparat sa dosta ŠF, onda
je njihov broj u nakupinama EĆ, uopšteno, još veći, a isto važi i za NŠF odnosno pacijentkinje
sa BV
Ovo napominjemo zato što je pregled određenog broja polja u kome se nalaze EĆ obavezni deo
našeg protokola, radi preciznije kvantifikacije ŠF i NŠF. Tako neki preparati deluju kao prilično
„čisti“, odnosno na njima nalazimo veoma mali broj celularnih elemenata, ali ako pogledamo
nakupine EĆ u njima se može naći značajan broj i ŠF i NŠF, tako da su u ovom ispitivanju
pacijentkinje iz grupe NULL, u stvari pacijentkinje kod kojih i u nakupinama EĆ, i u
međuprostorima nalazimo vrlo mali broj ŠF i NŠF.
125
Slika 3.5: Masa PMN, “blue cells”, ne vidi se hifa CA (x200), skrivena u nakupinama EĆ i PMN
Slika 3.6: Fino pomeranje mikrometra +imerzija na uvećanju X200 “razotkrivaju” skrivenu hifu CA
.
126
Na osnovu preko 10.000 mikroskopskih pregleda u kratkom vremenskom periodu,
protokol za otkrivanje CA izgledao bi ovako: pregled se počinje na uvećanju x200 sa imerzijom
i, nezavisno od mikroskopske slika pozadine (NF,NN, NM, BVF, BVM, BVN), ukoliko na
takvoj pozadini imamo patološki broj PMN (PMN2 i PMN3), onda verovatnoća da nađemo i
CA iznosi oko 80%. U takvim slučajevima kreće se u „potragu“ za CA na različitim delovima
preparata, dva kraja i sredina, na uvećanju x200 + imerzija. Što pređemo veći deo preparata
verovatnoća da ćemo je naći raste, posebno u najgušćim (EĆ) delovima preparata. I zaista, u
više od 90% slučajeva najveći broj spora i hifa gljivica nalazi se u ili oko nakupina EĆ. Treba
reći da je (semi)kvantifikacija CA mnogo teži zadatak u odnosu na druge forme, kao i donošenje
zaključaka na osnovu takvih nalaza (vidi kasnije).
Ako pogledamo fotografije 3.6 i 3.7 na njima dominira nalaz ogromnog broja PMN, u desnoj
polovini vide se dve ćelije koje se boje plavo(„blue cells“) i vrlo su česte kod infekcije CA. Ove
dve pacijentkinje su i na preostalom delu preparata imala vrlo retke spore i hife gljivica. Da li
je moguće da je ovako veliki broj PMN prouzrokovan prisustvom retkih spora i hifa gljivica,
koje smo našli na preparatu, ili su možda spomenute koke mogući uzrok, ili, jednostavno, neka
od onih 95% nekultivisanih i nama nepoznatih bakterija koju ne prepoznajemo na mikroskopu
predstavlja uzrok ovako velikom broju PMN. Dakle, ukoliko prihvatimo mogućnost da ovako
mali broj spora i/ili hifa može da bude razlog patološkom broju PMN, onda je sasvim realno
prihvatiti da deo pacijentkinja iz grupe „leukoreja“ (Claeys) zapravo ima infekciju CA koju
ispitivač ne otkriva mikroskopskim pregledom. Takođe je moguće i koke smatrati uzrokom
patološkog broja PMN. Međutim još jedna grupa pacijentkinja je verovatno mogući uzrok
neslaganja u ovakvim situacijama, a jedan od primera pokušaćemo da objasnimo slikama 3.7 –
3.10. Ako pogledamo Sliku 3.7 (uvećanje x200) vidimo da pored velikog broja PMN imamo i
veliki broj Gram pozitivnih ŠF, a nemamo CA, dakle pacijentkinja bi mogla da uđe u grupu sa
idiopatskom leukorejom, ako bi radili metodologijom po Cleaysu. Ako ovaj nalaz pogledamo
na uvećanju x1000 (Slika 3.8) ili na još većem (slika 3.9) onda vidimo dosta Gram pozitivnih
ŠF koje smo na uvećanju x200 tumačili kao normalnu floru, odnosno laktobacile.
127
Slika 3.7: Uvećanje x200 Gram pozitivne štapićaste forme koje mogu odgovarati različitim sojevima
laktobacila ili različitim sojevima korineoformnih ili bifido bakterija
Slika 3.8: Ni na uvećanju x1000 ne možemo razlikovati Gram pozitivne forme: Lactobacillus?
Coryneobacteria? Bifidobacteria?; “Biopsija preparata” i QPCR bi možda bili od pomoći?
128
Slika 3.9: Ni na uvećanju preko x1000 ne znamo šta predstravljaju ove Gram pozitivne forme u lancima
koje se neravnomerno boje, uz povećan broj PMN
Slika 3.10: Na osnovu podataka iz literature i ličnog iskustva verujemo da se u najvećem broju ovakvih i
sličnih nalaza koji liče na normalan radi o različitim sojevima Corynebacteria i Bifidobacteria
129
Kako smo i tada bili upoznati sa Claeys-ovom podelom u kojoj se debeli, uglavnom kratki Gram
pozitivni štapići, smatraju za L. crispatus, a Gram pozitivne ŠF koje su tanje, manje ili više
izduženi pripadaju drugim sojevima laktobacila (L. jensenii, L. gasseri, L. iners ili možda neki
drugi), smatrali smo dakle da su ovo ti drugi laktobacili. Međutim, s iskustvom u gledanju
mikroskopskog preparata (vidi tabelu 3 u Metodologiji) počeli smo da sumnjamo da se radi o
»drugim« laktobacilima i da je moguće da se radi o nekoj drugoj vrsti bakterija. Kao što se vidi
na uvećanju preko x1000 (Slika 3.9) ove Gram pozitivne forme se neravnomerno boje, kao da
formiraju lance, kratki su, nemaju ravne nego češće čekićaste krajeve, ne granaju se. Naravno,
nismo sigurni da li su ovo sojevi “nekih” laktobacili ili nisu, ali ipak mislimo da ove forme
pripadaju nekoj drugoj vrsti bakterija(najverovatnije Corynebacterium, Bifidobacterium). Mi
smo kod ovakvih nalaza pacijentkinje svrstavali u BIFIDO grupu, pre svega zbog ovog
neravnomernog bojenja i čekićastih krajeva. Jedini način da se tako nešto utvrdi jesu uporedne
studije preparata po Gramu i Q-PCR. Flora prikazana na fotografijama predominantna je na
celom preparatu. Na pojedinim delovima preparata ona je veoma gusta i nagomilana, kao što
se to vidi na Slici 3.10. Po našem mišljenju, mogla bi se načiniti svojevrsna ciljana »biopsija«
preparata po Gramu, pod kontrolom mikroskopa, i uzorak podvrgnuti Q-PCR. Da preparat po
Gramu može da se koristi u ovakvim retrospektivnim studijama pokazala je u svojoj
izvanrednoj studiji Srinivasan sa sar. [410].
U našoj laboratoriji smo uzimali uzorak sa preparata po Gramu, ciljano sa površine oko 1 mm2
i izolovali DNA (S. Jovandić), ali, naravno, nismo imali prajmere na osnovu kojih bi
identifikovali poreklo DNK. Verujemo da će tehnika Q-PCR biti najvažnija u budućim
ispitivanjima mikrobioma jer pored različitosti vrsta i njihov kvantitativni odnos igra vrlo
važnu, a možda i važniju ulogu. Na kraju, BV predstavlja polimikrobni sindrom u kome dolazi
do smanjenja broja jedne vrste bakterija i enormnog porasta (1000-10.000X) drugih bakterija,
ili G. vaginalis je prisutna i kod pacijentkinja sa normalnim nalazom, i samo od njenog broja
zavisi da li pacijentkinja ima normalnu floru ili BV. Zbog toga smo u ovom radu i napravili
semikvantitativnu podelu kod pacijentkinja kod kojih smo pod mikroskopom detektovali CA.
Svoje iskustvo smatramo interesantnim i ilustrativnim jer ukazuje na jednu važnu činjenicu koja
se ne pominje u dosadašnjim istraživanjima. Otkrivanje CA na mikroskopskom preparatu
upravo je srazmerno površini preparata koju pregledate, imerzija na uvećanju x200 olakšava taj
postupak, a treba je tražiti u nakupinama EĆ gde se najčešće i “krije”.
130
Slika 3.11: Fino pomeranje mikrometra +imerzija na uvećanju X1000 “razotkrivaju” skrivenu hifu CA
Slika 3.12: Fino pomeranje mikrometra +imerzija na uvećanju X200 “razotkrivaju” skrivenu hifu CA
131
Slika 3.13: Fino pomeranje mikrometra +imerzija na uvećanju X200 “razotkrivaju” skrivenu hifu CA
Slika 3.14:Fino pomeranje mikrometra +imerzija na uvećanju X200 “razotkrivaju” skrivenu hifu CA
132
Broj PMN i CA kod pacijentkinja sa normalnim nalazom
350
300
287
250
200
153
150
103
100
50
25
0
NORMALAN (Nugent)
PMN0+PMN1
PMN2+PMN3
CA+PMN2+PMN3
CA+PMN1+PMN2
Grafikon 3.17: Broj PMN i CA kod pacijentkinja sa normalnim nalazom
Na primeru podele po Nugent-u prikazaćemo kako bi izgledali rezultati, ako u Nugent-ovu
podelu uključimo i nalaz CA. Kod 153 od 440 (34,7%) pacijentkinja sa Nugentovim normalnim
nalazom nađen je patološki broj PMN, u grupi intermedijarnih 26,7% (36/112), a u grupi sa BV
44,5% (66/148), dale ukupno 255 pacijentkinja sa patološkim nalazom PMN. Kao što smo već
rekli CA je najčešći uzrok povećanog broja PMN i sada ćemo prikazati kako bi ti rezultati
izgledali, ako u analizu uključimo pored broja PMN („prvi konfauding faktor“) i mikroskopski
nalaz CA („drugi konfauding faktor“).
Na Grafikonu 3.2056 su prikazane pacijentkinje sa Nugentovim normalnim nalazom i raspodela
u odnosu na broj PMN i detekciju CA. Tako je u ovoj grupi CA detektovana kod 29,0%
(128/440), od kojih je 25 (19,5%) imalo normalan broj PMN, a 103 (80,5%) su imale patološki
broj PMN. Imamo dva važna podatka: prvi, da 19,5% pacijentkinja sa CA nema povećan broj
PMN, i drugi, i da kod 50/153 (32,6%) pacijentkinja CA nije nađena kao mogući uzrok
povećanog broja PMN. Dakle u ovakvim slučajevima jedna je mogućnost da je uzrok
patološkom broju PMN nepoznat i onda bi ove pacijentkinje mogle teoretski da pripadnu
Claeyesovoj grupi sa idiopatskom leukorejom, što je oko 11% (50/440) pacijentkinja sa
predominatnom laktobacilarnom florom. Druga je mogućnost da kod ovih pacijentkinja nismo
detektovali CA mikroskopskim pregledom, što naravno ne može isključiti infekciju CA, ni
mogućnost da je ona uzrok povećanom broju PMN. Međutim kao što smo već rekli oko 20%
pacijentkinja sa infekcijom CA nije imalo povećan broj PMN, tako da CA sigurno nije jedini
133
uzrok patološkom broju PMN. S druge strane od . Kao što smo rekli u metodologiji u ovu grupu
su svrstane i pacijentkinje kod kojih je na čitavom preparatu nađeno svega nekoliko spora, tako
da smo tokom ispitivanja često postavljali pitanje da li je moguće da ovako mali broj spora ili
hifa gljivica može biti razlog za tako veliki broj PMN, kao što se to vidi na fotografijama.
Ni danas nemamo odgovor na ovo pitanje, ali mislimo da ovi rezultati svakako ukazuju na
potrebu daljih ispitivanja koja bi dala odgovor na ovo pitanje.
U Nugentovoj intermedijarnoj grupi 36/112 pacijentkinja imalo je patološki nalaz PMN, a kod
48/112 (42,8%) je mikroskopskim pregledom detektovana CA. Od njih 48 patološki broj PMN
imalo je 28, a 20je imalo normalan broj PMN, tako da u ovoj grupi 41,6% (20/48) pacijentkinja
sa CA nije imala povećan broj PMN, a kod8/36(22,2%) pacijentkinja nije nađena CA kao
mogući uzrok povećanog broja PMN.
Od 148 pacijentkinja kod kojih je na osnovu kriterijuma po Nugentu postavljena dijagnoza BV,
66 (44,5%) je imalo patološki broj PMN, a kod 63 (42,5%) je detektovana CA. Patološki broj
PMN nađen je kod 56 (88,8%) od 63 pacijentkinje, dok je 7 pacijentkinja (11,2%) imalo nalaz
CA i normalan broj PMN. Dakle u grupi BV 10 (15,1%) od 66 pacijentkinja nije imalo .
Broj PMN i CA kod pacijentkinja sa BV
90
82
80
70
66
60
56
50
40
30
20
7
10
0
BV (Nugent)
PMN0+PMN1
PMN2+PMN3
CA+PMN2+PMN3
CA+PMN1+PMN2
Grafikon 3.18: Broj PMN i CA kod pacijentkinja sa BV
134
Raspodela PMN i CA u tri grupe na osnovu podele po
Nugentu
32%
15%
22%
58%
89%
80%
42%
20%
NORMALAN
NORMALAN BR PMN SA CA
11%
INTERMEDIAL
PATOLOŠKI BR PMN SA CA
BV
PATOLOŠKI BR PMN BEZ CA
Grafikon 3.19: Raspodela PMN i CA u tri grupe na osnovu podele po Nugentu
Treba primeti da se broj pacijentkinja koje imaju mikroskopski nalaz CA i normalan broj PMN
i pacijentkinja sa povećanim brojem PMN bez CA značajno razlikuje u ove tri grupe
pacijentkinja što je prikazano na Grafikonu 3.19.
Kao što je rečeno, generalno je poznato da je infekcija CA jedan od najčešćih uzroka povećanog
broj PMN u vaginalnom sekretu, ali nemamo precizniji odgovor na pitanje koliki je procenat
pacijentkinja koje imaju infekciju CA i povećan broj PMN, a koliko ih ima infekciju i normalan
broj PMN. U stvari morali bi preciznije postaviti ovo pitanje s obzirom na činjenicu da moramo
razlikovati infekciju CA, od kolonizacije CA. Poznato je da izolacije CA kulturom, ne znači i
infekciju CA, a sa druge strane većina autora veruje da detekcija CA mikroskopskim pregledom
ukazuje na veću verovatnoću za infekciju nego za kolonizaciju CA. Ipak imajući pred očima
mikroskopske slike i pacijentkinje iz grupe CA NULL, ponovićemo to opet, teško je poverovati
da tako mali broj hifa i spora gljivica može biti razlog tako jakog inflamatornog odgovora.
Dakle mi danas ne znamo zašto neke pacijentkinje, kod kojih smo kulturom izolovali ili
mikroskopski detektovali CA, imaju povećan broj PMN, a kod drugih je taj broj normalan.
Jedna od mogućih hipoteza bila bi da pacijentkinje sa povećanim brojem PMN imaju infekciju,
dok bi odsustvo PMN govorilo u prilog kolonizacije CA, što bi opet moglo da bude u vezi sa
simptomima i kliničkom slikom kod tih pacijentkinja, o čemu će se kasnije nešto više govoriti.
Ali ako pogledamo Grafikon na kome se jasno vidi da su ove razlike značajne u odnosu na
Nugentove tri grupe, ne možemo a da ne pretpostavimo da je druga bakterijska flora (laktobacili
135
ili BVAB) možda bitan faktor koji određuje stepen inflamatornog odgovora (broj PMN) na
prisustvo CA.
Ono što je “nelogično” u ovako “logičnoj” pretpostavci je činjenica da je najviše pacijentkinja
sa patološkim brojem PMN (44,5%) nađeno u grupi sa BV, u kojoj je i najveći procenat
pacijentkinja su pacijentkinje sa CA (42,5%). Nelogično iz dva razloga, prvi jer je BV kao što
smo rekli poremećaj koji se karakteriše odsustvom PMN, a drugi koji se odnosi na podatak da
CA odgovara više kisela nego bazna sredina. Iz dobijenih rezultata mogli bi smo zaključiti da
CA više odgovara bazna nego kisela sredina, a da oko 15% pacijentkinja sa BV ima povišen
broj PMN, a da kod njih nismo identifikovali CA. Podatak da 29% pacijentkinja iz Nugentove
normalne grupe ima CA, govori u prilog tome da CA, podjednako dobro “uspeva” i u baznoj i
kiseloj sredini i da su neki drugu faktori koji nisu pH važniji za njen rast i razmnožavanje.
Jedan, a verovatno i najvažniji od tih drugih faktora, je sastav mikrobiološke zajednice, odnosno
potencijalni “protivnici” CA u borbi za hranu, kiseonik i druge faktore koji o(ne)mogućavaju
da ovaj komensal postane patogen, U prilog ovome govore podaci koji se odnose na
intermedijarnu grupu, u kojoj je broj pacijentkinja sa CA i normalnim brojem PMN značajno
veći od pacijentkinja sa normalnim nalazom i BV, što samo potvrđuje da bi ovu grupu
pacijentkinja u budućim ispitivanjima trebalo mnogo detaljnije analizirati nego što je to do sada
bio slučaj.
Broj PMN i nalaz C. albicans u tri grupe pacijentkinja na
osnovu Nugentove podele
300
262
250
200
150
103
100
75
56
50
50
25
56
28
20
8
10
7
0
NORMALAN
INTERMEDIAL
NORMALAN BR PMN SA CA
NORMALAN BR PMN BEZ CA
PATOLOŠKI BR PMN SA CA
PATOLOŠKI BR PMN BEZ CA
BV
Grafikon 3.20: Raspodela pacijentkinja sa patološkim i normalnim brojem PMN i pozitivnim ili
negativnim mikroskopskim nalazom na CA u tri grupe podele po Nugent-u
136
Dakle ako sad u svetlu prethodne diskusije o Nugentovim grupama i različitom broju PMN
(prvi “konfauding faktor”) pogledamo kakvi su rezultati posle uvođenja u analizu i drugog
“konfauding” faktora (CA), onda ćemo videti da teoretski više nemamo 6 grupa (normalne,
intermedijarne i BV sa normalnim i patološkim brojem PMN) nego imamo 12 grupa. U svakoj
od tri Nugentove grupe, možemo razlikovati pacijentkinje sa normalnim brojem PMN sa ili bez
CA, i pacijentkinje sa patološkim brojem PMN, sa ili bez CA, kao što je to prikazano u
Grafikonu 3.20.
Ako prihvatimo činjenicu da PMN i CA, pojedinačno, mogu uticati, na primer, na koncentracije
nekog inflamatornog medijatora onda se ovakva podela podrazumeva, ali je problem što smo
od Nugentove tri grupe stigli do 12 grupa, od kojih pet ima 20 ili manje pacijentkinja, tako da
bez obzira na ukupan broj pacijentkinja (n=700), ovo značajno otežava ili čini nemogućom
statističku analizu ovako kategorisanih pacijentkinja. Ovo istovremeno govori koliko je teško
donositi zaključke o koncentracijama inflamatornih medijatora, s obzirom da veliki broj
faktora, koji na njih mogu uticati, a mi smo to pokazali samo uvođenjem dva (PMN i CA) u
Nugentovu jednostavnu podelu (samo tri grupe pacijentkinja), a možemo zamisliti kako bi
izgledala ovakva analiza u podelama po Ison/Hayu i Claeysu koji imaju 5 odnosno 6 grupa
pacijentkinja.
S obzirom da NP ima 6 grupa, ali da se suštinski ovih 6 grupa mogu svesti samo na dve, kao i
na razlike u odnosu na Nugentovu podelu o kojima smo već govorili odlučili smo se da istu
ovakvu analizu uradimo kod pacijentkinja koje su podeljen u različite grupe na osnovu NP-6G.
Na narednim grafikonima prikazana raspodela CA po različitim grupama na osnovu NP i
semikvantitativne podele CA.
Na Grafikonu 3.21 prikazana je raspodela pacijentkinja u kojoj su pacijentkinje uz grupa
NF, NM i NN stavljene u jednu grupu (NORMAL), a isto je urađeno sa pacijentkinjama BVF,
BVM i BVN (BV), a u sledeće tri kolone je prikazana semikvantitativna raspodela CA (CAF,
CAM i CAN) a sve to u odnosu na broj PMN, podela u četiri grupe kako je to objašnjeno u
metodologiji i prethodnoj diskusiji.
137
Distribucija C. albicans u odnosu na broj PMN x200
(4 grupe)
(χ2=386,682; df= 12; p<0.001)
PMN3
PMN2
PMN1
PMN0
0%
20%
40%
NORMALAN
BV
60%
CA NULL
80%
CA MID
100%
CA FULL
Grafikon 3.21: Raspodela pacijentkinja kod kojih je mikroskopskim pregledom x200 detektovana CA koja
je na osnovu semikvantitativne podele razvrstana u tri podgrupe u odnosu na broj PMN
Distribucija C. albicans u odnosu na broj PMN x200
(2 grupe)
350
313
300
250
187
200
150
100
79
57
52
50
11
0
NORMALAN
PATOLOŠKI
PMN
NORMAL
BV
CA
Grafikon 3.22: Raspodela pacijentkinja sa normalnim nalazom vaginalnog sekreta, BV i mikroskopskim
nalazima CA u odnosu na grupe sa normalnim i patološkim broj PMN
Na Grafikonu 3.22 je prikazana ista podela samo što su sve pacijentkinje sa CA svrstane u jednu
grupe, a 4 grupe PMN svedene na dve, one sa normalnim i patološkim brojem PMN.
138
Na Grafikonima 3.23 i 3.24 prikazana je raspodela pacijentkinja sa CA po grupama na osnovu
NP-6G odnosno NP-2G, pri čemu su pacijentkinje sa nalazom CA prikazane semikvantitativno
(tri grupe CAF, CAM i CAN) ili su spojene u jednu grupu CA.
Raspodela pacijentkinja sa semikvantitativnim nalazom C.
albicans po grupama na osnovu NP-6G
BV FULL 0%
58%
BV MID 0%
8%
42%
BV NULL 0%
15%
22%
34%
57%
0%
66%
NORMAL MID
Candida NORMALAN
20%
0%
30%
40%
Candida BV
8%
28%
0%
50%
60%
Candida CA NULL
70%
8%
4% 6%
22%
74%
NORMAL FULL
10%
2%
27%
63%
NORMAL NULL
0%
20%
10% 2%
15%
7% 3%
80%
Candida CA MID
90%
100%
Candida CA FULL
Grafikon 3.23: Raspodela pacijentkinja sa semikvantitativnim nalazom CA (CAF, CAM, CAN) po
grupama na osnovu NP-6G
Nova Podela - 6 grupa u odnosu na Candida (spojena u jednu grupu)
BV FULL 0%
58%
BV MID 0%
42%
42%
BV NULL 0%
58%
57%
43%
63%
NORMAL NULL
0%
66%
NORMAL MID
38%
0%
74%
NORMAL FULL
0%
10%
20%
Candida (spojeno) NORMALAN
30%
40%
34%
0%
50%
60%
Candida (spojeno) BV
70%
26%
80%
90%
100%
Candida (spojeno) CANDIDA
Grafikon 3.24: Raspodela pacijentkinja sa semikvantitativnim nalazom CA (CAF, CAM, CAN) po
grupama na osnovu NP-6G
139
Iz ova dva grafikona se vidi da su pacijentkinje sa BV imala veću učestalost CA u odnosu na
grupu sa normalnim nalazom. Tako su 83 (47,7%) pacijentkinje sa BV imale CA, a 29,8%
(158/530) pacijentkinja sa normalnim nalazom imalo je CA.
Na Grafikonu 3.25 su pacijentkinje sa patološkim brojem PMN podeljene u dve grupe, one
kod kojih su mikroskopskim pregledom na uvećanju x200 nađena CA i one kod kojih CA nije
nađena, a sve to u po grupama na osnovu NP-6G.
Pacijentkinje sa patološkim brojem PMN sa ili bez CA po
grupama na osnovu NP-6G
93,1%
BV FULL
6,9%
80,0%
BV MID
20,0%
82,0%
BV NULL
18,0%
75,0%
NORMAL NULL
25,0%
67,7%
NORMAL MID
32,3%
81,7%
NORMAL FULL
0%
10%
20%
30%
40%
Patološki broj PMN sa CA
18,3%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Patološki broj PMN Bez CA
Grafikon 3.25: Pacijentkinje sa patološkim brojem PMN sa ili bez CA po grupama na osnovu NP-6G
Od 699 pacijentkinja 526 (75,2%) je imalo normalan nalaz (NF+NM+NN), a 173
(24,8%) pacijentkinje su imale BV (BVF+BVM+BVN). Posle toga smo analizirali rezultate
semikvantitativnog određivanja broja PMN na različitim mikroskopskim uvećanjima, i
zaključili da pregled na uvećanju x200 daje najbolje rezultate i na osnovu takve metodologije
u našem ispitivanju od 699 pacijentkinja 445 (63,6%) je imalo normalan nalaz PMN, 254
(36,4%) patološki nalaz PMN. Sada u analizu uvodimo i mikroskopski nalaz CA na uvećanju
x200 i rezultati pokazuju da smo takvim pristupom CA detektovali kod 34,1% pacijentkinja
239/699. Dakle sada znamo da je od 699 pacijentkinja 173 imale BV, 254 su imale patološki
broj PMN, a kod 239 smo mikroskopskim pregledom detektovali CA. Najveći broj
pacijentkinja sa CA pripada podgrupi CAN 54,8% (131/239), 73 (30,5%) podgrupi CAM i
najmanji u grupi CAF 14,7% (35/239).
140
Raspodela pacijentkinja u odnosu na broj PMN i nalaz
C. albicans u grupi sa normalnim nalazom na osnovu NP6G
350
312
300
250
189
200
150
122
83
100
50
61
42
32
16
20
11
57
40
19
8
35
5
0
NF
NM
NN
NORMAL
NORMALAN BR PMN SA CA
NORMALAN BR PMN BEZ CA
PATOLOŠKI BR PMN SA CA
PATOLOŠKI BR PMN BEZ CA
Grafikon 3.27: Raspodela pacijentkinja sa različitim beojem PMN i nalazom CA u grupi sa normalnim
nalazom vaginalnog sekreta na osnovu NP-6G
Raspodela pacijentkinja u odnosu na broj PMN i nalaz C. albicans u
grupi sa normalnim nalazom na osnovu NP-2G
350
312
300
250
200
150
122
100
79
57
50
65
35
17
12
0
NORMAL
NORMALAN BR PMN SA CA
BV
NORMALAN BR PMN BEZ CA
PATOLOŠKI BR PMN SA CA
PATOLOŠKI BR PMN BEZ CA
Grafikon 3.26: Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN i nalazom CAkod pacijentkinja sa
normalnim nalazom i BV na osnovu NP-2G
Kod 526 pacijentkinja sa normalnim nalazom vaginalne flore (NP-2G) kod 157(29,8%) je
detektovana CA mikroskopskim pregledom, dakle 369 (70,2%) pacijentkinja je imalo normalan
nalaz bez CA.
141
Od 369 pacijentkinja sa normalnim nalazom vaginalne flore, i bez CA, 312 (84,5%) je imalo
normalan broj PMN, a 57 (15,5%) patološki broj PMN.
Grupa sa BV nije prikazana posebno ali je u Grafikonu 3.27 prikazan uporedni nalaz raspodele
pacijentkinja u odnosu na mikroskopski nalaz broja PMN i detekcije CA, kod pacijentkinja sa
normalnim nalazom i BV na osnovu podele NP-2G. Takođe, od 173 pacijentkinje sa BV kod
82(65+17; 47.9%) mikroskopski su viđene spore ili hife gljivica, dakle samo 52,1%
(n=79+12=91) pacijentkinja imalo je BV bez CA. Ako sada analiziramo grupu sa BV onda
vidimo da je 87,7% (79/91) imalo normalan broj PMN, dok je 12,3% (n=12) pacijentkinja
imalo BV sa povećanim brojem PMN, ali bez CA. S druge strane od 239 pacijentkinja sa CA
njih 187 (78,2%; 122+65) imalo je patološki broj PMN, dok su 52 (21,8%; 35+17) pacijentkinje
sa CA imale normalan broj PMN.(Grafikon 3.27)
U Grafikonu 3.26 je prikazana raspodela u odnosu na broj PMN i nalaz CA kod
pacijentkinja koje su na osnovu podele NP-6G imale normalan nalaz (NF+NM+NN). Ukupno
gledajući, kod 57 od 179 (31,8%) pacijentkinja sa patološkim nalazom PMN nije nađena CA,
dok je 35 pacijentkinja sa CA imalo normalan broj PMN. Dakle i ovde se 10,8% (57/526)
pacijentkinja može svrstati u Claeysovu grupu sa idiopatskom leukorejom. Dakle sigurno je i
da se ove dve grupe pacijentkinja (predominantna laktobacilarna flora i normalan ili patološki
broj PMN) međusobno razlikuju, i da je logično pitanje da li bi ovih 10,8% pacijentkinja treba
da posmatramo kao posebnu grupu, kao što su to predložili Claeys i sar. Dakle rezultati dobijeni
u ovom ispitivanju samo su potvrda da u svim dosadašnjim studijama, izuzev naravno Claeys i
sar., ova grupa pacijentkinja nije prepoznata. Ako se složimo da povećan broj PMN predstavlja
patološki nalaz koji ukazuje na prisustvo infekcije i/ili inflamacije, onda smo dužni da
pokušamo da nađemo uzrok ovakvog stanja, ako smo ga pre desetak godina nazvali
idiopatskim. Naravno, kao što smo već rekli, podrazumeva se da se kod svakog nalaza sa
patološkim brojem PMN isključi infekcija kandidom ili trihomonasom. Iako smo u našem
ispitivanju nalaz spora i hifa gljivica semikvantifikovali nismo uspeli da nađemo korelaciju koja
bi ukazivala da su pacijentkinje sa većim brojem spora ili hifa gljivica imale i veći broj PMN,
naprotiv nalazili smo preparate na kojima bi smo naišli svega nekoliko spora ili hifa gljivica a
kod kojih je broj PMN bio ogroman. Dobro je poznat stav da hife na neki način predstavljaju
infektivni oblik CA i da njihovo prisustvo ukazuje na infekciju, dok prisustvo spora ukazuje na
kolonizaciju CA. Mi u našem ispitivanju nismo mogli potvrditi takav stav bar kada je reč o
broju PMN (asimptomatske pacijentkinje kojima je zakazivan pregled, a nemamo precizne
kliničke podatke o simptomima pacijentkinja na dan pregleda), jer kao što je prikazano i na
Slici 3.15 nekad smo na čitavom preparatu nalazili ogroman broj PMN i svega nekoliko spora
142
ili hifa gljivica, tako da je pitanje da li ovako mali broj spora ili hifa može dovesti do ovako
velikog broja PMN ili je uzrok povećanog broja PMN nešto drugo. Za sada nismo mogli
zaključiti kakva je stvarna uloga nalaza spora ili hifa gljivica, kao ni njihovog broja na preparatu
po Gramu i potrebna su dalja ispitivanja koja bi preciznije korelirala klinički nalaz i simptome
pacijentkinja sa mikroskopskim nalazom. Ono u šta smo svakako sigurni s obzirom na razliku
detekciji CA na uvećanjima x200, x400 i x1000 jeste da. CA često ostaje nedijagnostikovana
(„skrivena“) ukoliko se ne pregleda velika površina preparata. Prethodni rezultati su pokazali
kako podela pacijentkinja na osnovu različitih dijagnostičkih kriterijuma može da utiče na
rezultate ispitivanja. Drugačijim metodološkim pristupom mikroskopskom pregledu preparata
po Gramu CA je nađena kod 239 (34,1%) pacijentkinja, što je više nego dvostruko u odnosu
na 99 pacijentkinja kod kojih smo detektovali CA na uvećanju x1000 u jednom gledanju
preparata. U budućim istraživanjima moralo bi da se vodi računa o standardizaciji metodoloških
procedura koje podrazumevaju način i mesto sa koga se uzima uzorak, njegov transport,
metodologiju mikroskopskog pregleda, i druga metodološka precizna uputstva radi bolje
uporedivosti budućih ispitivanja. Podatak, da se broj PMN u forniksu, sredini ili vestibulumu
vagine može značajno razlikovati, ili da se u projektu mikrobioma vagine uzorci uzimaju iz ova
tri dela vagine samo potvrđuje ovakav stav.
Slika 3.15: Na čitavom preparatu veliki broj PMN i samo spore koje se vide na slici, tako da je nejasno da
li ovako malo spora može biti uzrok tako velikom broju PMN
143
3.2.2 MORFOTIP KOKA
Naše zanimanje za koke posledica je odluke da pored Nugentovih dijagnostičkih
kriterijuma u ispitivanje uključimo i dijagnostičke kriterijume po Ison/Hayu i kriterijume po
Claeysu. Međutim, gledajući preparate na uvećanju x1000 ove bakterijske forme smo videli
kod veoma malog broja pacijentkinja. Tek kada smo sve preparate počeli da gledamo pod
imerzijom i na uvećanju x200 shvatili smo da su ove bakterijske forme češće prisutne na
mikroskopskom preparatu znatno češće. Svakako da je najvažniji razlog za veliku razliku u
broju pacijentkinja kod kojih smo detektovali koke činjenica da su koke na mikroskopskom
preparatu raspoređene po “regionima” tako da na jednom mikroskopskom preparatu imamo
polja koja pokazuju mikroskopsku sliku svih 6 grupa NP, dakle od onih NF do BVF, a u okviru
svakog od njih polja sa dosta koka. Dakle, u ovom ispitivanju nisu nađeni preparati na kojim
su koke pretežna bakterijska flora na čitavoj površini preparata uz smanjen ili odsutan broj
drugih bakterijskih formi, nego je mikroskopska slika sa nekom od 6 pozadina i regionima u
kojima predominiraju koke. Za grupu pacijentkinja koje imaju pretežno koke na preparatu po
Gramu komentar je sličan prethodnom koji se odnosio na pacijentkinje sa čistim nalazom u
podeli po Ison/Hayu. Dakle, iako su Ison/Hay poodavno ukazali na ovu grupu pacijentkinja kao
i uprkos činjenici da su ovu kategoriju “prihvatili” i Claeys i sar. u literaturi gotovo i da nema
podataka koji se na njih odnose. Nedavno je objavljena longitudinalna studija Santiaga i sar.
[411] koja se bavi promenama vaginalne flore kod 17 pacijentkinja u dva uzastopna
menstrualna ciklusa. U definisanju stanja i dinamičnosti promena vaginalne flore pacijentkinje
su svakodnevno same uzimale uzorak za bojenje preparata po Gramu, uzorci su kultivisani
jedanput nedeljno, a od molekularnih metoda korišćen je DNK-PCR i 16 S rRNK sekvenciranje
[411]. Pregled preparata po Gramu rađen je na osnovu kriterijuma po Claeysu i sar., s tim što u
ovoj podeli nije bilo pacijentkinja iz originalnih grupa Gradus 0 (“čist nalaz” u ovom ispitivanju
i pacijentkinja iz originalne Grupe I-PMN (“leukoreja” u ovom ispitivanju), a verovatno zbog
malog broja pacijentkinja uključenih u ispitivanje.
144
Grafikon 3.28: NP - 6 grupa u odnosu na Bifido, Lepto i Koke
Tako su u ovom ispitivanju (kultura i PCR u odnosu na nalaz preparat po Gramu) kod 40%
pacijentkinja sa normalnim nalazom (Ia, Ib, Iab) detektovane različite koke, dok su ti procenti
bili 60%, 42%, 61% i 82% kod pacijentkinja koje su na osnovu preparata po Gramu definisane
kao gradus I-like (slične normalnom), gradus II (intermedijaran), gradus III (BV) i gradus IV
(koke).
Grafikon 3.29: Raspodela KOKA, BIFIDO i LEPTO formi kod pacijentkinja sa normalnim i patološkim
brojem PMN
145
Ako pogledamo rezultate koje smo dobili u ovom ispitivanju na osnovu pregleda
preparata po Gramu i NP-6G (bez kulture i PCR), vidimo da su kod pacijentkinja sa normalnim
nalazom (NF+NM+NN) koke mikroskopski nađene kod 23 % (Santiago i sar. [411] 40%)
pacijentkinja, dok je u grupi sa BV taj procenat veći i iznosi oko 77% (Santiago i sar. [411]
60%). Dakle, podaci koji su dobijeni u ovom ispitivanju kod 732 pacijentkinje u saglasnosti su
sa rezultatima studije koja je uključivala 17 pacijentkinja, u kojoj autori ukazuju na ogromne
individualne razlike u sastavu vaginalne mikroflore. Savremeni molekularni metodi su nam
omogućili da bolje upoznamo nove “članove” vaginalnog ekosistema i njihovu promenljivost
u vremenu, a s druge strane su nam ta saznanja zapravo otežala pokušaje da razgraničimo
”normalno” od “patološkog”, ili bar definišemo šta je to što bi u ogromnoj individualnoj
raznolikosti moglo da bude zajedničko. Santiaga i sar. [411] u zaključuju da je značaj Gram
pozitivnih koka u vaginalnoj mikroflori potcenjen. Navedeni rezultati su pokazali da su
pacijentkinje sa patološkim nalazom vaginalne flore imale u značajno većoj meri prisutne
KOKE u odnosu na pacijentkinje sa normalnom vaginalnom florom. Ako opet pogledamo
grafikon videćemo da je najveća razlika između grupa NF 47/301 (15,6%) i BVF 57/66 (86%),
i NM (26,1%) i BVM (74,6%) što je i shvatljivo, s obzirom na našu prethodnu diskusiju o ovim
grupama pacijentkinja. Interesantno je da je od ovih 47 pacijentkinja samo kod 5 nismo
detektovali CA i povećan broj PMN. Potvrda da je granica između pacijentkinja sa nalazom
NN i BVN nejasna je što smo kod pacijentkinja sa nalazom BVN (69,4%) NN (48,6%) dobili
slične rezultate. S obzirom da se koke nalaze u većem procentu kod pacijentkinja sa patološkim
nalazom, njih uopšteno posmatramo kao patološki nalaz. NP-6G odlično razlikuje pacijentkinje
sa normalnim ili patološkim nalazom. Ovo bi bio još jedan razlog da intermedijarnu grupu koju,
da podsetimo, imaju i Ison/Hay i Claeys, uklonimo iz budućih ispitivanja, jer nam NP-6G
omogućava da se ta grupa razdvoji na dve, sa normalnim (NN) i patološkim nalazom (BVN).
Ovi podaci, kao i veliki broj podataka u kojima procenti patološke vaginalne flore
prelaze i 50%, pre ukazuju na nesavršenost naših dijagnostičkih postupaka. Dakle, potpuno je
jasno da smo postavili neke “zlatne standarde” na osnovu kojih određujemo šta je zdravo, a šta
patološko, ali je očigledno da je to različito od onoga što priroda na osnovu svojih “zlatnih
standarda” definiše kao normalno ili patološko. Rezultati ove i drugih molekularnobioloških
studija koje su objavljene u poslednjih desetak godina, i koje su nam pokazale koliko je
vaginalna flora različitija i dinamičnija od onoga što smo pretpostavljali pre dvadesetak godina,
još je jedna potvrda naših ograničenih mogućnosti da shvatimo njene zakonitosti. Uvažavajući
najnovije rezultate iz projekta humanog mikrobioma koji se odnose na značaj mikrobne
zajednice po zdravlje pojedinca, ne možemo više da se ne zapitamo da li ćemo lečenjem
146
(antibiotici) nečega što mislimo da je patološka vaginalna flora dovesti do takvih poremećaja u
mikrobnoj zajednici koji mogu imati veću štetu po zdravlje pacijenta. Pacijentkinje bez
simptoma i sa graničnim kliničkim i mikroskopskim nalazom je verovatno bolje naručiti na
kontrolni pregled nego započeti lečenje ili se odlučiti za terapiju prebioticima, kako to i radimo
u svakodnevnoj praksi. Kod oko 23% pacijentkinja sa normalnim nalazom (NF+NM+NN)
mikroskopskim pregledom pod imerzijom na uvećanju x200 detektovali smo koke.
Dakle, ove pacijentkinje su imale normalan nalaz u pogledu odnosa ŠF i NŠF. Međutim,
Grafikon 3.30: Učestalost morfotipa koka po različitim grupama
gotovo sve ove trudnice sa kokama imale su neki od drugih (uslovno) patoloških, odnosno
ometajućih, činilaca: CA, patološki broj PMN, BIFIDO ili LEPTO forme. Pri tome (kao što su
to uradili Santiaga i sar. [362] mikroskopski nalaz I-like (u ovom radu grupa BIFIDO)
smatramo patološkim. Što se tiče nalaza sa LEPTO formama, s obzirom na njihove osobene
fenotipske karakteristike i činjenicu da su detektovane samo kod 6% (42/704) pacijentkinja,
smatramo dovoljnim da ih uvrstimo u grupu sa patološkim nalazom. U grafikonima je prikazana
učestalost nalaza koka na preparatu po Gramu i pregledom na uvećanju x200 sa imerzijom kod
pacijentkinja sa različitim patološkim mikroskopskim nalazom.
Najveća učestalost nađena je kod pacijentkinja sa BV, zatim slede BIFIDO, CA,
PMN2+PMN3 i LEPTO  78%, 64%, 61%, 56% i 55%. Od 258 pacijentkinja kod kojih su
nađene KOKE samo njih 34 nisu imale BV ili CA, odnosno BV+CA, što znači da je 87%
147
pacijentkinja kod kojih smo mikroskopski detektovali KOKE imalo i mikroskopski nalaz na
kome su detektovane spore ili hife gljivica i/ili veći broj BVAB u odnosu na laktobacile. Kod
preostale 34 pacijentkinje, kod 25 smo našli prisustvo BIFIDO i/ili LEPTO formi, odnosno
samo 9 pacijentkinja kod kojih smo detektovali KOKE imale su normalan nalaz. Ako kao
patološki nalaz uvažimo i povećan broj PMN, onda od 258 pacijentkinja sa KOKAMA samo 3
(1%) imaju “potpuno” normalan nalaz, odnosno predominaciju laktobacila bez CA, patološkog
broja PMN, BIFIDO ili LEPTO formi, odnosno neku od različitih kombinacija, za koje je teško
reći kada su koinfekcija a kada mešovita infekcija. Od njih tri, dve su bile iz grupe NN, a jedna
iz grupe NF. Dakle ako bi koke posmatrali kao treći ometajući činilac one ne bi značajnije
uticale na odnos “zdrave”-“bolesne” jer je 99% pacijentkinja imalo jedan ili više patoloških
nalaza (BV,CA, BIFIDO, LEPTO, PMN2, 3). Sa druge strane sve ove pacijentkinje bi mogli
razvrstati u grupe sa koinfekcijom ili mešovitom infekcijom. Takođe, njihova visoka učestalost
kod pacijentkinja sa poremećenom vaginalnom florom jasno ukazuju da bi KOKE mogle biti
odličan marker (obeleživač) “nekog” poremećaja vaginalne flore (Grafikon 3.30). Na osnovu
ovih rezultata mogli bismo zaključiti da ukoliko mikroskopskim pregledom preparata po Gramu
na uvećanju x200 sa imerzijom i po metodologiji predstavljenom u ovom radu, vidimo KOKE,
onda sa 99% verovatnoće možemo pretpostaviti da ta pacijentkinja ima i neki od patoloških
mikroskopskih nalaza (BV, CA, patološki broj PMN, LEPTO, BIFIDO).
Tako Santiago i sar. [411] u svojoj studiji ukazuju da su, uprkos prisustvu laktobacila,
neke sojeve koka (Streptococcus anginosus group, Peptostreptococcus anaerobius i P.
asaccharolyticus) izolovali kulturom u 20-40% slučajeva u svim grupama pacijentkinja,
pozivajući se pri tome na radove Bartlett i sar. [626] i Johnson i sar. [612] koji su takođe
pokazali da su koke značajan član vaginalne mikroflore. Takođe naglašavaju činjenicu da je,
izuzev hemolitičkog streptokoka grupe B, značaj ostalih koka potcenjen. Zaključuju da je
prisustvo Gram pozitivnih koka karakteristično za gotovo sve grupe sa poremećajima vaginalne
flore i to objašnjavaju ili apsolutnim porastom u broju, količini koka (engl. loads), a kao drugu
mogućnost navode činjenicu da, zbog smanjenog broja laktobacila kod poremećene vaginalne
flore, koke postaju lakše vidljive. Mi takođe zaključujemo da se koke u većem procentu nalaze
kod pacijentkinja sa poremećenom vaginalnom florom, ali da su prisutne i kod oko 20-30%
pacijentkinja sa predominacijom laktobacila.
Veliki broj studija koje su u detekciji G. vaginalis koristili molekularnobiološke metode,
pokazao je da ovaj mikroorganizam može da se nađe kod 50%-90% pacijentkinja sa normalnim
mikroskopskim nalazom i da zajedno sa L. iners predstavlja najčešći mikroorganizam u
vaginalnom mikrobiomu. Dakle, ako smo mikroskopskim pregledom postavili dijagnozu BV
148
kod 173 pacijentkinje (dakle, na mikroskopskom preparatu videli mikroorganizme koji
odgovaraju G. vaginalis), a kulturom izolovali G. vaginalis kod svega 5 pacijentkinja, onda je
to drastičan primer onoga što ekolozi zovu great plate count anomaly. Primer sa G. vaginalis
se odnosi na mikroorganizam čije su fenotipske karakteristike dobro definisane, a možemo da
se zapitamo šta je sa ostalih 95% bakterija za koje su nam fenotipske karakteristike potpuno
nepoznate. Dakle, uzimajući u obzir rezultate ovog ispitivanja i činjenicu da je u citiranoj studiji
[362] preparat po Gramu gledan na uvećanju x1000 (nije naveden broj vidnih polja, ali je
verovatno veći od uobičajenih 5-10 VP, verujemo da bi primenom metodologije pregleda na
uvećanju x200 broj pacijentkinja kod kojih su detektovane koke mikroskopskim pregledom bio
veći od onih koji su izolovani kulturom. Naravno, ne mislimo da su sve pacijentkinje kod kojih
smo mikroskopski detektovali koke bile i bolesne, jer se među njima nalaze i one (n=60) kod
kojih smo detektovali retke spore i hife gljivica (CA NULL), kao i 35 pacijentkinja sa malim
brojem bakterijskih formi (BVN+NN, a bez CA), kao i da pacijentkinje sa nalazom KOKA u
ovom ispitivanju nismo podelili u grupe na osnovu semikvantitativnog nalaza koka na
mikroskopskom preparatu. Smatramo da bi sve “značajnije” mikroskopski vidljive, a nama
poznate mikroorganizme trebalo na neki način kvantifikovati jer bi to trebalo da bude
odlučujuće u odluci da li ćemo neki nalaz smatrati kolonizacijom ili patološkim. Prethodno
navedeni primer sa G. vaginalis je i najbolji primer jer ćemo ovaj mikroorganizam detektovati
kod najvećeg broja pacijentkinja ukoliko koristimo adekvatne podloge za kulturu ili prajmere
koje mogu identifikovati različite sojeve G. vaginalis, ali samo na osnovu kvantifikacije (QPCR) mogli bismo u budućnosti utvrditi neku graničnu koncentraciju za razlikovanje
normalnog od patološkog i doći do formule za molekularnu dijagnozu BV.
Ono što je u ovom trenutku svakako jasno jeste da nijedan nalaz pojedinačno (klinički,
mikroskopski, mikrobiološki, molekularnobiološki) ne može kod značajnog broja pacijenata
povući jasnu granicu između fiziološkog i patološkog, a tako ni odgovoriti na pitanje da li i
kako lečiti ove pacijente. Naši i rezultati Santiago i sar. [411] svakako ukazuju za potrebu za
daljim ispitivanjima koja bi preciznije definisala značaj i uticaj koka na sve pomenute aspekte.
Tako pitanje na koje treba dati odgovor jeste da li i kako KOKE utiču na kliničku sliku, odnosno
u kojim se slučajevima radi o koinfekciji, u kojim o mešovitoj infekciji, a u kojim slučajevima
KOKE mogu biti osnovni uzrok infekcije (deskvamativni inflamatorni vaginitis). Da li koke
imaju uticaja na vrednosti pH ili probu sa 10% KOH? Da li pacijentkinje sa infekcijom CA i
velikim brojem koka (ili sve druge moguće kombinacije BV / CA / PMN / BIFIDO / LEPTO /
drugi članovi vaginalnog mikrobima) imaju istu simptomatologiju i kliničku sliku kao
pacijentkinje sa CA, a bez koka? Dalje, da li koke povećavaju rizik za nastanak drugih
149
patoloških stanja (PP, PROM, HIV...), i da li pacijentkinja sa CA+KOKE zahtevaju drugačiji
terapijski pristup? Koliko njihovo prisustvo utiče na sastav mikrobiološke zajednice vagine,
odnosno da li su i u kojem broju komensali, a kada mogu da postanu patogeni? Da li njihovo
prisustvo isključuje kolonizaciju nekim drugim članovima vaginalnog mikrobioma, a nekim
olakšava? S obzirom da su koke u našem ispitivanju detektovane mikroskopskim pregledom
kod trećine pacijentkinja bilo bi važno utvrditi da li nalaz koka na mikroskopskom pregledu
srazmeran njihovom broju i kliničkim značajem. Naime, verovatno je da najveći broj koka
predstavlja stalne stanovnike vaginalnog mikrobioma koji se nalaze u malom broju i nemaju
klinički značaj. Primenom q-PCR mogli bi da odgovorimo na pitanje da li sam mikroskopski
nalaz KOKA na neki način ukazuje na njihov patološki broj, slično onome što važi za CA.
Sigurno je da njihovo prisustvo i koncentracije (load) mogu da utiču na koncentracije citokina,
stepen apoptoze ili broj PMN, a da njihovo prisustvo na mikroskopskom preparatu sa velikom
verovatnoćom ukazuje na “neki” poremećaj vaginalne flore.
3.2.3 MORFOTIP LEPTO
Kao što smo napomenuli u metodologiji ovog ispitivanja pod LEPTO formama ne
podrazumevamo prisustvo nekog pojedinačnog mikroorganizma nego da se pod ovim
podrazumevaju mikroorganizmi sličnih fenotipskih karakteristika kao što su Leptotrichia
amnionii, Leptorhrix, Sneathia sanguinegens, Actinomyces i možda još neke druge bakterije
iz roda Fusobacterium ili Bacteroides. Tevisan je uspostavio rod Leptotrichia još 1879 da bi
razlučio filamentne mikroorganizme u usnoj duplji od slobodnoživećih vrsta Leptothrixa.
Glavni krajnji metabolički produkt Leptotrichia je mlečna kiselina [412] i to ga razdvaja od
drugih filamentoznih bacteria kao što su Fusobacterium i Bacteroides Harwich i sar. [413] u
svojoj studiji su iz vagine izolovali bakteriju koja filogenetski i fenotipski odgovara rodu
Snethia, i predlažu umesto naziva L. amnii naziv Sneathia amnii [414]. U svojoj studiji oni su
pokazali da je Sneathia značajan oportunistički patogen koji može imati značajnu ulogu u
reproduktivnom zdravlju žene, i u njihovom ispitivanju Sneathia species je nađena kod 43.3%
(319 of 736) uzoraka, i pokazano da je ova vrsta veoma čest član mikrobioma vagine, a u nekim
uzorcima predstavlja predominantnu bakterijsku vrstu. Najčešće je izolovana S.amnii (ranije
L.amnii) u oko 77% uzoraka. U zaključku ove studije Harwich i sar. ukazuju da je Sneathia
jedan od najčešće detektovanih mikroorganizama u amnionskoj tečnosti pacijentkinja sa PP,
ukazujući na značaj ovog mikroorganizma u obstetričkoj populaciji. Činjenica da su oni u svojoj
studiji detektovali Sneathia species kod preko 40% uzoraka iz srednje trećine vagine samo
150
potvrđuje mogući značaj ovog mikroorganizma u različitim ginekološkim i obstetričkim
stanjima. Izbirljivi uslovi sredine koje zahteva Sneathia čine kultivaciju ovog mikroorganizma
veoma teškom i nesigurnom, zbog čega se veoma malo zna o biologiji ili patogenom potencijalu
ovih mikroorganizama. Nove molekularno biološke metode zajedno sa kulturom, a ovo
ispitivanje ukazuje na potrebu da i mikroskopski pregled bude deo uporednih studija, trebalo bi
u budućnosti da daju preciznije odgovore na značaj ovog mikroorganizma u ginekologiji i
obstetriciji.
Na Grafikonu 3.28 je prikazana raspodela LEPTO formi po grupama na osnovu NP-6G.
Ovo je još jedan primer koji govori u prilog podele NP-6G jer bi smo na osnovu, na primer
Amselovih kriterijuma dobili podatak da se 32 pacijentkinje nalaze u grupi sa normalnim
nalazom, a 10 u grupi sa BV. Na osnovu podele po Nugentu 26 pacijentkinja bi imalo normalan
nalaz i LEPTO, 12 bi imalo intermedijaran, a 4 BV.
Ukoliko bi koristili podelu po Ison/Hayu onda bi tri pacijentkinje bili u grupi čist nalaz (Gradus
0), a 8 pacijentkinja u grupi KOKE (Gradus IV), dok bi u podeli po Claeysu 5 pacijentkinja bilo
u grupi I-PMN (leukoreja). Ovo je još jedan u nizu primera koji jasno ukazuje kako NP-6G
omogućava potpuno drugačije sagledavanje” istih” podataka. Dakle, samo na osnovu ovakve
podele mi vidimo da su LEPTO forme u najvećem procentu prisutne kod pacijentkinja iz grupe
NULL, odnosno da predominiraju LEPTO forme dok je broj drugih bakterijskih formi veoma
mali (Slike 3.16 i 3.17; 2.33-2.36). Ovakve slike mogla bi objasniti gore navedeni podatak iz
studije Harwich i sar. da Snaethia u nekim uzorcima predstavlja predominantnu bakterijsku
vrstu. Molekularno biološke studije našle su značajnu udruženost ovog mikroorganizma sa BV.
Na obe fotografije pored lepto formi drugih bakterijskih morfotipova gotovo i da nema, tako da
možemo reći da je i ovaj preparat hipocelularan. Ovo je još jedan primer koji ponovno ukazuje
da NP-6G za razliku od Nugentove ili drugih podela omogućava da izdvojimo posebnu grupu
pacijentkinja koja se karakteriše nedostatkom i laktobacila i BVAB (NULL) i upozorava ili
bolje rečeno postavlja ponovno isto pitanje : “Da li ovu grupa pacijentkinja u budućim
ispitivanjima treba da posmatramo kao posebnu grupu?” Kao što smo već pomenuli osnovna
karakteristika ove grupe bila bi značajno smanjen i diverzitet i kvantitet mikrobiološke
zajednice vagine, ili ono što gastroenterolozi nazivaju disbiozama čija je glavna karakteristika
gubitak diverziteta mikrobiološke zajednice. Ukoliko bi smo odlučili da ovu grupu definišemo
kao posebnu što mislimo da je ispravno onda bi stvari izgledale mnogo drugačije.
Naime, prethodno navedeni podaci koji govore da su molekularnobiološke studije omogućile
detekciju nekoliko novih bakterijskih vrsta iz reda Clostridia i za koje su pokazale da su visoko
specifični indikatori za BV, kao i da se vrste kao što su Megasphaera, Leptotrichia, Atopobium
151
i Dialister veoma često nalaze kod pacijentkinja sa BV, treba posmatrati kroz prizmu veoma
važne činjenice a to je da su u većini ovih studija Nugentovi kriterijumi i/ili Amselovi
kriterijumi zlatni standard u dijagnozi BV. Drugi bitan momenat koji želimo naglasiti jeste na
neki način “opsednutost” BV, odnosno činjenica da se trenutno svi dijagnostički kriterijumi
svode na pitanje da li pacijentkinja ima ili nema BV, i tu je početak i kraj svih poremećaja
vaginalne flore. Ni NP-6G nije se oslobodila te “opsednutosti” jer se i ovde sve pacijentkinje
suštinski svrstavaju na one sa BV i normalnim nalazom. Dakle pitanje, na koje treba da daju
odgovor buduća ispitivanja, a na koje ova studija permanentno ukazuje glasilo bi : “ Da li
pacijentkinje iz grupe NN i BVN treba svrstati u novu grupu poremećaja vaginalne flore?” U
konkretnom slučaju ta grupa pacijentkinja izgubila bi iz naziva odrednicu BV i mogli bi smo je
nazvati disbiozom sa smanjenim diverzitetom, grupom sa čistim nalazom kao što su to učinili
Ison/Hay, grupom “null” ili “empty” ili nekim drugim nazivom koji ukazuje na njenu osnovnu
karakteristiku smanjenje u diverzitetu (kvalitativno) i kvantitetu mikrobioma vagine. Ovo bi
imalo smisla jer u definiciji BV kao najvažniji elementi navode se smanjenje ili potpuni gubitak
laktobacila, a kao drugi važan momenat navodi se enorman porast u broju (1000 puta) anaeroba,
a najnovije molekularnobiološke studije ukazuju a porast u diverzitetu mikrobiološke zajednice.
Dakle suštinski bi mogli reći da se radi o dva potpuno suprotna poremećaja vaginalne flore,
jednog u kome dolazi do enormnog porasta u kvantitetu i diverzitetu mikrobiološka zajednice,
i drugog u kome dolazi do enormnog smanjenja u diverzitetu i kvantitetu mikrobiološke
zajednice, a mi i jedan i drugi definišemo kao BV. Kao što smo rekli NP-6G, suštinski, kao svoj
integralni deo podrazumeva i broj PMN i prisustvo drugih mikroorganizama koji se detektuju
mikroskopskim pregledom (CA, KOKE, BIFIDO,LEPTO, T. vaginalis). Ovakav pristup može
na neki način odraziti kompleksnost vaginalne flore, odnosno što je još važnije omogućiti da se
proceni klinički značaj pojedinih mikrobiloških zajednica u zdravlju ili bolesti. Tako, ako
pridružimo ove elemente onda ćemo videti da je 20 pacijentkinja imalo CA, 24 KOKE, 8
BIFIDO forme, 20 patološki broj PMN, odnosno da je kod svih pacijentkinja bar jedan od ovih
nalaza bio patološki kako je to prikazano u Tabeli 3.4.
152
Slika 3.16: Lepto forme i hipocelularan nalaz (NULL) i PMN2
Slika 3.17: Lepto forme, hipocelularan nalaz i PMN2
153
Tabela 3.4: Mikroskopski nalaz kod 42 pacijentkinje kod kojih su detektovane LEPTO forme a koji
pokazuje i prisustvo drugih mikroskopskih nalaza relevantnih za procenu stanja vaginalne flore
R.B.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
NP-6G
BVF
BVM
BVM
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
BVN
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NM
NM
NM
NM
NM
NM
NM
NM
NN
NN
NN
NN
NN
NN
NN
NN
NN
NN
NN
CANDIDA
CA MID
BIFIDO
*
CA NULL
CA MID
CA NULL
CA MID
CA NULL
CA MID
CA NULL
CA NULL
CA FULL
CA MID
CA NULL
BIFIDO
BIFIDO
CA NULL
CA MID
CA NULL
CA NULL
BIFIDO
BIFIDO
CA NULL
CA NULL
CA NULL
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
CA MID
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
BROJ PMN X200
PMN3
NOR
PMN3
PMN3
PMN2
PMN2
NOR
PMN2
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
PMN3
PMN2
NOR
NOR
PMN3
PMN2
NOR
PMN2
PMN2
NOR
NOR
NOR
NOR
PMN2
PMN3
PMN2
PMN2
NOR
NOR
PMN2
NOR
NOR
NOR
PMN2
NOR
NOR
PMN3
PMN2
pH
4,4
4,4
5,5
x
x
5,5
x
5
5,5
5
4,7
4,4
5
4,7
5,5
5,5
5
6
5
7
6
5
5,5
6
4,7
4
6
4,7
4,4
x
5,5
5
4,4
5,5
5
x
4
6.0
4
6
4
x
KOH
neg
neg
neg
x§
x
poz
x
poz
neg
neg
poz
neg
neg
poz
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
poz
neg
neg
neg
poz
poz
x
neg
poz
x
neg
neg
x
poz
neg
neg
poz
neg
x
*prazna polja znače da nisu detektovane bakterijske forme; §= znači da je nalaz nepoznat
Ako opet pogledamo Tabelu 3.4 videćemo da u njoj imamo 40!!! različitih mikroskopskih
nalaza. Srednja vrednost pH je bila 5,0, od čega je su najveće srednje vrednosti nađene u grupi
NF (pH=5,6), a najmanje u grupi BVF+BVM (pH=4,7, 3 pacijentkinje), dok je u ostalim
grupama vrednost pH bila oko 5. Ili, pacijentkinje sa BV imale su srednju vrednost pH 4,9, a
one sa normalnim nalazom 5,1!? Rezultati testa sa KOH (n=35) od 11 pacijentkinja koje su
svrstane u grupu BV 7 je imalo negativan test sa 10%KOH, a 4 pozitivan, a od 24 pacijentkinje
sa normalnim nalazom kod 18 je ovaj test bio negativan, a kod 6 pozitivan. Ukoliko bi sad kako
se to najčešće radi procenjivali specifičnost i senzitivnost ova dva testa u dijagnozi BV, rezultati
koje bi dobili bili bi katastrofalni, posebno za pH. Međutim ukoliko pažljivo analiziramo ovu
grupu pacijentkinja i podatke iz tabele, i dozvolimo sebi da posumnjamo u dogmu da je
mikroskopski nalaz superioran u odnosu na vrednosti pH u proceni stanja vaginalne flore onda
bi tumačenje rezultata moglo izgledati bitno drugačije.
154
3.2.4 MORFOTIP BIFIDO
U radovim belgijske grupe istraživača koji su predstavili takozvanu Claeysovu podelu
mikroskopskog pregleda vaginalnog sekreta jedan od najintrigantnijih nalaza bila je nova grupa
koji su autori nazvali I-like, a koju smo u ovom ispitivanju nazvali grupom sa BIFIDO formama
[216]. Već iz samog naziva I-like (sličan normalnom) jasno je da je ovu grupu mikroskopski
najteže razlikovati od pacijentkinja sa predominacijom laktobacilarnih formi, kako smo to
detaljno objasnili u Metodologiji.
Ako pogledamo raspodelu pacijentkinja sa BIFIDO formama po grupama na osnovu NP-6G
(Grafikon 3.28, Tabela 17, Prilog 1) vidimo da je najveća zastupljenost bila u grupama sa
normalnim nalazom 43 pacijentkinja, dok je 7 bilo u grupi sa BV. Kod pacijentkinja sa BVF
nismo identifikovali ni jedan nalaz sa BIFIDO formama.
Najveći broj pacijentkinja kod kojih smo mikroskopskim nalazom detektovali BIFIDO forme
pripadao je grupama NORMAL (86%) i BVN (10,2%). Kod pacijentkinja sa BVF nismo
identifikovali ni jedan nalaz sa BIFIDO, a od 301 pacijentkinje sa nalazom NF BIFIDO forme
su nađene kod 12 pacijentkinja (4,0%). Da smo u ovom radu koristili samo Amselove
kriterijume imali bi dve grupe pacijentkinja zaključili bi da se BIFIDO forme u značajno većem
procentu nalaze u grupi pacijentkinja sa normalnim nalazom, što bi nas moglo navesti da
zaključimo da oni pripadaju normalnoj bakterijskoj flori. Od 50 Pacijentkinja sa BIFIDO
formama 27 je imalo patološki broj PMN. I u radovima autora koji su uveli ovu grupu imamo
malo podataka o drugim parametrima kao što su vrednost pH, pozitivan ili negativan test sa
10% KOH, broj PMN, prisustvo CA ili KOKA. Naredna dve tabela (3.29 i 3.30) ukazuju koliko
je značajno da pored mikroskopskog nalaza koji pacijentkinje razvrstava samo u odnosu na broj
laktobacila i BVAB u dve ili tri kategorije, imamo i druge parametre (CA, PMN,
LEPTO,KOKE, BIFIDO, KOH test, pH) pre svega da bi postavili precizniju dijagnozu i
sproveli eventualnu terapiju. pored toga ove dve tabele “slikovito” pokazuju koliko bi se
razlikovali rezultati ispitivanja u zavisnosti od metodologije ispitivanja, preciznije u zavisnosti
od dijagnostičkih kriterijuma.
155
Ako kao pH cutoff uzmemo vrednosti manje od 4,5 od 43 za koje smo imali nalaz pH (prikazane
u tabeli) 17 pacijentkinja je imalo patološki nalaz, a 26 normalan. Srednja vrednost pH kod
pacijentkinja sa BIFIDO formama iznosila je 4,6 (U poglavlju “Deskriptivne statistika” u
tabelama su vrednosti srednjih koncentracija, SD, minimalnih maksimalnih vrednosti tako da
neće biti navođene u daljem tekstu).Kao što je rečeno u prethodnoj diskusiji, dijagnostika i
lečenje trudnica u ovom ispitivanju bili su zasnovani na dijagnostičkim kriterijumima po
Amselu. Uprkos činjenici da nismo smatrali prisustvo CC neophodnim u dijagnozi BV i da su
mikroskopski kriterijumu predstavljali najvažniji faktor u razlikovanju normalnog od
patološkog, kod 36/43 (83,7%) pacijentkinja ustanovljen je normalni nalaz. Kod preostalih 7
pacijentkinja dijagnostikovana je BV, a CA na mikroskopskom pregledu detektovana je kod 9
pacijentkinja.
Suština Tabele 3.5 je da se ukaže na razlike u dijagnozi na osnovu različitih
dijagnostičkih kriterijuma. Pored velikih razlika u detekciji CA, treba uočiti da većina
pacijentkinje kod kojih je dijagnoza postavljena na osnovu pregleda preparata po Gramu (NP6G) pripadaju grupama sa hipocelularnim nalazom. Izdvojićemo nalaz pacijentkinje kod koje
smo na preparatu po Gramu postavili dijagnozu NF, koja je imala CA, pozitivan KOH test i
pH, a kod koje je na osnovu Amselovih kriterijuma postavljena dijagnoza BV (u Tabeli redni
broj 39).
U Tabeli 3.6 su prikazani rezultati mikroskopskog pregleda preparata po Gramu na
osnovu različitih dijagnostičkih kriterijuma. Nećemo detaljnije komentarisati ove rezultate, ali
ukazaćemo na neke najvažnije. Tako je na preparatu po Gramu kod 54% (27/50) pacijentkinja
mikroskopski je detektovana CA, dok je taj procenat iznosio 19% (9/47) na NPVS sa 10%
KOH. Od ovih 27 trudnica, 17 je sa mikroskopskim nalazom CA NULL, 6 CA MID i 4 CA
FULL. Koke su mikroskopski detektovane kod 64% (BVM/50), a LEPTO forme kod 16%
(8/50) pacijentkinja, ni u jednom slučaju prilikom pregleda NPVS.
156
Tabela 3.5: Pojedinačni nalazi pacijentkinja sa BIFIDO formama odnosu na različite dijagnostičke
kriterijume, vrednosti kliničkih testova i broj PMN (x400)
R.B.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
AMSEL
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
AMSEL CA
NOR
NOR
CA
NOR
CA
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
CA
BV
NOR
NOR
NOR
CA
CA
NOR
NOR
CA
CA
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
CA
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
CA
NOR
NOR
NOR
NOR
KOH TEST
NEG
NEG
NEG
NEG
POZ
POZ
NEG
POZ
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POZ
NEG
NEG
NEG
POZ
POZ
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POZ
NEG
POZ
NEG
NEG
pH
4,4
4
4
4
5,5
4,7
4
4,4
4
4,7
5
4,7
4.0
5,3
5
4
4,4
4
4,4
5
6
5
4,4
4,4
4
4
4
4
4
6
6
6
4,4
5,5
4
4,7
6.0
4,4
6
4
4,4
4
4,4
NP-6G
NM
NM
NM
NF
BVN
NN
NN
NM
NN
NF
NM
NN
NM
NN
BVN
NF
NF
NM
NF
NF
NM
NN
NM
NM
NM
NM
NM
NM
NM
BVN
BVN
BVM
NN
NN
NM
BVM
NN
NF
NF
NN
NF
NM
NF
CA
NOR
CA NULL
CA MID
NOR
CA FULL
NOR
CA NULL
NOR
NOR
CA NULL
NOR
NOR
NOR
CA FULL
3
NOR
CA NULL
CA NULL
CA FULL
CA MID
CA NULL
NOR
CA MID
CA MID
CA NULL
CA NULL
CA NULL
CA NULL
CA NULL
CA NULL
3
CA NULL
NOR
NOR
NOR
3
NOR
CA NULL
CA MID
NOR
CA NULL
NOR
NOR
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BIFIDO
BROJ PMN X400
PMN1
PMN2
PMN2
PMN1
PMN0
PMN0
PMN1
PMN0
PMN0
PMN1
PMN1
PMN0
PMN3
PMN3
PMN0
PMN0
PMN1
PMN2
PMN2
PMN1
PMN0
PMN0
PMN1
PMN3
PMN0
PMN1
PMN1
PMN2
PMN1
PMN0
PMN2
PMN0
PMN0
PMN0
PMN3
PMN0
PMN1
PMN2
PMN2
PMN2
PMN2
PMN1
PMN1
Najvažnije zaključak koji vidimo kad pogledamo ove dve tabele je da se BIFIDO forme
na NPVS prepoznaju kao laktobacilarna flora i nalaz tumači kao normalan. Ovo je jedan od
razloga zbog koga su rezultati za specifičnost i senzitivnost pH u dijagnozi BV u nekim
ispitivanjima veoma loši. Dakle, tako se u značajnoj meri smanjuje upotrebna vrednost
dijagnostički potencijal ovoga jednostavnog, jeftinog i brzog testa. S druge strane, naši
rezultati, iako na malom broju trudnica, ukazuju da kod pacijentkinja sa vrednostima pH preko
4,5, a koje imaju negativnu mikroskopsku sliku (predominantna “laktobacilarna” flora) i
negativan KOH test ne bi trebalo bez razmišljanja postavljati dijagnozu normalnog nalaza, a
pH proglašavati ne senzitivnim i ne specifičnim, nego bi morali razmisliti i o ovakvim
mogućnostima, odnosno da pH test može ukazati na poremećaje vaginalne flore koje mi
mikroskopski ne možemo detektovati.
157
Tabela 3.6 rezultati mikroskopskog pregleda preparata po Gramu na osnovu različitih dijagnostičkih
kriterijuma.
NUGENT
INT
INT
NOR
NOR
INT
INT
INT
NOR
NOR
BV
BV
NOR
INT
BV
INT
NOR
NOR
INT
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
INT
BV
BV
NOR
INT
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
Claeys
INT
LEUK
NOR
LEUK
LEUK
INT
NOR
NOR
NOR
BV
BV
LEUK
LEUK
BV
INT
NOR
NOR
BV
LEUK
NOR
NOR
LEUK
KOKE
LEUK
LEUK
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
KOKE
LEUK
BV
BV
NOR
INT
NOR
LEUK
LEUK
LEUK
LEUK
NOR
LEUK
NOR
NOR
NOR
NP-6G
NM
NM
NM
NF
BVN
NN
NN
NN
NM
NN
NM
NF
NM
NN
BVN
NM
NN
BVN
NF
NN
NM
NF
NM
NF
NF
NM
NN
NM
NM
NF
NM
NM
NM
NM
NM
BVN
BVN
BVM
NF
NN
NN
NM
BVM
NN
NF
NF
NN
NF
NM
NF
CANDIDA
NOR
CAN
CAM
NOR
CAF
NOR
CAN
NOR
NOR
NOR
NOR
CAN
NOR
NOR
CAF
NOR
CAF
BV
NOR
CAN
CAM
CAN
CAN
CAF
CAM
CAN
NOR
CAM
CAM
CAN
CAN
CAN
CAN
CAN
CAN
CAN
BV
CAN
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
NOR
CAN
CAM
NOR
CAN
NOR
NOR
BIFIDO
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
BIF
LEPTO
NM
NM
NM
NF
BVN
NN
NN
NN
NM
NN
NM
NF
NM
NN
BVN
NM
NN
BVN
NF
NN
NM
NF
NM
LEPTO
LEPTO
LEPTO
LEPTO
NM
NM
NF
NM
NM
NM
NM
NM
BVN
BVN
BVM
NF
LEPTO
LEPTO
NM
BVM
LEPTO
NF
LEPTO
NN
NF
NM
NF
KOKE
NM
NM
NM
NF
BVN
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
BVN
NM
NN
BVN
NF
KOKE
KOKE
KOKE
NM
NF
KOKE
NM
KOKE
NM
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
BVN
KOKE
NF
KOKE
KOKE
KOKE
BVM
KOKE
KOKE
NF
KOKE
KOKE
KOKE
KOKE
X200
PMN1
PMN1
PMN3
PMN1
PMN3
PMN0
PMN1
PMN1
PMN1
PMN0
PMN2
PMN3
PMN1
PMN0
PMN0
PMN2
PMN3
PMN0
PMN0
PMN2
PMN2
PMN2
PMN3
PMN2
PMN1
PMN1
PMN0
PMN2
PMN3
PMN2
PMN2
PMN2
PMN3
PMN2
PMN3
PMN2
PMN0
PMN0
PMN1
PMN0
PMN0
PMN3
PMN0
PMN3
PMN3
PMN2
PMN2
PMN3
PMN1
PMN1
Rezultati KOH testa bili su poznati za 42 pacijentkinje od čega je kod 8 test bio
pozitivan, a kod 34 pacijentkinje negativan. Dalje od 50 pacijentkinja kod 27 je mikroskopski
detektovan CA, i to kod 17 CA NULL, kod 6 CA MID i kod 4 CA FULL. Koke su mikroskopski
detektovane kod 64% (32/50), a LEPTO forme kod 16% (8/50) pacijentkinja. Ukoliko sada
zbirno i ukratko analiziramo ove podatke mogli bi smo reći da je mikroskopski nalaz BIFIDO
formi češći kod pacijentkinja sa normalnim nalazom nego BV, daje vaginalni pH povišen kod
ove grupe pacijentkinja, dok su vrednosti KOH testa kod većine pacijentkinja negativne, kao
da su CA i KOKE često udružene sa ovim nalazom što nije slučaj sa LEPTO formama.
158
U zaključku, nalaz BIFIDO formi je češći kod trudnica sa normalnim mikroskopski
nalazom nego sa BV. Njegova učestalost je najveća kod pacijentkinja sa gram pozitivnim
formama koje liče na laktobacile i daju polimorfnu mikroskopsku sliku, povišenim vaginalnim
pH i, uglavnom, negativnim KOH testom. CA i KOKE često nalazimo udružene BIFIDO, što
nije slučaj sa LEPTO formama.
Verujemo da trudnica sa prevagom laktobacila, patološkim brojem PMN, CA i
KOKAMA nije u kliničkom, mikroskopskom, imunološkom i terapijskom pogledu “ista” kao
i trudnica bez laktobacila i BVAB (null), normalnim brojem PMN, bez CA i KOKA, mada smo
i jednu i drugu svrstali u grupu BIFIDO formi. Mislimo takođe da semikvantifikacija ili
kvantifikacija svih mikroskopskih formi mora imati značaja u razlučivanju normalnog i
patološkog, odnosno da pacijentkinje sa malim brojem BIFIDO formi i one kod kojih te forme
predominiraju nikako nisu iste. Iz razloga sličnim onim navedenim za KOKE nije rađena
semikvantifikacija BIFIDO formi.
Ako metodologiju i rezultate koji su dobili Verstraelen i sar. [415] uporedimo sa našim,
možemo doći do sledećih zaključaka. Iako su autori koristili podelu koja suštinski predstavlja
modifikaciju kriterijuma po Ison/Hayu, upadljivo je da kod 221 trudnice autori nisu našli ni
jednu pacijentkinju sa originalnim “gradus 0” (u ovom ispitivanju “čist nalaz”), kao ni jednu
pacijentkinju kod koje su predominirale samo koke, originalno Gradus IV (u ovom ispitivanju
KOKE). Na osnovu naših iskustava i rezultata pretpostavljamo da je većina ovih trudnica (kao
posledica posmatranja preparata na uvećanju x1000), najmanje 10%, preraspoređena u neke od
postojećih kategorija, najverovatnije u grupu BV-like. Ovo ispitivanje je, dakle, zanemarilo
značaj pacijentkinja sa čistim nalazom ili nalazom koka. S obzirom da postojeći dijagnostički
kriterijumi u svoj skor ne uključuju broj PMN jasno je da bi pacijentkinje iz grupe I-PMN (u
našem radu grupa “leukoreja”) na osnovu Nugetovih ili Ison/Hayovih kriterijumima bile
svrstane u grupu sa normalnim nalazom. Da bi pacijentkinje svrstali u ovu grupu neophodno je
isključiti infekciju CA, ali se u radu nigde ne navodi da su pacijentkinje sa mikroskopskim
nalazom ili nalazom kulture na CA isključene iz ispitivanja, a ne navode se ni kriterijumi za
razlikovanje infekcije od kolonizacije CA. Imajući u vidu rezultate našeg ispitivanja kao i
činjenicu da je infekcija CA češća u trudnoći, neverovatno je da od 211 trudnica nijedna na
mikroskopskom nalazu po Gramu nije imala prisutne spore ili hife gljivica, ili su one u
najvećem broju slučajeva ostale nedijagnostikovane zato što je pregledana mala površina
preparata. Naši rezultati po kojima je 80% pacijentkinja sa mikroskopskim nalazom spora ili
hifa gljivica imalo patološki broj PMN ukazuju na potrebu za daljim ispitivanjima koja bi
utvrdila da li je samo CA uzrok povećanom broju PMN, ili se radi o poremećajima vaginalne
159
flore u kojima pored CA i KOKE, BIFIDO ili Lepto forme mogu biti razlog patološkom broju
PMN. Verstraelen i sar. [415] u diskusiji ukazuju neravnomernu raspodelu PMN na preparatu
po Gramu što otežava valjanu kvantifikaciju i daje različite rezultate u zavisnosti od
posmatranog vidnog polja. Upravo je ta nehomogenost glavni razlog što smatramo da
gledanjem veće površine preparata (uvećanje x200) i semikvantitativni pristup omogućavaju
objektivniju procenu broja vaginalnih PMN na preparatu bojenom po Gramu.
Ipak, kada je reč o pacijentkinjama iz BIFIDO grupe, najveći problem svakako
predstavlja činjenica da pod mikroskopom vidimo Gram pozitivne forme koje su vrlo sličnih
fenotipskih karakteristika različitim sojevima laktobacila i što je samo na osnovu
mikroskopskog nalaza teško pouzdano tvrditi koju vrstu bakterija vidimo. Dakle problem je
veoma sličan onome koji se odnosi na (ne)mogućnost mikroskopskog razlikovanja L. inersa i
G. vaginalis. Zato su neophodne uporedne studije u kojima bi kliničar, mikrobiolog i
molekularni biolog blisko sarađivali i na osnovu kliničke slike, nalaza kulture, mikroskopskog
nalaza, rezultata molekularnobioloških ispitivanja (pre svih Q-PCR) pokušali da definišu neke
druge mikroorganizme ili mikrobne zajednice vagine koje bi mogle da imaju značaja za
reproduktivno zdravlje žene.
160
3.3
BROJ, VIJABILNOST I APOPTOZA VAGINALNIH
POLIMORFONUKLEARA
Neutrofili (polimorfonuklearni neutrofilni leukociti) predstavljaju važnu komponentu urođenog
imunog sistema, i oni mogu biti direktno aktivirani različitim bakterijskim produktima i
aktivirani PMN fagocituju i ubijaju bakterije. Ovi procesi se pojačavaju opsonizacijom bakterija
imunoglobulinima, komponentama komplementa (C3b) i fibronektinom (opsonini). Posle
opsonizacije dolazi do vezivanja antigena za receptore na površini fagocita, posle čega dolazi
do ingestije (antigen biva okružen membranom fagocita, patent-zatvarač) i stvaranja i odvajanja
fagozoma koji se onda spaja sa primarnim i sekundarnim lizozomima stvarajući fagolizozom.
Unutar fagolizozoma nalaze se azurofilne (primarne) granule koje sadrže kisele hidrolaze
(katepsin, glukoronidaze, kisele fosfataze), mijeloperoksidaze, elastaze, kolagenaze, defenzini
i lizozimi (muramidaze). Sekundarne (specifične) granule sadrže NADPH-oksidaze, laktoferin,
Vitamin B12 –vezujući protein i gelatinaze. NADPH-zavisni sistem oksidaza predstavlja jedan
od najvažnijih antimikrobnih odbrambenih mehanizama kod viših organizama. Ove oksidaze
pretvaraju molekul kiseonika u singlet-kiseonik, koji može nastati i spontanom dismutacijom
superoksidnog anjona u reakcijama superoksida i hidroksilnih radikala ili reakcijama
superoksida i vodonik-peroksida. Mijeloperoksidaza katalizira oksidaciju halidnih jona
vodonik peroksidom, gde kao jedan od produkata nastaje hipohlorid koji ima jaku antimikrobnu
aktivnost. Azurofilne i specifične granule oslobađaju dve grupe toksičnih supstanci: 1)
kiseonik-zavisne produkte koji nastaju iz reaktivnih metabolita kiseonika i 2) kiseoniknezavisne reaktante kao što su proteaze, laktoferin i PLA2. Mikroorganizam biva obijen
aktivnošću superoksidaznih jona, hidrogen peroksida i hipohlorida. Dakle aktivisani neutrofili
troše velike količine molekula kiseonika, i taj respiratorni prasak dovodi do nastanka radikala
superoksidnog anjona (kiseonik koji je primio samo jedan elektron i onda može delovati i kao
oksidans i kao reduktant) i vodonik peroksida. U okolnostima kada se ove supstance izlučuju
izvan neutrofila, mogu uzrokovati upalu i oštećenje tkiva. PMN su
isključeni iz
mononuklearnog fagocitnog sistema (monociti/makrofagi) zbog toga što oni ne učestvuju u
normalnim specifičnim imunskim reakcijama; oni dakle samo fagocituju mikroorganizam da bi
ga ubili, ali ne i da bi ga prezentovali ćelijama specifičnog imunskog sistema.
161
3.3.1 BROJ POLIMORFONUKLEARA- SEMIKVANTITATIVNE METODE
Najveći problem u proceni uloge PMN u različitim fiziološkim i patološkim zbivanjima jeste
činjenica da ne postoji jasno definisana granica između fiziološkog i patološkog broja PMN.
Najvažniji razlog za to su velike metodološke razlike i granične vrednosti koje prihvataju
pojedini autori, tako da je većina ovih studija praktično neuporediva. Kada je idejno začinjan
ovaj rad planirano je da referentni metod u određivanju broja PMN na preparatu bojenom po
Gramu bude onaj koji su predložili Ramsey i sar. [384]. Ovaj rad je na neki način bio podstrek
koji je opredelio temu ove doktorske disertacije jer su u tom radu Ramsey i sar. ne samo našli
udruženost povećanog broja PMN i PP, nego su pokazali da i metodologija određivanja broja
PMN može bitno uticati na konačan zaključak. Kasnije smo odustali od ove i drugih
metodologija zbog već pomenute studija Larssona koja nas je naterala da izračunamo površinu
vidnog polja našeg mikroskopa radi korektnog numeričkog odnosa bakterijskih formi u zbiru
po Nugentu kao što je to prikazano u tabelama 1 i 2 (videti Materijal i metode). Nakon uvida u
radove koji se bave ovom problematikom, ispostavilo se da su razlike u broju PMN među
pojedinim autorima mnogo veće nego što se to čini na prvi pogled [385 - 409].
Tabela 3.7: Normalan i patološki broj PMN različitih autora i na različitim mikroskopskim uvećanjima
skor
x1000
Simhana401
x1000
Cauci209
x1000
Ramsey384
0
1
2
˃5PMN
≥13.9
˃32 PMN
ili
PMN/EĆ
≥7
3
x400
NPVS
Donders381
x100
0
Datcu
i
sar165
0-1 PMN
˂10 PMN
PMN
0–6
0-24
2-10 PMN
˃10 PMN ali
i
≤10PMN/1E
C
˂10
PMN
˂60
˂240
˃10PMN/1E
C
1150
PMN
61-300
241-1200
˃ 50
PMN
˃301
˂1201
x400
Eschenbach19
7
11-30 PMN
PREKO 30
PMN
x400
Hittii393
˃5PM
N
x400
Datcu
+Larsson356
*
*U ovoj koloni su predstavljeni rezultat koji bi se dobili kada bi po formuli Larssona i sar. uvažile razlike u površini; površina VP na uvećanju
x400 je 6,25 puta veća od površine na uvećanju x1000
Najjednostavniji primer svakako je metodologija koju su koristili Hitti i sar [393]. i ona koju su
koristili Simhan i sar [401] jer je granična vrednost (eng. cut-off) za fiziološki i patološki broj
PMN ista, >5 PMN po jednom VP, a „samo“ se razlikuju mikroskopska uvećanja, x400 kod
Hitti, a x1000 kod Simhana. Ako sada primenimo formulu iz rada Larssona i sar. [356], onda
162
bi u konkretnom slučaju patološki broj PMN na uvećanju x400 trebao da bude >30, jer je
površina na x 400 veća 6,25 puta od površine na x 1000. Ako bi sa druge strane, Ramseyjevu
graničnu vrednost preračunali po Larssonovoj formuli, onda bi ona na uvećanju x400 iznosila
>200 PMN/VP, a u zadnjoj koloni je prikazano kako bi izgledali kriterijumu po Datcu i sar. na
uvećanju x400. Ako bi se odlučili da brojimo PMN na uvećanju x200 i poštovali navedene
proporcije, onda bi to značilo da ove brojeve na uvećanju x400 treba pomnožiti sa 4, jer je
površina vidnog polja na x200 za 4X veća od površine vidnog polja na x400. Onda bi granične
vrednosti bile kao one navedene u poslednjoj koloni (štampano masno i koso). Ni jedan od
radova navedenih u tabeli kao ni desetine drugih ne pominju površinu vidnog polja kao
relevantan parametar u metodologiji određivanja broja PMN. Uzimajući u obzir podatke o
razlikama u površini vidnog polja različitih mikroskopa koje navodi Larsson u svojoj studiji,
ovo bi buduće studije koje se zasnivaju na određenom broju PMN morale navoditi u
metodologiji rada. Ništa manje važnim ne smatramo
činjenicu koja se odnosi na broj
pregledanih vidnih polja koju takođe većina autore ne navodi u metodologiji, a to bi bilo
neophodno radi bolje uporedivosti. Polazeći od ovih činjenica i znajući da je brojanje PMN i
EĆ i određivanje njihovog odnosa (Ramsey i sar. [384]) na NPVS veoma zamoran posao, u
ovom ispitivanju smo se odlučili za jednostavniji i brži pristup. Suština je da se
semikvantitativno proceni broj PMN u odnosu na broj EĆ, a da se vreme iskoristi na pregled
što veće površine preparata. Ovakav pristup je neuporedivo brži i lakši, a i ne zahteva
standardizaciju površine vidnog polja. U metodologiji je naveden najmanji broj VP koja treba
pregledati, ali je u praksi taj broj višestruko veći. Ovakav pristup je suštinski statističkomatematička kategorija. Tako, verovatnoća za pronalaženje skrivenog objekta (npr. CA) i
procenu broja vidljivih „objekata“ (npr. PMN) na mikroskopskom preparatu upravo je
proporcionalna pregledanoj površini preparata, a obrnuto srazmerna njegovoj homogenosti,
odnosno što je preparat nehomogeniji to je za donošenje validnih zaključaka potrebno
pregledati veću površinu.
3.3.1.1 Poređenje rezultata - broja PMN na različitim mikroskopskim uvećanjima
Radi bolje preglednosti u nekim tabelama brojevi 0, 1, 2 i 3 označavaju PMN grupe (PMN0,
PMN1, PMN2 i PMN3), pri čemu se nalazi PMN0 i PMN1 smatraju fiziološkim brojem PMN,
a nalazi PMN2 i PMN3, patološkim brojem PMN, što je u tabelama označeno kao
NORMALNO i PATOLOŠKI kada se ove pacijentkinje spoje u jednu od ove dve grupe.
163
Primenom Hi kvadrat testa testirana je povezanost između pregleda na x200 i x400 i utvrđeno
je postojanje dobre asocijacije (χ2=557,628; df= 9; p<0.001; Tabela 18, Prilog 1), kao i
povezanost između pregleda x200 i x1000 i utvrđeno je postojanje dobre asocijacije
(χ2=471,181; df= 9; p<0.001;Tabela 19, Prilog 1).
Uporedni rezultati određivanja broja PMN na
mikroskopskom uvećanju X200 i X400
pato
30%
70%
normalan
92%
0%
10%
20%
30%
40%
PMN 400 normalan
8%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PMN 400 pato
Grafikon 3.31: Distribucija PMN x 400 u odnosu na PMN x200
164
Uporedni rezultati određivanja broja PMN na
mikroskopskom uvećanju X200 i X1000
pato
40%
60%
normalan
93%
0%
10%
20%
30%
40%
PMN 1000 normalan
7%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PMN 1000 pato
Grafikon 3.32: Distribucija PMN x 1000 u odnosu na PMN x200
Raspodela broja PMN (uvećanje x200) po grupama na
osnovu Nove Podele 6 grupa
56,1%
BV FULL
43,9%
48,3%
BV MID
51,7%
BV NULL
65,3%
34,7%
NORMAL NULL
66,7%
33,3%
60,3%
NORMAL MID
39,7%
68,8%
NORMAL FULL
0%
10%
20%
30%
40%
PMNX200 NORMALAN
31,2%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PMNX200 PATOLOŠKI
Grafikon 3.33: Raspodela pacijentkinja sa normalnim (PMN0+PMN1) i patološkim (PMN2+PMN3)
brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po grupama na osnovu NP-6G
165
Dakle, na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da se sva tri metoda mogu uspešno
koristiti u semikvantitativnom određivanju broja PMN, pri čemu je asocijacija između pregleda
na uvećanjima x200 i x400 bolja u odnosu na onu na uvećanju x1000, što je svakako u vezi sa
činjenicom da na manjem uvećanju gledamo veću površinu. Ipak, vidi se da je ova povezanost
najvećim delom posledica velike podudarnosti u grupi PMN0. S duge strane, iz Tabele 19 Prilog
1 u kojoj su prikazani uporedni rezultati pregleda X200 i x1000 može da se vidi da je 55%
pacijentkinja koje su na osnovu pregleda uvećanja x200 svrstane u grupu PMN2, pregledom na
uvećanju X1000 bile svrstane u grupe PMN0 (10%) i PMN1 (45%). Takođe, 26% pacijentkinja
iz grupe PMN3 na uvećanju x200, je na uvećanju x1000 imalo je nalaz PMN0 (2%) i PMN1
(24%). Ako metod na uvećanju x200 prihvatimo kao zlatni standard onda je na osnovu pregleda
na uvećanju x 1000 tačno 100 pacijentkinja sa patološkim nalazom (x200) imalo normalan
nalaz (x1000), odnosno pripadalo grupi lažno negativnih (LN), dok bi 32 pacijentkinje bila
lažno pozitivne. Ukoliko bi sada računali specifičnost i senzitivnost metoda na uvećanju x1000
u odnosu na x200 kao zlatni standard dobili bi smo sledeće rezultate: specifičnost 60,0%;
senzitivnost 92,9%; sveukupna tačnost 560/691=81,0%; PPV: 83,0%; NPV 80,0%.
U tabelama od 21 – 23, Prilog 1 prikazana je raspodela PMN na osnovu podele pacijentkinja
po grupama različitim metodologijama Nugent, Ison/Hay, Claeys, Amsel i NP-6G. Ove podatke
nećemo detaljnije analizirati jer su prikazani da bi se ukazalo na činjenicu da su PMN u
patološkom broju prisutni kod velikog broja pacijentkinja sa normalnim ili patološkim nalazom
bez obzira koji od dijagnostičkih kriterijuma su korišćeni. Ovaj podatak navodimo pre svega da
naglasimo da se u najvećem broju ispitivanja koje se odnose na vaginalne infekcije PMN i ne
pominju, a gotovo sve studije koje se ozbiljnije bave brojem PMN u vaginalnom sekretu naveli
smo u delu u kome govorimo o različitim dijagnostičkim kriterijumima za određivanje broja
PMN. Nije jasno kako je jedan parametar koji je u prošlosti bio sastavni deo procene stanja
vaginalne flore gotovo potpuno nestao sa naučnoistraživačke i kliničke scene. Jedan od razloga
svakako leži u činjenici da je veoma mali broj kliničara obučen za gledanje mikroskopskog
preparata, bilo nativnog bilo bojenog po Gramu. S druge strane, gledanje preparata po Gramu
(mikrobiolog) uglavnom je ograničeno na dijagnozu BV. Takođe, brojanje PMN na
mikroskopskom preparatu poprilično je zamoran posao i zahteva mnogo vremena. Ali
verovatno najvažniji razlog je činjenica da se poslednjih decenija bavimo uglavnom sa tri
poremećaja vaginalne flore BV, infekcijom trihomonasom i kandidom. Pri tome se BV navodi
kao primer vaginalne infekcije čija je jedna od najvažnijih karakteristika odsustvo PMN, dok
se druga dva stanja karakterišu povećanim brojem PMN. Naravno, normalan nalaz takođe
podrazumeva da su PMN odsutni ili prisutni u malom broju. To „podrazumevanje“ je verovatno
166
i osnovni razlog što najveći broj studija i ne pominje PMN. Zahvaljujući činjenici da je
određivanje broja PMN bio najvažniji cilj ovog istraživanja, oni ne samo da nisu „izgubljeni“
nego ukazuju da bi svaki mikroskopski pregled vaginalnog sekreta morao da uključi i PMN u
konačnu procenu stanja vaginalne flore.
Ako pogledamo podelu po Nugentu onda vidimo da su 153/440 (34,7%) pacijentkinje iz grupe
sa normalnim nalazom imale patološki broj PMN, u intermedijarnoj grupi taj procenat je 32,1%
(36/112), dok je u grupi BV 44,5% (66/148) pacijentkinja imalo patološki broj PMN. Slična
raspodela je i u podeli u po Ison/Hayu, a najmanji broj PMN nađen je u grupi normalnih u
podeli po Claeysu. To je logično zbog postojanja grupe leukoreja koja podrazumeva
pacijentkinje sa normalnim brojem laktobacila i velikim brojem PMN. Ako pogledamo
raspodelu pacijentkinja sa različitim brojem PMN u grupama na osnovu NP-6G onda od ukupno
699 pacijentkinja, 255 (36,5%) je imalo patološki broj PMN, a 444 (63,5%) su imale normalan
broj PMN. Od 526 pacijentkinje sa normalnim nalazom (NF+NM+NN) (298+256+72)
mikroskopskog pregleda preparat po Gramu njih 179 (34%) je imalo patološki broj PMN, dok
je od 173 pacijentkinje sa patološkim nalazom (BVF+ BVM+BVN), 76 (43,9%) imalo
patološki broj PMN. Primenom Hi kvadrat testa utvrđeno je postojanje slabe asocijacije
(χ2=110,943; df=15; p<0.001) između 6 grupa na osnovu NP. Ovo ukazuje na iznenađujuće
ravnomernu raspodelu PMN kod pacijentkinja sa normalnim i patološkim nalazom
mikroskopskog nalaza vaginalnog sekreta. Mogli bismo reći da je u našem ispitivanju oko 35%
pacijentkinja sa normalnim nalazom (predominacija laktobacila) imalo povećan broj PMN, kao
i da je preko 40% pacijentkinja sa BV imalo patološki broj PMN. Ovo je svakako iznenađujuće
jer ni pacijentkinje sa normalnim nalazom ni pacijentkinje sa BV ne bi trebalo da imaju povećan
broj PMN. Poznato je da je odsustvo PMN jedan od znakova BV. Dakle, ako smo mi u našem
ispitivanju imali oko 35% pacijentkinja sa patološkim brojem PMN, verovatno su i druge
studije ovakvog tipa imale oko 1/3 pacijentkinja sa povećanim brojem PMN. Na primer, već
više puta pominjana Ravelova [180] studija, kao i većina drugih, uopšte ne pominje broj PMN
kao relevantan faktor u proceni stanja vaginalne flore. U tu studiju je bilo uključeno 396
asimptomatskih žena, od kojih je kod 97 na osnovu kriterijuma po Nugentu postavljena
dijagnoza BV. Gledajući u rezultate našeg ispitivanja, koji suštinski ima takođe populaciju
asimptomatskih trudnica, verujemo da je i u tom ispitivanju ako ne 35%, onda barem 20-25%
pacijentkinja sa normalnim nalazom mikroskopskog pregleda imalo patološki nalaz PMN,
odnosno da je, ako ne 40%, onda barem 20% (upola manje nego u našem ispitivanju) od 97
pacijentkinja kod kojih je dijagnostikovana BV imalo povećan broj PMN. Ravelovu [180]
studiju navodimo kao primer koji ukazuje da najveći broj istraživanja koja se iz različitih
167
razloga bave BV uopšte ne pominju PMN jer se podrazumeva da oni nisu prisutni u ovoj grupi
pacijentkinja. Dakle, ako gledamo rezultate neke studije u kojoj su korišćeni kriterijumi po
Amselu znamo koliko je pacijentkinja imalo normalan nalaz, a koliko BV i na neki način
podrazumevamo da je broj PMN u obe ove grupe bio normalan, jer se u studiji PMN ne
pominju. Ako ovakva studija ispituje koncentracije nekog zapaljenjskog medijatora kod
pacijentkinja sa normalnim nalazom i onih sa BV, onda bi PMN kao važan učesnik imunskog
odgovora mogli uticati na koncentracije ispitivanog medijatora.
Pacijentkinje sa
predominacijom laktobacila i normalnim brojem PMN i pacijentkinje sa istim nalazom
laktobacila i velikim brojem PMN, ne bismo mogli svrstati u istu kategoriju, a isto se odnosi i
na pacijentkinje sa BV, odnosno svaku grupu pacijentkinja u podelama koje smo prethodno
pominjali. Tako, ako su u nekom ispitivanju korišćeni Nugentovi dijagnostički kriterijumi, onda
više ne bi imali 3, nego 6 grupa, tri (normalan, intermedijaran i BV) sa normalnim brojem PMN
i tri (normalan, intermedijaran i BV) sa patološkim brojem PMN. Podaci iz našeg ispitivanja o
značajnom broju pacijentkinja sa povećanim brojem PMN u svim grupama pacijentkinja i
činjenica da najveći broj studija uopšte ne beleži PMN, verovatno su jedan od skrivenih
ometajućih činilaca koji može da utiče na konačne rezultate ispitivanja. Ono što je nesporno je
činjenica da su PMN, odnosno njihov povećan broj u vaginalnom sekretu, znak nekih
zapaljenjskih zbivanja i da se takav nalaz uvek mora uzeti u obzir.
Najbolja potvrda ovakvim razmišljanjima je činjenica da su Claeys i sar. [216] u posebnu grupu
izdvojili pacijentkinje sa predominantnom laktobacilarnom florom i patološkim brojem PMN,
koji su nazvali idiopatska leukoreja. Naravno autori ukazuju da je uslov da pacijentkinju
svrstate u ovu grupu da isključite infekciju CA jer je ona najčešći uzrok povećanog broja PMN
(Slike 3.18 i 3.19). Ovaj uslov da se isključi infekcija CA je odličan uvod za prikazivanje daljih
rezultata i naših iskustava tokom ovog ispitivanja, a koji se najvećim delom odnose na
otkrivanje infekcije CA.
168
Slika 3.18: Gram pozitivne štapićaste forme i dosta PMN bez C. albicans (x200)
Slika 3.19: Gram pozitivne štapićaste forme, dosta PMN i hife gljivica (x200)
169
3.3.2 BROJ POLIMORFONUKLEARA- KVANTITATIVNE METODE
Pored semikvantitativnog određivanja broja PMN na različitim mikroskopskim
uvećanjima (x200, x400 i x1000), u kvantitativnom određivanju broja PMN korišćena su još
dva metoda (QPMN-A i QPMN-B), a određivana je i vijabilnost PMN izražena kao procenat
apoptoze PMN (%APO). U poglavlju o PMN pokazali smo, primenom kvadratnog testa, da
svaki od ovih metoda može uspešno da se koristi u određivanju broja PMN, ali i ukazali da ta
podudarnost uglavnom potiče od trudnica s nalazom PMN0, kao i na značajne razlike među
pojedinim mikroskopskim uvećanjima. Najpre nešto o našim iskustvima koja se odnose na broj
PMN određivan mikroskopskim pregledom (semikvantitativni metod, X200) i rezultate koje su
dobijeni QPMN-B. Kod 14,6% (160/682) trudnica QPMN-B nisu nađeni PMN, što je sumnjivo
jer, kao što smo rekli, retko se nađe preparat po Gramu na kome nema PMN. Od 255 trudnica
kod kojih je mikroskopskim pregledom na uvećanju x200 utvrđen povećan broj PMN
(PMN2+PMN3), kvantitativnom metodom QPMN-B PMN nisu nađeni kod 32 (14,4%)
pacijentkinje, od čega su 23 iz grupe PMN2, a 9 iz grupe PMN3 na osnovu mikroskopskog
pregleda na uvećanju x200. Ove razlike su najverovatnije posledica tehničkih propusta. Moguće
je da je bris uziman sa različitih mesta u vagini ili je uzet bez dovoljnog pritiska, ili je u
transportu došlo do razlivanja i možda zadržavanja PMN na zidu epruvete i sl. Generalno, što
je duži put PMN od vagine do konačnog brojanja to je i veća mogućnost metodoloških
neslaganja koja bitno mogu uticati na rezultate. Isto se odnosi i na drugi kvantitativni metod
(QPMN-A) gde, pored teškoća da iz vagine usisamo uvek istu količinu tečnosti kojom smo je
ispirali, činjenice da ovim postupkom ulaze u ukupan broj i PMN iz grlića i drugih delova
vagine, već ukazuje na metodološke probleme. Verujemo da će i u budućim ispitivanjima
mikroskopski nalaz preparata bojenog po Gramu ili nekom drugom tehnikom bojenja, kao
jednostavan, brz i jevtin, omogućava uzimanje uzoraka sa različitih delova vagine i/ili grlića,
uz pomenutu softversku analizu (Slika 3.20) (objektivizacija) broja PMN dati najbolje rezultate
u određivanju graničnih vrednosti za broj PMN u brisu vaginalnog sekreta.
170
Slika 3.20: Softverska analiza - prepoznavanje objekata na slici (GSA Image Anlayser, Germany)
QPMN-B je dao relativno dobre rezultate u ROC analizi tako da njegova vrednost u
otkrivanju poremećaja vaginalne flore ima senzitivnost 66,7% i specifičnost 44,0% za graničnu
vrednost 0,3x106/ml, a određivan na osnovu P/N ratio (videti Grafikon 3.36 i Tabela 3.17 na
strani 192). Međutim kako se ROC analiza odnosi na vrednost pojedinih parametara u dijagnozi
BV, onda bi mogli reći da pacijentkinje sa BV imaju povećan broj PMN, što kao što smo
pokazali u analizi rezultata na osnovu mikroskopskog pregleda na uvećanju x200, nije tačno.
Tamo smo i ukazali na činjenicu da se povećan broj PMN kod pacijentkinja sa BV uglavnom
ukazuje i na prisustvo CA. Ukratko, rezultati ROC analize ukazuju da je određivanje broja PMN
metodom QPMN-B opterećeno metodološkim (tehničkim) nedostacima, i da je kao takvu ne bi
mogli preporučiti za kliničku praksu. Ova metodologija uz strožije metodološke kriterijume
(put uzorka od zida vagina do komore i brojanja) možda bi mogla dati bolje rezultate u
istraživačkim projektima.
Primenom Spearmanovog testa korelacije nađena je dobra povezanost samo između
semikvantitativnih metoda na različitim mikroskopskim uvećanjima (x200/x400, x200/x1000 i
x400/x1000; ρ 0,74, ρ 0,73 i ρ 0,81), dok takva povezanost ili nije nađena ili je bila slabija
između semikvantitativnih i kvantitativnih metoda, što samo potvrđuje prethodnu diskusiju
(Tabela 3.8).
171
U već pominjanim radovima belgijske grupe [415, 216, 428, 443], pored grupe I-like, u
našem radu (BIFIDO), svakako da pažnju zaslužuje i grupa I-PMN (kod nas grupa “leukoreja”).
I sami autori [415] ukazuju na činjenicu da bi ove pacijentkinje bile svrstane u grupu sa
normalnim nalazom da je mikroskopski pregled preparata po Gramu procenjivan na osnovu
dijagnostičkih kriterijuma po Nugentu ili Ison/Hayu. Kako autori u svom radu navode, uslov
da bi pacijentkinju razvrstali u ovu grupu je da se isključi infekciju CA. U radu nema detaljnijih
podataka o načinu detekcije CA, a s obzirom na nedorečene i neprecizne kriterijume u
razlikovanju infekcije od kolonizacije CA, verujemo da ovo »isključivanje infekcije CA«
podrazumeva da CA nije detektovana mikroskopskim pregledom preparata po Gramu. Druga
mogućnost je, mada to autori nigde ne navode, da su pacijentkinje sa mikroskopskim nalazom
CA isključene iz ispitivanja ili se podrazumeva da nijedna od 211 pacijentkinja uključenih u
ispitivanje nije imala infekciju CA. PMN su brojani semikvantitativno i pacijentkinje su
podeljene u 4 grupe: nema PMN, +, + +, + + +, pri čemu su nalazi sa izrazito velikim brojem
PMN svrstavani u grupu I-PMN. Pri tome ne navode kriterijume za dodelu +, + +, + + +, a ne
znamo ni broj vidnih polja koja su pregledana niti mikroskopsko uvećanje. Imajući u vidu
rezultate našeg ispitivanja kao i poznatu činjenicu da je infekcija CA mnogo češća u trudnoći,
malo je verovatno da od 211 pacijentkinja nijedna pacijentkinja na mikroskopskom nalazu po
Gramu nije imala spore ili hife gljivica. S druge strane, ako mikroskopskim pregledom
preparata po Gramu kod ovih 211 pacijentkinja nisu identifikovane spore i hife gljivica, ako je
preparat gledan na uvećanju x1000, to potvrđuje naše rezultate vezane za detekciju CA na
različitim mikroskopskim uvećanjima. Rezultati našeg ispitivanja u kojima je mikroskopski
nalaz CA u skoro 80% slučajeva bio udružen sa patološkim brojem PMN, upućuje na potrebu
da u ovakvim ispitivanjima, a posebno ako koristimo kriterijume po Claeysu, prisustvo CA
mora biti detaljnije ispitivano: klinički pregled, NPVS sa 10%KOH, specijalne podloge za
kulture i molekularnobiološke metode (Q-PCR). Ovakvim pristupom i uključivanjem u
ispitivanje npr. KOKA, BIFIDO I LEPTO formi, i drugih mogućih uzročnika povećanog broja
PMN (T. vaginalis, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, virusi itd.) bili bismo bliže odgovoru o
uzroku povećanog broja PMN. Grupa koja je od interesa za autore jesu pacijentkinje koje su
imale normalan broj laktobacila i ekstremno velik broj PMN, a njih je bilo 7% (17/221). U
studiji ne pominju pacijentkinje koje su imale povećan broj PMN (grupe + + i + + + ali ne sa
ekstremno velikim brojem PMN) kao ni njihovu raspodelu po grupama. I mi smo imali četiri
grupe trudnica, dve sa normalnim nalazom i dve sa patološkim nalazom PMN (PMN2 i PMN3).
Iako Verstraelen i sar. [415] nisu naveli detalje određivanja broja PMN, u diskusiji ukazuju da
je jedan od ograničavajućih faktora u njihovoj studiji činjenica da je broj PMN određivan
172
semikvantitativno. Kao najvažniji razlog za takav pristup navode nehomogenost preparata. Kao
potvrdu nehomogenosti prilažemo još četiri fotografije iz ovog rada koje jasno ukazuju koliko
se broj PMN može razlikovati na istom preparatu, pri čemu opet naglašavamo da su sve
fotografije na uvećanju x200, i da se na toj površini nalazi 25 vidnih polja uvećanja X1000,
odnosno da u ove četiri fotografije uvećanja x200, staje 100 fotografija (vidnih polja) uvećanja
x1000.
Slika 3.22: Ogroman broj PMN na ovom VPu i uvećanju x200 u našem ispitivanju PMN3
Slika 3.21: Isti pacijent susedno vidno polje (VP) broj PMNznačajno manji PMN2;površina na uvećanju
x200 ima 6,5 VP uvećanja x400
173
Slika 3.23: Isti preparat treće susedno VP polje na uvećanju x200 (PMN3)
Slika 3.24: Isti pacijent sa značajno manjim brojem PMN (PMN1); treba se prisetiti da na ovoj površini
ima 25 vidnih polja uvećanja X1000 i uočiti koliko se broj PMN može razlikovati na maloj površini
174
Ako svaku od ovih fotografija podelimo na 25 jednakih delova lako uočavamo koliko
se broj PMN razlikuje na svakom od tih 25 zamišljenih polja. Naravno, ovo zapažanje vredi i
za druge ćelijske/bakterijske forme u vaginalnom sekretu. Sami belgijski autori priznaju da je
pri ovakvoj (semi)kvantifikaciji razlika između posmatrača veoma velika i da zahteva dodatnu
validaciju. Upravo neujednačenost razmaza vaginalnog sekreta nameće kao razumno rešenje
semikvantitativni pristup i posmatranje pod manjim uvećanjem (x200) iz razloga koje smo
prethodno razjasnili.
Zanimljiva alternativa, prikazana u Metodologiji o brojanju i morfometrijskim
analizama laktobacila i BVAB je program za analizu mikroskopske slike. Taj program koristili
smo u određivanju broja PMN i prvi rezultati (nije prikazano) koje smo dobili su veoma
ohrabrujući (vidi Sliku 3.23). Verujemo da će ovakav pristup u bliskoj budućnosti biti oruđe
koje će omogućiti da preciznije i objektivnije razgraničimo normalan od patološkog broja PMN
u vaginalnom sekretu.
U ovom ispitivanju smo jasno definisali kriterijume za razlikovanje normalnog od
patološkog broja PMN. Pokazali smo da je od ukupno 699 pacijentkinja 255 (36,5%) imalo
patološki broj PMN. U Nugentovoj grupi sa normalnim nalazom bilo je 153/440 (34,7%)
trudnica sa patološkim brojem PMN, u intermedijarnoj 26,7% (36/122), a u grupi sa BV čak
44,5% (66/148). Kod 57 od 179 (31,8%) pacijentkinja sa patološkim nalazom PMN nije
nađena CA, dok je 35 pacijentkinja sa CA imalo normalan broj PMN. Dakle i ovde 10,8%
(57/526) trudnica možemo da svrstamo u Claeysovu grupu sa idiopatskom leukorejom.
Među trudnicama sa BV, 12,3% (n=12) je imalo povećan broj PMN, a bez CA i ove
pacijentkinje možemo da definišemo kao idiopatsku leukoreju. Podvlačimo da ne možemo da
isključimo druge moguće uzroke povećanog broja PMN (KOKE, BIFIDO i LEPTO forme, n.
gonorrhoeae, HPV, HSV).
Interesantna je hipoteza kojom Verstraelen i sar. [415] pokušavaju da objasne povećan
broj PMN u grupi pacijentkinja sa “idiopatskom leukorejom”, po kojoj je to stanje poremećene
vaginalne flore u fazi izlečenja, ali je dovelo do produženog zapaljenjskog odgovora koji se na
mikroskopskom preparatu očituje kao povećan broj PMN. Ovo bi se naravno, moglo dovesti u
vezu sa našim ispitivanjem koje se odnosi na apoptozu PMN u različitim stanjima vaginalne
flore kao i činjenicom da je u uslovima infekcije produžen životni vek PMN. Imajući u vidu
uopšteno veoma kratak životni vek PMN, njegovo produženje verovatno nije toliko da bi dalo
ovakvu mikroskopsku sliku. Kao još jednu mogućnost autori navode podatke koji ukazuju na
snažnu korelaciju između broja vaginalnih PMN i infekcija gornjih partija genitalnog trakta,
175
navodeći studiju Peipert i sar. [397] da prisustvo PMN u vaginalnom sekretu ima senzitivnost
od oko 78% u dijagnozi akutnih infekcija gornjeg genitalnog trakta, kao i da broj PMN na
NPVS predstavlja odličan marker subkliničkog endometritisa sa senzitivnošću od 90,9% [97,
98]. Oni takođe navode podatke da prisustvo vaginalnih PMN prethodi PP i da kao takvo može
biti znak subkliničke intrauterine infekcije [99, 100]. Međutim, kako nemamo pouzdanih
podataka šta je fiziološki, a šta patološki broj PMN u vaginalnom sekretu rezultate prethodno
citiranih ispitivanja moramo da prihvatimo s velikom rezervom.
Verstraelena i sar. [415] su našli da pacijentkinje iz grupe I-PMN imaju oko 6,8 puta
veći relativni (RR) rizik od PP. U našem ispitivanju na osnovu pregleda preparat po Gramu na
tri različita mikroskopska uvećanja, dva kvantitativna metoda i pregledom NPVS, nismo našli
da trudnice sa povećanim brojem PMN imaju veći RR za PP. Na osnovu naših rezultata (vidi
odeljak o BIFIDO formama), i BIFIDO forme bi mogle biti uzrok povećanog broja PMN u
grupi pacijentkinja definisanoj kao idiopatska leukoreja, pre nego hipoteza koju navode autori.
Naravno, i druge bakterije, virusi i gljivice koje “ne vidimo” na mikroskopu mogli bi biti uzrok
ovakvoj mikroskopskoj slici. Verujemo da je prvi i najvažniji zadatak da se napravi konsenzus
o jedinstvenoj metodologiji mikroskopskog pregleda preparata dok eventualno brzom
kompjuterskom analizom mikroskopskih nalaza kod velikog broja pacijentkinja ne stignemo
do preciznije granice između normalnog i patološkog broja PMN.
Spearmanovim testom nismo našli korelaciju između dužine grlića materice i boja PMN
određivanog semikvantitativnim ili kvantitativnim metodima. Drugim testovima (ANOVA i
Tamhaneov post hoc test) pokazali smo da postoji statistički značajna razlika u varijacijama
između grupe PMN0 i PMN3 (p<0,05) i dužine grlića materice na osnovu rezultata
mikroskopskog pregleda broja PMN na uveličanju x200. Pacijentkinje sa većim brojem PMN
(PMN3) imale su kraći grlić materice.
U tabeli 3.8 (i Tabelama 1 i 2, Prilog 4) prikazani su rezultati Spearmanovog koeficijenta
korelacije. Ispitivana je međusobna povezanost procenta apoptoze, broja PMN određivanog
semikvantitativnim metodom na različitim mikroskopskim uvećanjima, broja PMN
određivanog s dva kvantitativna metoda, dužine grlića materice i ispitivanih citokina.
176
Tabela 3.8: Sperman-ov koeficijent korelacije
Parametri
*
% APO
PMN
(x 200)
-0,218
0,001
217
PMN
(x 400)
-0,146
0,033
215
0,742
0,001
691
PMN
(x 1000)
-0,102
0,136
215
0,727
0,001
691
0,813
0,001
691
ρ
p
n
ρ
-0,218
Broj
PMN
p
0,001
(x 200)
n
217
ρ
-0,146
0,742
Broj
PMN
p
0,033
0,001
(x 400)
n
215
691
ρ
-0,102
0,727
0,813
Broj
PMN
p
0,136
0,001
0,001
(x 1000)
n
215
691
691
ρ
0,174
0,076
-0,493
0,404
QPMNA
p
0,009
0,256
0,001
0,001
(x 106/ml)
n
217
226
224
224
ρ
-0,097
0,255
0,223
0,356
QPMNB
p
0,155
0,001
0,001
0,001
(x 106/ml)
n
217
681
676
676
ρ
-0,045
-0,094
-0,058
-0,096
Dužina
p
0,510
0,014
0,131
0,013
grlića
n
217
678
673
673
* ρ –koeficijent korelacije; p – verovatnoća; n – broj nalaza
%
APO
qPMNA (x
106/ml
-0,455
0,001
217
0,404
0,001
226
0,174
0,009
224
0,076
0,256
224
0,131
0,048
226
-0,106
0,110
226
qPMNB
(x 106/ml)
-0,097
0,155
217
0,356
0,001
681
0,255
0,001
676
0,223
0,001
676
0,131
0,048
226
-0,008
0,827
679
Dužina grlića
-0,045
0,510
217
-0,094
0,014
678
-0,058
0,131
673
-0,096
0,013
673
-0,106
0,110
226
-0,008
0,827
679
-
Crvenim brojevima su označene i boldovane korelacije koje su pokazale statičku značajnost
((p<0,01 ili p<0,05) kao i vrednosti ρ faktora. Očekivano najbolje rezultati su nađeni kod
semikvantitativnog poređenja mikroskopskih nalaza na različitim uvećanjima x200, x400 i x
1000, dok su rezultati u odnosu na dve kvantitativne metode pokazali statističku značajnost ali
slabiju korelaciju. Tako su vrednost  za broj PMN određivan na različitim uvećanjima
međusobno x200/x400, x200/x1000 i x400/x1000 bile 0,74, 0,73 i 0,81 (vidi tabelu). Ovi nalazi
potvrđuju ranije pominjane i analizirane rezultate koji se odnose na međusobnu podudarnost
rezultata mikroskopskog pregleda. Treba primetiti da je semikvantitativna metoda na
mikroskopskom uvećanju x200 dala bolje rezultate u odnosu na druga dva mikroskopska
uvećanja (x400 i x1000) kada se posmatra međusobno povezanost sa dve kvantitativne metode
(QPMN-A i QPMN-B).
Podatak koji nas je prilično iznenadio odnosi se na broj PMN i koncentracije ispitivanih
citokina. Uprkos velikom broju različitih podela i grupa, određivanja broja PMN sa tri
semikvantitativna i dva semikvantitativna metoda, kao i činjenicu da je u ispitivanje uključeno
13 potencijalno relevantnih citokina, kao i primenom najrazličitijih statističkih “oruđa”, nismo
uspeli da nađemo nikakvu povezanost između broja PMN i bilo kog od ispitivanih citokina.
Teško je shvatiti, gledajući fotografije pacijentkinja iz grupa PMN3 i PMN0, da ne postoje
177
nikakve statističke razlike u odnosu na ispitivane citokine. Kada smo govorili o broju PMN i
lokalnim koncentracijama citokina i tada smo naglašavali da nije poznato da li povećan broj
PMN, izazvan infekcijom i/ili zapaljenjem, dovodi do porasta citokina ili je obrnuto. Poznato
je da PMN koji su pristigli na mesto infekcije mogu da budu aktivisani drugim lokalno
proizvedenim citokinima dovodeći da oslobađanja drugih medijatora zapaljenja i pokrećući
tako citokinskim kaskadu. Eksperimentalni podaci na miševima pokazali su nagomilavanje
makrofaga u stromi grlića pre porođaja, što ukazuje da migracija makrofaga može imati važnu
ulogu u sazrevaju grlića materice koji prethodi samom porođaju. Povećan broj makrofaga prati
povećanu produkciju proinflamatornih citokina od kojih su najznačajniji IL-1, IL-6, IL-8 i TNF, dakle onih citokina za koja su dosadašnja ispitivanja pokazala da imaju najznačajniju ulogu
u etiopatogenezi PP udruženog sa infekcijom [361-365]. Nekoliko studija pokazalo je
udruženost i pozitivnu korelaciju velikog broja PMN i visokih koncentracija TNF-, IL-1 i
IL- u vaginalnom sekretu ispitivanih pacijentkinja [72, 261]. Povećanje broja PMN i
makrofaga u grliću materice korelira sa povećanom produkcijom proinflamatornih citokina (IL1, IL-6, IL-8 i TNF-) [361-365]. Kako smo kod najvećeg broja pacijentkinja sa patološkim
brojem PMN u našem ispitivanju mikroskopski detektovali CA interesovalo nas je da li tu
možemo naći neki odgovor na pitanja koje se odnose na naše rezultate koji nisu našli nikakvu
značajniju povezanost ni sa ovom infekcijom i koncentracijama citokina, uprkos najnovijim
podacima koji ukazuju na značaj INF-ɣ, IL-12, IL-17 i IL-23 koji su takođe bili deo našeg
spektra citokina.
Zato smo se odlučili da retrospektivno modifikujemo NP-6G sa ciljem da ona ne odražava samo
odnos laktobacila i BVAB nego da se u ovakvu analizu uvede bar jedan od ometajućih faktora
u našem ispitivanju (CA, KOKE, BIFIDO, LEPTO, PMN) i da proverimo kako bi takva
modifikacija uticala na koncentracije ispitivanih citokina. S obzirom na činjenicu da je smo kod
oko 1/3 ispitanica mikroskopskim pregledom na uvećanju x200 detektovali spore i hife gljivica
i semikvantitativno procenili da imaju povećan broj PMN (PMN2, PMN3) odlučili smo se
modifikaciju u kojoj će mikroskopska detekcija CA biti osnovni modifikujući faktor. Dalje, oko
80% naših pacijentkinja kod kojih je mikroskopski detektovana CA imale su i patološki broj
PMN, tako da ovakva modifikacija odražava mogući uticaj dva ometajuća faktora na dobijene
rezultate. Tako je od pacijentkinje sa nalazom NF i NM, formirana nova grupa (NF+NM), koja
je u zavisnosti od prisustva CA na mikroskopskom nalazu podeljene u dve nove grupe, sa ili
bez CA (NF+NM i NF+NM/CA). Po istom modelu je od pacijentkinja sa nalazom BVF i BVM
formirana jedna grupa, a zatim podeljena u dve u zavisnosti od prisustva CA na mikroskopskom
178
pregledu (BVF+BVM i BVF+BVM/CA). Pacijentkinje iz grupe NN i BVN (hipocelularne)
takođe smo spojili u jednu grupu i podelili na nove dve u zavisnosti od mikroskopske detekcije
CA (NN+BVN i NN+BVN/CA). U prilog ovakvoj modifikaciji ide i činjenica da Donders [214]
ukazuje na postojanje dva tipa bakterijske vaginoze od kojih prvu definiše kao „BV u punom
cvatu“ (eng. Full blown BV) što bi odgovaralo našoj grupi BVF, a drugu kao parcijalnu ili
intermedijarnu BV, što bi odgovaralo našoj grupi BVM. Takođe se treba prisetiti i podatka da
je kod oko polovine pacijentkinja sa BV detektovano prisustvo CA. Kao što smo već opširno
diskutovali naše grupe sa hipocelularnim nalazom (NN i BVN) su najproblematičnije kako u
dijagnostičkom tako i u kliničkom pristupu, zbog čega smo ih u ovoj podeli transformisali u
jednu grupu, pre svega što smo prethodnim rezultatima pokazali da mikroskopski kriterijumi
nisu dovoljni da napravimo preciznu razliku između „normalnog“ i „patološkog“. Danas
mislimo da ovakva modifikovana NP-6Ga bolje odražava stanje vaginalne flore u odnosu na
originalnu NP-6G, kao i u odnosu na postojeće (Nugent, Amsel, Ison/Hay, Claeys), koje
suštinski odražavaju samo odnos laktobacila i BVAB, dok ova modifikovana NP-6G odražava
prisustvo jednog (CA) odnosno dva (CA i PMN) ometajućeg faktora s obzirom da je 80%
pacijentkinja sa CA imalo i patološki broj PMN. Međutim odustali smo od ovakve podele jer
ona jednostavno ne bi bila uporediva sa postojećim dijagnostičkim kriterijumima.
U Tabeli 3.9 su prikazani rezultati dobijeni Kruskal–Wallisovom analizom varijanse (post hoc
Mann–Whitney U test; Tabela 6, Prilog 2) na osnovu modifikovane NP-6G, a statistički
značajne razlike označene su crvenim slovima odnosno brojevima. Već na prvi pogled je jasno
da se rezultati koje smo dobili ovako modifikovanom NP-6G bitno razlikuju od onih dobijenih
u originalnoj NP-6G, i to kako u odnosu na koncentracije pojedinih citokina, tako i u odnosu
na broj PMN.
Tabela 3.9: Rezultati Kruskal-Wallis testa za modifikovanu i originalnu podelu NP-6G
QPMNA QPMNB
NP-6G
(modifikovana)
(originalna)
IFN-γ IL-17A IL-2 IL-10 IL-9 IL-22 IL-6 IL-13 IL-4
IL-5 IL-1β TNF-α
χ2
14,78
48,20
8,07
6,91
13,99
10,81 9,20 20,50 0,90 16,58 11,14 14,67 7,38 32,53
p
0,011
0,000
0,152
0,227
0,016
0,055 0,101 0,001 0,970 0,005 0,049 0,012 0,194 0,000 0,135
IL12p70
NP-6G
IL-12p70
χ 2 18,518
p
0,002
IFNγ
IL17A
IL2
IL-10
IL9
IL22
IL6
IL13
IL4
IL5
IL1β
8,42
TNFα
12,890 5,641 3,638 3,721 10,417 5,108 12,093 2,307 2,478 4,192 18,984 8,386
0,024
0,343 0,603 0,590 0,064 0,403 0,034 0,805 0,780 0,522 0,002
0,136
179
Tako je statistička značajnost u obe podele nađena samo za IL-6 i IL-1β, a modifikacijom NP6G je „izgubljena“ značajnost za IL-12 i INF-γ, ali je zato nađena za 4 druga citokina, IL-17,
IL-4, IL-9 i IL-13. Pored toga modifikovanom podelom nađena je statistička značajnost i za
obe kvantitativne metode za određivanje broja PMN (QPMN-A i QPMN-B) (vidi Tabelu 6 u
Prilogu 2). Podatak da je modifikovanom podelom nađena statistička značajnost u odnosu na
obe kvantitativne metode određivanja broja PMN ukazuje da je naša pretpostavka da će pored
CA, PMN biti drugi ometajući faktor, tačna.
S obzirom da je u ovakvoj modifikovanoj podeli CA bila odlučujući faktor u formiranju novih
grupa, ukazaćemo na neke, po našem mišljenju, važne činjenice. Prvo, detekcija spora ili hifa
gljivica na mikroskopskom preparatu po Gramu ne znači da pacijentkinja ima infekciju CA jer
je poznato, a to su pokazale i nove molekularne studije, da CA predstavlja čestog člana
vaginalne flore i da je tu prisutna kao komensal. Takođe je poznato da izolacija CA kulturom
ne znači infekciju, zbog čega neki autori veruju da je nalaz CA na mikroskopskom pregledu
(nativnom ili bojenom po Gramu) pre govori u prilog infekcije nego pozitivan nalaz kulture, jer
pozitivan mikroskopski nalaz govori u prilog većem broju patogena. Simptomi pacijentkinje i
klinički znaci infekcije takođe su značajan deo skora u dijagnozi infekcije CA, ali je takođe
poznato da određen broj pacijentkinja sa infekcijom CA (na osnovu postojećih dijagnostičkih
kriterijuma) nema nikakvih simptoma (individualan prag osetljivosti za pečenje svrab), kao i
da klinički nalaz može značajno da se razlikuje (karakterističan, gromuljičast sirast sekret, ali
ili beličasta vodenasta sekrecija). Problem koji do sada nismo pominjali, a koji suštinski govori
o onome što smo mi u ovom radu definisali kao ometajući faktori, je problem mešovitih
vaginalnih infekcija, ili preciznije rečeno njihovog razlikovanja od koinfekcija. Rad Sobel i sar
[416] možda na najbolji način definiše i objašnjava postojeće probleme, ali je jasno da na tom
polju postoji još veliki broj problema, pogotovo ukoliko se osvrnemo na rezultate
molekularnobioloških analiza vaginalnog mikrobima vagine. Koncept postojanja mešovitog
vaginitisa (MV) veoma je teško definisati, a još teže klinički potvrditi. Sobel [416] ka
najjednostavniju definiciju navodi onu po kojoj bi to značilo da su u vagini istovremeno prisutni
dva ili više potencijalnih patogena, bez obzira na njihov pojedinačni klinički značaj. S obzirom
na činjenicu da se CA može kulturom naći (kolonizacija) kod 10-15% zdravih pacijentkinja
ovakav pristup značajno bi povećao učestalost (epidemiološku)
mešovitih infekcija, a
isključivanjem nalaza kulture gljivica ovaj procenat bi bio značajno niži. Zato Sobel [416]
definiše mešoviti vaginitis kao prisustvo dva ili više patoloških procesa (ne patogena) koji
koegzistiraju u vagini i od kojih svaki dovodi do određenih simptoma i kliničke slike. Suprotno
180
ukoliko je samo jedan od patogena odgovoran za simptome onda se prisustvo drugih može
ignorisati jer se u takvim slučajevima radi o koinfekciji. Tako autor navodi primer da je malo
verovatno da CA uzrokuje neprijatan miris iz vagine, ali da kod takve pacijentkinje kulturom
može biti izolovana CA što ne znači da kod takve pacijentkinje treba sprovesti i antimikotičnu
terapiju, nego treba lečiti uzrok neprijatnog mirisa koji je najčešće BV ili Trichomonas
vaginalis. S druge strane pacijentkinja sa BV kod koje kulturom ili molekularnim tehnikama
detektujemo prisustvo C. trachomatis ili N. gonorrhoeae potrebno je lečiti, jer kao što je
poznato 2/3 infekcija C. Trachomatis protiče bez simptoma. Međutim, jasno je koliko samo
podatak da oko 50% pacijentkinja sa BV nema simptome komplikuje pokušaje da razlučimo
mešovite infekcije od koinfekcija samo kod pacijentkinja sa BV i CA. Ako tome pridodamo
poremećaj vaginalne flore koje je Donders definisao kao aerobni vaginitis i koji se karakteriše
mikroskopskim nalazom velikog broja PMN (što je i karakteristika vaginalne kandidoze), a pri
tome su vrednosti pH preko 4,5 (što je karakteristika BV) onda su pokušaji da razlučimo
mešovitu infekciju od koinfekcije još teži [417, 418]. Po našem mišljenju možda bi korektnija
podela bila na endogene i egzogene vaginalne infekcije, mada je sam naziv na neki način
zastareo i nerado se navodi u literaturi. Tako bi egzogene infekcije podrazumevale prisustvo
mikroorganizama za koje je pokazano da nisu (povremeni ili stalni) članovi vaginalnog
mikrobioma i podrazumevali bi infekcije mikroorganizmima kao što su T. vaginali, C.
Trachomatis, N. gonorrhoeae, HSV, HPV itd., odnosno svi oni mikroorganizmi (bakterije,
virusi, gljivice, paraziti) za koje dosadašnje ili buduće molekularnobiološke analize pokažu da
ne pripadaju vaginalnom mikrobiomu. S druge strane endogene infekcije nastaju kada dođe do
poremećaja u broju i odnosu pojedinih članova u vaginalnom mikrobiomu. tako bi porast u
broju nekih komensala kao što je C. albicans doveo bi do vaginalne kandidoze, porast u broju
G. vaginalis i drugih BVAB doveo bi do nastanaka BV, a porast broja koka do nastanka
aerobnog vaginitisa. Najlakše je to razumeti ukoliko pogledamo grafikone preuzete iz rada
Shiptsyne i sar. [179] u kojoj je kvantifikovano prisustvo pojedinih članova vaginalne flore.
prvo što treba uočiti da je „spisak" različitih bakterija gotovo identičan za sva tri navedena
poremećaja vaginalne flore, a ono što ih razlikuje jeste odnos laktobacila (na grafikonima
crvena, tamno plava i zelena boja) i BVAB (na grafikonima ljubičasta, svetlije nijanse plave i
druge boje). Dakle suštinski dolazi samo do promene broja (kvantitativni diverzitet) članova
vaginalnog mikrobioma, a svi se oni gotovo uvek mogu detektovati (kvalitativni diverzitet) i
kod pacijentkinja sa normalnim nalazom i kod pacijentkinja sa BV. Međutim ono što po našem
mišljenju nedostaje ovakvoj jednoj studiji, odnosno krugovima na grafikonima jeste prisustvo
i kvantifikacija CA ili broja PMN, bez obzira na činjenicu da je ova studija primarno imala za
181
cilj da ispita vrednost molekularnih metoda u dijagnozi BV. U studiju su uključene su 163 žene
90 bez i 73 sa simptomima vaginalnih infekcija i to kako autori navode pojačan sekret, svrab,
peckanje i dizurija. Dijagnoza BV postavljana je na osnovu Amselovih dijagnostičkih
kriterijuma na osnovu kojih je kod 73 pacijentkinje postavljena dijagnoza BV, 11 je imalo
intermedijaran nalaz na osnovu mikroskopskog nalaza nativnog preparata (dakle ne radi se o
Nugentovoj intermedijarnoj grupi), a 79 pacijentkinja su bile zdrave. Iako bi neki od pomenutih
simptoma govorili u prilog infekciji CA, autori nigde ne navode da li je i kako isključena
infekcija CA. S obzirom na rezultate koje smo mi dobili u našem ispitivanju, kao i rezultate
epidemioloških studija, smatramo da je nemoguće da bar 10-20% od ove 163 pacijentkinje nije
imalo infekciju ili koinfekciju CA, a sličan komentar odnosio bi se i na normalan i patološki
broj PMN. S obzirom da rezultati našeg ispitivanja nedvosmisleno ukazuju da je CA u najvećem
broju slučajeva uzrok povećanom broju PMN, mislimo da bi svaka buduća studija koja se bavi
vaginalnim mikrobiomom morala kao obavezan deo da ima prajmere za detekciju CA i
semikvantitativnu procenu broja PMN, jer bi na taj način mogli preciznije da tumačimo
dobijene rezultate. Čak i ukoliko nam je cilj da procenimo samo odnos laktobacila i BVAB i
ispitamo mogućnost molekularne dijagnoze BV, treba imati u vidu da i neka druga stanja kao
što su infekcija trihomonas vaginalisom ili aerobni vaginitis takođe daju isti kvantitativni odnos
između laktobacila i BVAB. Dakle sasvim je moguće da na osnovu rezultata
molekularnobioloških analiza postavimo dijagnozu BV, a da pacijentkinja ima infekciju
trihomonasom ili aerobni vaginitis, a u pomenutom radu nije dakle isključena ni mogućnost
postojanja jednog od dva entiteta. Takođe da je u pomenutom radu na primer kvantitativno
procenjivan broj PMN i koreliran sa dobijenim rezultatima kvantifikativnog PCR mogli bi da
donesemo mnogo pogrešnih zaključaka o uticaju određenih bakterijskih sojeva na broj PMN,
zato što nismo isključili prisustvo CA, infekcije trihomonasom ili aerobnog vaginitisa, dakle tri
vaginalne infekcije čija je jedna od osnovnih i zajedničkih karakteristika povećan broj PMN.
Na kraju, mi smo u ovom radu nekoliko puta naveli podatak da je oko 50% naših pacijentkinja
sa BV imalo mešovitu infekciju ili koinfekciju CA. Međutim nismo sigurni da ništa manje nije
ispravno da smo rekli suprotno, da je oko 50%
182
Slika 3.25: Preuzeto iz rada Shiptsyne i sar. referenca 179
183
pacijentkinja kod kojih smo mikroskopski detektovali CA imalo i BV. Dakle mi ne znamo šta
je u konkretnom slučaju bio okidač za promene u vaginalnoj flori CA ili BVAB. Podsetićemo
da smo u ovom ispitivanju pokušali da na osnovu mikroskopskog nalaza semikvantitativno
razlikujemo tri oblika infekcije CA i da te rezultate uporedimo sa brojem PMN, i da nismo
uspeli da nađemo takvu korelaciju. Pitanje na koje i sada nemamo odgovor jeste da li je u nekim
slučajevima gde smo detektovali svega nekoliko spora i hifa gljivica to razlog velikog broja
PMN ili su razlozi drugi, a nama za sada nepoznati. Bilo kako bilo modifikacija NP-6G
nedvosmisleno je potvrdila da CA i PMN mogu značajno uticati na rezultate koji se odnose na
koncentracije ispitivanih citokina. Podatak da je ovakvom podelom, u kojoj je CA osnovni
faktor modifikacije, pokazana statistička značajnost za 4 druga citokina, IL-17, IL-4, IL-9 i IL13, mogli bi povezati sa značajem ovih citokina u etiopatogenetskim zbivanjima vezanim za
vaginalnu kandidozu. Na primeru vaginalne kandidoze pokušaćemo da ukažemo na svu
komplikovanost odnosa i teškoće u tumačenju dobijenih rezultata kao i na činjenicu da broj i
vrsta mikroorganizama nisu faktor koji odlučujuće utiče na koncentracije citokina u
cervikalnom sekretu, nego da tu verovatno značajniju ulogu igraju ne samo imunske nego i
epitelne ćelije (EĆ) domaćina. Još uvek ni za CA, a ni većinu drugih komensalnih organizama,
nemamo objašnjenje kako ih domaćin nekada prepoznaje kao komensale a u drugim uslovima
kao patogene, što je verovatno jedno od najvažnijih pitanja u budućim istraživanjima.
Dosadašnja istraživanja uglavnom su se bavila odgovorom imunskih ćelija (PMN, makrofaga,
dendritskih ćelija itd.) na CA, ali poslednjih godina se sve više ističe značaj EĆ u odbrani od
ovog patogena. Prepoznavanje patogena od strane ćelija domaćina dovodi do oslobađanja
odgovarajućeg spektra citokina. Dok je za mijeloidne ćelije ovaj spektar relativno dobro
proučen i uključuje oslobađanje IL-12, IL- 1β, TNFα zajedno sa drugim proinflamatornim
citokinima [419], dok se o ulozi EĆ mnogo manje zna. Ipak možemo reći da inficirane EĆ
takođe produkuju proinflamatorne citokine i hemokine [420, 421] kao što su IL-1α/β, IL-6, GCSF, GM-CSF, TNFα, IL-8 i druge, ali EĆ ne produkuju IL-12, IFNγ, IL-4 ili IL-13. Kakvi su
direktni efekti ovih citokina ostaje nejasno, ali se zna da oni deluju na limfoidne i mijeloidne
ćelije dovodeći do njihove aktivacije i regrutacije sa ciljem da se poveća njihov broj u
mukoznim površinama i tako zaštite od patogena. Veliki značaj PMN u infekciji CA potvrđen
je velikim brojem eksperimentalnih i kliničkih podataka na različitim životinjskim modelima i
mukoznim površinama, a to su pokazali i rezultati našeg ispitivanja kada je u pitanju broj PMN
i detekcija CA [422], i jedan od praktičnih zaključaka našeg ispitivanja je da uvek kada na
mikroskopskom preparatu vidimo povećan broj PMN moramo pažljivo i dugo tragati za
sporama i hifama gljivica. Studija Fidela i sar.[390] u kojoj je zdravim ženama inokulisana CA
184
ukazala je na postojanja dva tipa protekcije od CA, jedan asimptomatski u kome ne dolazi do
nikakvog inflamatornog odgovora, i drugi simptomatski u kome dolazi do snažnog
inflamatornog odgovora koji se primarno odlikuje velikim brojem PMN i klasičnim
simptomima zapaljenja, crvenilom, otokom bolom. Ista studija je pokazala da tečnost dobijana
lavažom iz vagine simptomatskih pacijentkinja u in vitro uslovima dovodi do migracije PMN,
dok migracija PMN izostaje u vaginalnom ispirku asimptomatskih pacijentkinja. U ovoj studiji
autori su pokazali da vaginalni pH, faza menstruacionog ciklusa, bakterijska flora u vreme
inokulacije, kao ni koncentracija inokulisane CA nisu imali uticaja na razvoj simptomatske ili
asimptomatske infekcije, pri čemu se naravno ne može isključiti mogućnost da virulentnost CA
zavisi od drugih uslova u vaginalnoj sredini. Kao interesantne autori navode tri pacijentkinje
koji su imale kliničke simptome ali ni kulturom ni pregledom mikroskopskog preparata sa 10%
KOH nije detektovano prisustvo CA zbog čega u istoj studiji nisu smatrane inficiranim, ali
autori ne isključuju mogućnost da se kod određenog broja žena i ovako male i kulturom
nedetektabilno prisustvo CA može dovesti do simptoma, a kao drugu mogućnost navode neke
druge poremećaje vaginalne flore koji su uzrok simptoma pacijentkinje. Još jedan važan
zaključak ove studije jeste da koncentracija patogena sama po sebi nije prediktivna za nastanak
infekcije. Ovi rezultati objašnjavaju mikroskopske nalaze pacijentkinja kod kojih smo videli
veliki broj PMN, a kod kojih smo detektovali prisustvo malog broja spora ili hifa gljivica,
pitajući se da li je moguće da tako mali broj spora bude uzrok tako velikom broju PMN. U ovu
grupu svakako spadaju i pacijentkinje sa velikim brojem PMN kod kojih mikroskopski nismo
detektovali prisustvo spora ili hifa gljivica, a i one kod kojih smo detektovali spore i hife
gljivica, ali kod kojih je broj PMN bio normalan (51/249). Ispitujući razloge zbog kojih ispirak
iz vagine simptomatskih pacijentkinja dovodi do hemotaksije PMN, autori navod da CA sama
ne uzrokuje hemotaksu PMN, ali naravno ne isključuju mogućnost da interakcija CA i EĆ
domaćina može biti razlog migracije PMN. Kod asimptomatske pacijentkinje kod kojih je
detektovano prisustvo CA nije dolazilo do infiltracije PMN. Dakle nedvosmisleno je da PMN
igraju veoma važnu ulogu kod pacijentkinja sa simptomatskom vaginalnom kandidozom, ali je
logično da i drugi faktori kao što su citokini i imunomodulatorne supstance zajedno ili
nezavisno od PMN imaju učešća u nastanku zapaljenskog procesa i simptomima pacijentkinja.
Zato autori navode i podatke svojih preliminarnih ispitivanjima vaginalne tečnosti pre i posle
inokulacije CA i zaključuju da su u vaginalnom ispirku detektovani različiti citokini i
imunomodulatori ali da nisu mogli da utvrde ni jedan obrazac koji bi govorio u prilog zaštite ili
povećana osetljivosti na infekciju CA, kao ni za BV. Ovi rezultati su u saglasnosti sa rezultatima
koje smo mi dobili u našem ispitivanju a koji se odnose na koncentracije citokina i različite
185
mikroskopske nalaze vaginalne flore ili broj PMN. Tako je i ova studija potvrdila da broj
bakterija i/ili broj PMN ne koreliraju po jednostavnom matematičkom modelu sa
koncentracijama citokina ili različitih imunomodulatornih supstanci, nego da su one rezultanta
velikog broja faktora od kojih neki indukuju a drugi inhibiraju produkciju određenog citokina.
Na osnovu iznesenih činjenica jasno je sa koliko opreznosti i kritičnosti moramo tumačiti
rezultate koji se odnose na koncentracije pojedinih citokina u ovakvim ispitivanjima. Ako se
sada prisetimo činjenica o kojima smo govorili u uvodu ovog rada a koji se odnose na podatke
koji jasno ukazuju kako bakterije u svojoj invaziji napadaju neke ključne odbrambene ćelijske
mehanizme sa ciljem da preuzmu potpunu kontrolu nad njima ili da ih isključe iz funkcije.
Takođe, meta njihovog napada gotovo nikada nije jedan, nego, više untarćelijskih mehanizama
koji predstavljaju za njih potencijalnu opasnost, ali koji bi mogli da počnu da funkcionišu u
njihovu korist [423]. Od mnogobrojnih i naučno dobro dokumentovanih “ratnih strategija” koje
primenjuju različiti mikroorganizmi ovde ćemo navesti samo one najčešće. Gotovo na svakom
delu imunskog odgovora domaćina mikroorganizmi imaju strategiju za izbegavanje imunskog
odgovora domaćina, dakle od samog ulaska kada produkuju različite modulatore i toksine,
preko modulacije receptora na svojoj površini i uticaja na receptore na imunskim ćelijama
domaćina koji prepoznaju patogene, smanjuju ekspresiju MHC i MHC II molekula, uticaja na
antigen prezentujuće ćelije, citotoksične i NK ćelije [424, 425]. Modulacija vezikularnog
saobraćaja unutar ćelija domaćina, odnosno strategije stvaranja niša (vakuola) unutar ćelije
domaćina koji ih štite od humoralnog imuniteta i ćelijskih imunskih mehanizama. Ove niše
neke od bakterija formiraju unutar makrofaga i PMN, koji kao što znamo imaju osnovnu
funkciju da ih ubiju [426, 427].
Takođe oni ispoljavaju inhibitorne uticaje na regrutaciju PMN, i njihovu fagocitozu i druge
odbrambene funkcije, inhibitorni uticaj na makrofage i funkcije komplementa, uticaj na
produkciju proinflamatornih, antiinflamatornih citokina i hemokina, blokira inflamatorni i
aktivira alternativne puteve, blokira ili pojačava TLR signale ili izbegava prepoznavanje od
strane TLR i NOD receptora [428, 429]. Utiče na apoptozu i autofagiju dovodeći do njihove
inhibicije ili akceleracije, aktivirajući ili remeteći apoptotične signalne puteve [430, 431].
Odlaganje apoptoze kao što smo pomenuli je jedan od najvažnijih faktora u nastanku hroničnih
inflamatornih bolesti (najveći broj autora smatra da PP predstavlja hronični inflamatorni
događaj). Zbog toga ćemo u narednom delu diskusije prikazati naše rezultate koji se odnose na
vijabilnost i apoptozu PMN u ovom ispitivanju.
186
3.3.3 APOPTOZA I VIJABILNOST VAGINALNIH POLIMORFONUKLEARA
Da bi od blast ćelije nastao zreli neutrofil potrebno je oko 15 dana, dok je njihovo
preživljavanje manje od jednog dana (6-18h). Od svih ćelija imunskog sistema neutrofili imaju
najkraći vek što proizilazi iz činjenice da u fiziološkim uslovima neutrofili podležu apoptozi.
Nove vremenske razlike u „rađanju“ i „umiranju“ PMN leži u činjenici da neutrofili u sebi nose
različite supstance koje su neophodne u borbi protiv različitih patogena, ali koje ukoliko se
nekontrolisano oslobađaju mogu biti potencijalno opasan po život ili dovesti do različitih
oboljenja. Dakle, proces u kojem PMN prirodno prolaze svoj životni ciklus, bez potrebe da se
generišu dodatni signali za ćelijsku smrt, ima za cilj da zaštiti domaćina od mogućnosti da veliki
broj aktiviranih ćelija perzistira u cirkulaciji u dužem vremenskom periodu. Zbog kratkog poluživota cirkulišućih neutrofila koštana srži mora da oslobodi oko 5x1010 neutrofila dnevno
potrebnih za efikasnu zaštitu od infekcije. Za razliku od kratkog poluživota cirkulišućih
neutrofila, neutrofili regrutovani u tkiva imaju mnogo duži opstanak , jer tamo izbegavaju
posledični apoptotični put. Iako ne znamo precizan odgovor na pitanje koliko PMN mogu da
prežive u tkivima (nekoliko dana), ono što svakako znamo jeste da to u najvećoj meri zavisi od
uslova lokalne sredine, odnosno balansa između proapoptotičnih i antiapoptotičnih faktora i
naravno samog patogena. U in vitro uslovima PMN mogu preživeti nekoliko dana ukoliko su
izloženi npr. proinflamatornim citokinima tako da nije nerazumno da se slično dešava i u in
vivo uslovima. citokini i mnoge druge supstance mogu dovesti do odlaganja, ali ne i sprečavanja
apoptoze PMN. Takvi faktori usporavaju, ali ne sprečavaju apoptozu i neutrofili će konačno
postati apoptotični, a naknadno uklonjena sa mesta od strane makrofaga tkiva ili drugih
fagocitnih ćelija. Čitav ovaj aktivni i stoga kontrolisani proces kontrolisane smrti i uklanjanja
neutrofila naziva se rezolucija inflamacije i predstavlja jedan od najvažnijih homeostatskih
mehanizama. Apoptotični neutrofili nemaju sposobnost hemotaksija, degranulacije,
adherencija, fagocitoza ili aktivacija respiratornog praska, a ekspresija mnogih površinskih
ćelijskih receptora značajno je smanjena. Na ovaj način plazmatska membrana ostaje netaknuta
i deluje kao propustljiva barijera sprečavajući izlazak potencijalno opasnih sadržaja iz
neutrofila, dok u slučaju nekroze dolazi do rupture plazmatske membrane, oslobađanja sadržaja
i oštećenja lokalnog tkiva. Dakle, apoptoza neutrofila praćena njihovom fagocitozom od strane
makrofaga i fibroblasta osigurava mehanizam za bezbedno uklanjanje neutrofila sa mesta upale
čime se umanjuje rizik od oštećenja tkiva. U uslovima infekcije dolazi do povećanog broja
PMN, ali i ometanja normalnog apoptotičnog puta sa ciljem da se produži preživljavanje PMN
i tako efikasnije savlada infekcija. Zbog toga je jedan od ciljeva ovog ispitivanja bio da
187
proverimo u kakvom su odnosu ukupan broj vaginalnih PMN određivan kvantitativnim i
semikvantitativnim metodama u odnosu na njihovu vijabilnost i apoptozu.
Odmah na početku ukazaćemo na veoma bitne metodološke razlike koja ne smemo
zaboraviti kada se analiziraju rezultati koji se odnose na broj i apoptozu vaginalnih PMN. Tako
smo za kvantifikativnu metodu A (QPMN-A) uzorak dobijali posle ispiranja vagine sa oko 20
ml fiziološkog rastvora, dok je za kvantitativnu metodu B (QPMN-B) uziman bris sa bočnog
vaginalnog zida i stavljan u 1 ml fiziološkog rastvora, dok je za semikvantitativne metode
uzorak uziman sa bočnog vaginalnog zida razmazivan na mikroskopsku pločicu i bojen po
Gramu. Dakle u prvom slučaju uzorak je uziman sa mnogo veće površine, a s druge strane i deo
PMN iz grlića materice verovatno ulazi u ukupna broj PMN. Ako opet znamo da su pojedini
autori našli značajno različit broj PMN u uzorcima iz intoitusa, sredine ili forniksa vagine onda
je jasno koliko ove metodološke razlike mogu bitno uticati na rezultate ispitivanja. S obzirom
da su vijabilnost i apoptoza PMN određivani iz uzorka koji je dobijen ispiranjem vagine,
logično je bilo da najbolje rezultate. Ćelije su brojane u 1% rastvoru Turka, a ukupan broj
vijabilnih ćelija je određen pomoću rastvora Tripan plavog. Iz Tabele 3.10 se vidi da je postala
izrazito velika heterogenost u broju kako ukupnih tako i vijabilnih polimorfonukleara, koja je
jednim delom verovatno uzrokovana i samom metodologijom. Naime, jasno je da u vaginu
možemo ubaciti tačnu količinu fiziološkog rastvora, ali je takođe jasno da količina aspiriranog
sadržaja ne može biti ista za sve pacijentkinje, kao i da to može uticati na konačan broj PMN.
Tabela 3.10: Vrednosti ukupnog broja PMN i broja vijabilnih PMN u vaginalnom ispirku trudnica
n
ukupan broj PMN (x 106)
ukupan broj vijabilnih PMN (x 106)
217
217
Srednja
vrednost
41.8
39.2
Standardna
devijacija
160.2
153.2
Min
Max
0.2
0.2
1770.0
1725.8
U okviru ispitivanja apoptoze vaginalnih polimorfonukleara, prvi cilj je bio uvođenje
najjednostavnije i najpouzdanije metode za detekciju i kvantifikaciju apoptoze. Primenjene su
sledeće metode: morfološka analiza ćelija u suspenziji nakon bojenja 1% rastvorom Turka,
detekcija ćelija sa hipodiploidnim jedrima nakon bojenja permeabilizovanih ćelija sa
propidijum jodidom i dodatnom morfološkom analizom na konfoklanom mikroskopu, detekcija
apoptotičnih / sekundarno nekrotičnih ćelija nakon bojenja sa Aneksin-FITC-om i propidijum
jodidom. Rezultati ispitivanja su prikazani na Grafikonu 3.34 i Slici 3.26.
Sve tri metode su pokazale veoma kompatibilne rezultate. Ukupan procenat apoptotičnih ćelija
je bio nešto veći primenom Aneksin-FITC/propidijum jodid metode, a ukupan procenat
188
apoptoze nešto manji primenom hipodiploidnog kriterijuma, u odnosu na morfološku metodu.
Zbog toga je u narednom ispitivanju morfološka metoda odabrana kao pouzdana, najjeftinija i
najpouzdanija za kvantifikaciju apoptoze.
Grafikon 3.34: Metode proučavanja apoptoze vaginalnih PMF. A) Prikaz rezultata morfološke analize
apoptoze PMF obojenih 1% Turk-a za četiri različita uzorka (a-d). Procenti apoptotičnih PMF su dobijeni
an osnovu najmanje 500 ćelija iz svakog uzorka. B) Prikaz rezultata apoptoze dobijene analizom
hipodiploidnog nukleusa pomoću protočne citopmetrije za ista 4 uzorka (a-d). C) Reprezentativan tačkasti
dijagram iz analize apoptoze PMF obojenih Aneksin/FITC-PI metode, na protočnoj citometriji
189
Slika 3.26: Analiza apoptoze vaginalnih PMF pomoću konfoklane mikroskopije. PMF dobijeni iz vaginalnih
ispiraka su sakupljeni i obojeni pomoću direktno konjugovanog antitela anti-CD45-FITC kako je opisano u
poglavlju Materijal i Metode. Nakon toga, jedro ćelija je obojeno pomoću propidijum jodida, nakon čega je
analiziran morfološki izgled A) Vijabilnih PMF i B) apoptotičnih PMF.
Morfološkom metodom je pokazano da je od ukupno analiziranih 217 uzoraka procenat
apoptoze iznosio 12.7% ± 10.1 (opseg 0-65).
S obzirom da najbolju korelaciju očekujemo između ukupnog broja vaginalnih
polimorfonukleara na osnovu QPMN-A i procenta apoptoze ovih ćelija ove rezultate ćemo
detaljnije prikazati. U statističkoj analizi korišćen je Spermanov koeficijent korelacije i kako je
to prikazano u Grafikonu uočava se statistički značajna negativna korelacija (r= -0.493;
p<0.001) između broja PMN određivanog QPMN-A i procenta apoptoze PMN.
190
% apoptoze PMN (log10)
2.0
1.5
1.0
0.5
-1
1
2
3
4
-0.5
ukupan broj PMN (log10)
Grafikon 3.35: Korelacija između ukupnog broja vaginalnih polimorfonukleara (PMN) i procenta apoptoze
ovih ćelija. Netransformisani podaci su korelirani pomoću Spearman-ovog testa, a na grafiku su
predstavljeni u logaritamskim odnosima (log10) radi jasnijeg uočavanja fenomena.
Još izraženija negativna korelacija je dobijena kada je upoređivan ukupan broj vijabilnih
vaginalnih polimorfonukleara sa stepenom apoptoze ovih ćelija (r=-0.5378, p<0.001) (Grafikon
3.36).
3
2
2.
0
1.
5
0.
5
1.
0
1
-0
.5
%apoptoze (log10)
4
-1
broj vijabilnih PMN (log10)
Grafikon 3.36: Korelacija između broja vijabilnih vaginalnih polimorfonukleara (PMN) i procenta
apoptoze ovih ćelija. Netransformisani podaci su korelirani pomoću Spearman-ovog testa, a na grafiku su
predstavljeni u logaritamskim odnosima (log10) radi jasnijeg uočavanja fenomena.
191
U Tabeli 3.8 su zbirno prikazani rezultati koji se odnose i na drugu kvantitativnu metodu
(QPMN-B) kao i za tri semikvantitativne metode na različitim mikroskopskim uvećanjima.
Iz tabele se jasno vidi da je naša pretpostavka potvrđena i da su najbolji rezultati dobijeni za
QPMN-A. Međutim, ono što nam se čini značajnim jeste podatak koji se odnosi na broj PMN
i druge metode određivanja PMN koje smo koristili u ovom ispitivanju. Tako druga
kvantitativna metoda QPMN-B nije pokazala statističku značajnost (p=155) u odnosu na stepen
apoptoze vaginalnih PMN. Rezultati dobijeni za tri semikvantitativne metode na različitim
mikroskopskim uvećanjima samo potvrđuju našu pretpostavku pregledom veće površine
mikroskopskog preparata (manje uvećanje) preciznije procenjujemo broj PMN. Tako na
uvećanju x1000 nije nađena značajnost (p>0,05) između broja PMN i stepena apoptoze, na
uvećanju x 400 nađena je statistička značajnost (p=0,033) ali slabija u odnosu na onu koja je
nađena na uvećanju X200 (p=0,001). Na osnovu ovih rezultata mogli bi smo zaključiti da
mikroskopsko određivanje broja PMN na uvećanju X100 predstavlja bolju i precizniju metodu
u određivanju broja PMN u odnosu na QPMN-B, i semikvantitativne metode na uvećanjima
x200 i X400 ukoliko u konkretnom slučaju QPMN-A i procenat apoptoze shvatimo kao „zlatni
standard“ .
Odnos broja PMN i stepena apoptoze vaginalnih PMN ispitivali smo i primenom još
dva statistička testa ANOVE i t-testa. Primenom ANOVA i Tamhaneov post hoc test pokazali
su da postoji statistički značajna
razlika (p<0,05) između stepena apoptoze i
semikvantitativnog određivanja broja PMN uveličanju x200, x400 i x1000, a Tamhaneov post
hoc analizom utvrđeno je da za stepen apoptoze postoji značajna razlika između grupe PMN0 i
Slika 3.27: Procenat apoptoze u odnosu na broj PMN na uvećanju x200
192
PMN2 (uveličanja x200 i x1000) i PMN0 i PMN3 (uveličanje x400) (p<0,05). Trudnice sa
manjim brojem PMN imale su veći procenat apoptoze.
Kao što je prethodno objašnjeno, trudnice iz grupa PMN0 i PMN1 su trudnice sa
normalnim brojem PMN (grupa PMN0+PMN1), dok su trudnice PMN2 i PMN3 s patološkim
brojem PMN (grupa PMN2+PMN3). Ovakvom podelom trudnica u dve grupe (zdrave/bolesne)
na osnovu semikvantitativnog nalaz na različitim mikroskopskim uvećanjima ispitivali smo da
li postoji statistički značajna razlika u odnosu na stepen apoptoze i kvantitativno određivanje
broja PMN (t–test, Levantovo test). Pregledom mikroskopskog preparata na uvećanju X1000
i X400 nađena je statistička značajnost samo u odnosu na QPMN-B (p=0,005), ali ne i za
QPMN-Q i stepen apoptoze vaginalnih PMN. Određivanje broja PMN na uvećanju X200 dalo
je statističku značajnost u odnosu na procenata apoptoze (p=0,005), QPMN-A (p=0,036) i
QPMN-B (p=0,001). Ovi rezultati su još jedna indirektna potvrda da određivanje broja PMN
na uvećanju x200 daje mnogo bolje rezultate u odnosu na uvećanja X400 i X1000. I ovim
statističkim postupkom pokazano je da su pacijentkinje sa manjim brojem PMN (zdrave) imale
su veći stepen apoptoze (13,78±10,86) u odnosu na pacijentkinje sa patološkim brojem PMN
(10,02±7,95). Tri različita statistika postupka potvrdila su da su pacijentkinje sa većim brojem
PMN imale manji procenat apoptoze što je u skladu sa poznatim činjenicama da u uslovima
infekcije/zapaljenja dolazi ne samo do povećanja broja PMN nego i produženja njihovog
životnog veka. Ipak ne smemo zaboraviti da su u ovakvoj statističkoj analizi podataka PMN
posmatrani kao izdvojen parametar, a ukoliko pogledamo kako su oni bili distribuirani po
različitim grupama onda možemo videti da smo patološki i normalan broj PMN nalazili u svakoj
od 6 pomenutih „pozadina“ (NF, NM, NN, BVF, BVM, BVN). U prethodnoj diskusiji kako se
uvođenjem samo jednog konfauding faktora kao što je CA ti odnosi bitno menjaju, a i pokazali
smo kako modifikacija sa CA NP-6G može značajno uticati na nalaze. takođe smo ukazali i na
mogući značaj i uticaj drugih ometajućih faktora u ovom ispitivanju (KOKE, LEPTO, BIFIDO)
koje ne samo mogu uticati na broj PMN nego i na njihov vek. Poznato je da na apoptozu mogu
da utiču mnogobrojni faktori, od kojih svakako i sami patogeni, a i komnsali, igraju značajnu
ulogu. Zato je odgovor na pitanje šta je uzrok povećanom broju PMN i smanjenom procentu
apoptoze uvek dubiozan. Tako je veoma teško reći da li su na ovakvu povezanost (veći broj
PMN → smanjena apoptoza PMN) uticale trudnice sa povećanim brojem PMN i normalinim
nalazom vaginalne flore (leukoreja) ili one sa povećanim brojem PMN i patološkim nalazom
vaginalne flore (BV, BV+CA), i da li su i koliki uticaj imali KOKE, LEPTO i BIFIDO forme.
Kao što smo rekli mi u našem ispitivanju PMN ipak posmatramo kao posledični sekundarni
događaj zbog čega smo i diskusiju ovoga rada počeli sa poremećajima vaginalne flore i raznim
193
ometajućim faktorima koji bi u manjoj ili većoj meri trebali da budu uzrok povećanom,
patološkom broju PMN. U prethodnoj diskusiji ukazali smo na postojanje najmanje tri biološke
mreže (mikrobne, citokinske i apoptotske) koje nikako ne smeju biti zaboravljene kada se
analiziraju i rezultati koji se odnose na broj PMN i vijabilnost i apoptozu PMN. Zbog toga ćemo
pre detaljnije diskusije u kojoj ćemo pokušati da dovedemo u vezu pojedine faktore iz svake od
ove tri mreže prikazati rezultate koji se odnose na eventualnu povezanost vijabilnosti i apoptozu
vaginalnih PMN sa različitim stanjima vaginalne flore, kao i rezultatima dobijenim na osnovu
različitih podela.
Primenom Kruskal–Wallis testa i post hoc analize (Mann–Whitney U test; Tabela 2, Prilog 2)
utvrđeno je da u podeli po Ison/Hayu postoji statistički značajna razlika između grupe
Normalan i grupe Čist nalaz (p=0,013), grupe Intermed i grupe Čist nalaz (p=0,019) i grupe
Čist nalaz i grupe Koke (p=0,006) u odnosu na procenat apoptoze. Kod podele po Claeysu post
hoc analizom (Mann–Whitney U test; Tabela 3, Prilog 2) utvrđeno je da postoji statistički
značajna razlika između grupe Normalan i grupe Čist nalaz (p=0,013), grupe Intermed i grupe
Čist nalaz (p=0,019) i grupe Čist nalaz i grupe Koke (p=0,006) u odnosu na procenat apoptoze.
Takva značajnost nije nađena kod podela na osnovu Nugentovih kriterijuma, kao ni kod NP6G ili NP-3G, ali je nađena na osnovu NP-2G (Grafikoni 3.37 i 3.38) čime smo još jednom
ukazali na da različiti dijagnostički kriterijumi mogu da bitno utiču na dobijene rezultate.
194
Grafikon 3.37: Poređenje ukupnog broja polimorfonukleara (PMN) u uzorcima vaginalnih ispiraka između
grupa formiranih prema citološko-mikrobiološkim parametrima po A) Nungentu, B) NP-2G, C) NP-3G i D) NP6G. Brojevi ćelija su prikazani na Y logaritamskoj skali (log10). Rezultati su predstavljeni kao medijane unutar
kutija koje sadrže 95% podataka, sa minimalnim i maximalnim vrednostima (greške). U analizi je korišćen
Kruskal Willis-ov test sa Dunnet- posttestom (A, C i D) ili Mann-Withney test (B).
195
Grafikon 3.38: Poređenje procenta apoptotičnih polimorfonukleara (PMN) u uzorcima vaginalnih ispiraka
između citološko-mikrobioloških grupa formiranih po A) Nungentu, B) NP-2G, C)NP-3G i D) NP-6G. Brojevi
ćelija su prikazani na Y linearnoj skali. Rezultati su predstavljeni kao medijane unutar kutija koje sadrže
95% podataka, sa minimalnim i maximalnim vrednostima (greške). U analizi je korišćen Kruskal Willis-ov
test sa Dunnet- posttestom (A, C i D) ili Mann-Withney test (B). p<0.05
Primenom drugog statističkog testa (ANOVA i post hoc Tamhane) značajnost u odnosu
na procenat apoptoze nađena je samo u jednoj grupi pacijentkinja, odnosno samo u podeli u
kojoj su pacijentkinje sa BIFIDO formama bile izdvojene u posebnu grupu (BIFIDO), gde je
procenat apoptoze u grupi BIFIDO bio značajno niži ( p<0,001) u odnosu na pacijentkinje sa
normalnim nalazom i BV, a ta statistička značajnost nije postojala između grupe sa normalnim
nalazom i BV (Tabela 3.11 i 3.12 i Grafikoni 3.39 i 3.40).
196
Tabela 3.11: Srednje vrednosti procenta apoptoze na osnovu NP-3G u grupi pacijentkinja sa BIFIDO
formama
95% interval
poverenja
Srednja
Standardna
Standardna
%APO
n
vrednost
devijacija
greška
Donja
Gornja
granica
granica
161
12,70
10,39
0,82
11,08
14,31
NOR
BV
33
15,74
10,26
1,78
12,10
19,38
BIFIDO
23
7,30
5,60
1,17
4,88
9,72
Ukupno
217
12,59
10,16
0,70
11,23
13,95
Tabela 3.12: Statistička obrada podataka (ANOVA, post hoc Tamhaneov test)
Standardna
greška
p
BV
-3,05
1,96
0,336
BIF
5.40
1,43
0,001
1,86
NOR
3,05
1,96
0,336
-1,82
7,91
BIF
8.44*
2,13
0,001
3,17
13,71
NOR
-5.40
1,43
0,001
-8,93
-1,86
BV
-8.44
2,13
0,001
-13,71
-3,17
Procenat Apoptoze
NOR
BV
BIF
95% interval
poverenja
Donja
Gornja
granica
granica
-7,91
1,82
Razlika
srednjih
vrednosti
8,93
Ovi rezultati objašnjavaju zašto insistiramo na značaju dijagnostičkih kriterijuma i drugih
bakterijskih morfotipova, ili kako smo ih nazvali u našem ispitivanju ometajućih faktora, u
proceni stanja vaginalne flore i povezanosti sa drugim parametrima. Ako se prisetimo da
pacijentkinje sa BIFIDO ne „prepoznaju“ ni dijagnostički kriterijumi po Amselu ni
dijagnostički kriterijumi po Nugentu, i ako znamo da su ovi kriterijumi kao klinički ili
istraživački zlatni standard ugrađeni u metodologiju preko 99% dosadašnjih ispitivanja, onda
je jasno koliko bi se rezultati budućih ispitivanja mogli razlikovati uvođenjem samo jednog
ometajućeg faktora. Ili, s obzirom na morfološke, ili bolje rečeno mikroskopske karakteristike
BIFIDO formi i činjenicu da su one i u našem ispitivanju na osnovu mikroskopskog pregleda
nativnog preparat na uvećanju x400 tumačene kao štapićaste forme (laktobacili) i svrstavane u
grupu zdravih, mi bi smo zaključili da nismo našli statistički značajnu povezanost između
pacijentkinja sa BV i normalnim nalazom i procenta apoptoze vaginalnih PMN. Isti zaključak
doneli bi i na osnovu podele po Nugentu koja takođe ne uključuje ovaj bakterijski morfotip i
197
koji je u najvećem broju ispitivanja protumačen kao neki soj laktobacila (gram pozitivne
štapićaste forme.
Grafikon 3.39: Distribucija srednjih vrednosti % Apoptoze u odnosu na Nugent, Ison/Hay, Claeys i NP-6G
Grafikon 3.40: Distribucija srednjih vrednosti % Apoptoze u odnosu na NP-3G i BIFIDO
198
Grafikon 3.41: ROC kriva za % apoptoze, QPMN-B i pH
Analizom ROC krive (prvih 217 pacijentkinja) ispitivali smo senzitivnost i specifičnost
različitih parametara u odnosu na mikroskopski dijagnostikovano stanje vaginalne flore pa tako
i procenta apoptoze. Analiza ROC krive rađena je na osnovu NP-6G, tako da površinu iznad
referentne linije predstavljaju pacijentkinje sa BV (VBF+BVM+BVN), a površina ispod
referentne linije pacijentkinje sa normalnim nalazom (NF+NM+NN). Metod određivanja
procenata apoptoze ima senzitivnost 82,4%, a specifičnost 38,5% za graničnu vrednost 6,66,
dok je za graničnu vrednost 11,4 senzitivnost 58,8%, a specifičnost 61,6% (za izračunavanje
ovih vrednosti korišćen je P/N ratio).
Tabela 3.13: ROC kriva - tabelarni prikaz parametara koji su dali statističku značajnost p<0.05
Test
95% granica
Površina
Nivo
Standardna
pouzdanosti
CI
ispod
značajnosti
greška
Minimum Maksimum
krive
(p)
%Apoptoze
0,627
0,051
0,020
0,527
0,727
qPMN-B
0,608
0,053
0,049
0,504
0,711
pH
0,945
0,017
0,000
0,912
0,979
Dakle na osnovu rezultata ROC krive možemo zaključiti da su pacijentkinje sa BV imale
povećan procenat apoptoze, odnosno da bi povećan procenat apoptoze mogao ukazivati na BV.
Međutim, poznato je da je jedna od osnovnih karakteristika BV odsustvo PMN, zbog čega je
199
ova polimikrobna infekcija i dobila ime vaginoza, a ne vaginitis. U prethodnoj diskusiji smo
pokazali da pacijentkinje sa manjim brojem PMN imaju povećan procenat apoptoze tako da bi
se i ovo uklapalo u nalaze koje smo dobili. Činjenicu da je gotovo polovina naših pacijentkinja
sa BV imala povećan patološki broj PMN i infekciju, koinfekciju ili kolonizaciju CA mogli bi
smo iskoristiti kao razlog za malu površinu ispod ROC krive za procenat apoptoze. Međutim,
brojne studije su pokazale da različite bakterije, a posebno anaerobi, produkuju velike količine
MKKL. Kako BV karakteriše enorman porast različitih anaerobnih bakterija ova polimikrobna
infekcija često se navodi kao primer infekcije u kojoj su koncentracije MKKL značajno veće u
odnosu na zdravu populaciju [237, 432]. Poznato je da ove kiseline utiču na veliki broj imunskih
procesa, ali uopšteno bi mogli reći da deluju antiinflamatorno. U najvećem broju slučajeva oni
svoje antinflamatorne efekte ostvaruju tako što dovode do supresije NF-κB signala i tako
smanjuju proizvodnju proinflamatornih citokina. To ima negativne učinke na migraciju i
fagocitozu PMN i istovremeno olakšava njihovu apoptozu [433-435]. MKKL imaju i snažan
uticaj na mnoge funkcije PMN, a posebno hemotaksu i fagocitozu. Veruje se da su povećane
koncentracije MKKL jedan od najvažnijih faktora (inhibicija hemotakse) zbog kojih
pacijentkinje sa BV nemaju povećan broj PMN. Ovim mehanizmom bakterije izbegavaju rani
kontakt sa PMN, i ako ovakva inhibicija traje dovoljno dugo, dolazi do uslova za rast i
razmnožavanje velikog broja anaeroba (BVAB) i nastanaka masivne polimikrobne infekcije
kakva je BV. Takođe je pokazano da MKKL indukuju apoptozu različitih ćelija uključujući
PMN [433-438]. Na osnovu ovoga mogli bismo da očekujemo da pacijentkinje sa BV imaju
povećan indeks apoptoze i da je to uzrokovano, između ostalog, povećanim koncentracijama
MKKL, što su potvrdili rezultati našeg ispitivanja (ROC kriva za apoptozu). S druge strane,
pacijentkinje sa predominacijom laktobacilarne flore imaju niske koncentracije ovih kiselina
što bi značilo da je u takvim uslovim indeks apoptoze manji. Međutim, drugi autori su pokazali
da laktobacili imaju proapoptogeni efekat, odnosno da dovode do povećane apoptoze PMN
[439]. Kako BV predstavlja stanje u kome je broj laktobacila drastično smanjen, to bi generalno
trebalo da ima suprotan efekat na apoptozu PMN od onoga koje imaju povećane koncentracije
MKKL. Tako bi stepen apoptoze kod pacijentkinja sa BV bio zavisan od snage i trajanja
proapoptogenih uticaja zbog povećanih koncentracija MKKL i antiapoptogenih uticaja zbog
nedostatka laktobacila. Takođe, kod pacijentkinja sa BV dolazi do povećanog oslobađanja
različitih bakterijskih produkata (LPS) i povećanih koncentracija zapaljenjskih citokina što
takođe dovodi do produženja životnog veka PMN. Međutim, u ovom ispitivanju nisu nađene
nikakve direktne korelacije između procenta apoptoze i 13 ispitivanih citokina. Takođe, za
nijedan od ovih citokina nije utvrđena statistički značajna povezanost sa brojem PMN. Pri tome
200
ne treba naravno zaboraviti da svaki od mikroorganizama može imati “svoje” (različite) efekte
na apoptozu PMN.
Studiju koja najbolje govori o ovim dilemama, a koja je uporediva sa rezultatima koje
smo mi dobili objavili su Beghini i sar [440]. U ovu studiju uključeno je 48 pacijentkinja sa
normalnim nalazom, 40 sa CA, 32 sa BV i 12 pacijentkinja sa BV+CA. Dijagnoza BV
postavljana je na osnovu Amselovih i Nugentovih dijagnostičkih kriterijuma, a detekcija CA
na osnovu mikroskopskog pregleda i/ili izolacije CA kulturom na Sabouraudovoj podlozi. Cilj
studije je bio da se uporedi ekspresija CD16 na vaginalnim PMN zdravih pacijentkinja i
pacijentkinja sa vaginalnim infekcijama, pri čemu je ekspresija CD16 istovremeno bila i marker
apoptoze. Dransfield i sar. su još 1994. pokazali da je apoptoza neutrofila udružena sa
smanjenom ekspresijom CD16, što su kasnije potvrdili i drugi autori [441-443]. Beghini i sar
[440] su pokazali da pacijentkinje sa infekcijom CA imaju značajno veći broj PMN u odnosu
na druge grupe pacijentkinja, kao i u našem ispitivanju gde je od 239 pacijentkinja sa CA njih
187 (78,2%; 122+65) imalo patološki broj PMN, dok su 52 (21,8%; 35+17) pacijentkinje sa
CA imale normalan broj PMN. Isti autori su pokazali da je ekspresija CD16 na vaginalnim
PMN pacijentkinja sa BV i CA značajno veća u odnosu na zdrave, kao i da su pacijentkinje sa
BV imale značajno veću ekspresiju CD16 u odnosu na pacijentkinje sa CA. Pacijentkinje sa
BV+CA imale su značajno veću ekspresiju u odnosu na normalne i pacijentkinje sa CA. Mada
u ovom ispitivanju nismo dobili statističku značajnost, prikazaćemo grafikon naše podele NP2G/CA iz koga se vidi da rezultati koje bi dobili ne bi bili u saglasnosti sa analiziranom studijom
i pacijentkinje kod kojih smo mikroskopom semikvantitativno detektovali CA imale su
najmanje srednje vrednosti, a one sa BV najveće srednje vrednosti procenta apoptoze.
Pojačana ekspresija CD16, u skladu sa prethodno navedenim, može se između ostalog objasniti
pojačanom aktivnošću i smanjenom apoptozom PMN kod ovih pacijentkinja [440]. Dakle
pacijentkinje sa normalnom vaginalnom florom i velikim brojem laktobacila imaju smanjenu
ekspresiju CD16, odnosno u takvim slučajevima smanjuje se aktivnost PMN i njihov životni
vek. S druge strane, odsustvo laktobacila, veliki broj anaerobnih bakterija i/ili infekcija
C.albicans dovešće do povećane ekspresije CD16, odnosno inhibicije apoptoze.
201
Grafikon 3.42: Srednja vrednost procenta apoptoze kod pacijentkinja sa normalnim nalazom, BV i CA
Mogli bi zaključiti da je procenat apoptoze najmanji (najveća ekspresija CD 16) kod
pacijentkinja sa BV i da BV ima na neki način najveći uticaj na odlaganje apoptoze. Mi nismo
našli direktnu povezanost između vijabilnosti PMN i BV, ali rezultati ROC analize pokazali su
da je procenat apoptoze pokazao značajno veću vrednost u »prepoznavanju« patoloških
zbivanja u vaginalnoj flori. Ako pri tom pogledamo kakve je rezultate dao pH vagine (ROC
kriva) čije su povećane vrednosti svakako jedan od najznačajnijih prediktora BV, onda rezultati
našeg ispitivanja pokazuju da vaginalni PMN kod pacijentkinje sa BV imaju kraći životni vek,
odnosno da je u takvim uslovima povećana apoptoza vaginalnih PMN. Tako su rezultati našeg
ispitivanja suprotni rezultatima Beghinija i sar. [440], koji »braneći« svoje rezultate smatraju
da u kod pacijentkinja sa BV proapoptotični signali MKKL bivaju prevladani antiapoptotičnim
signalima okruženja koje nastaje kod pacijentkinja sa BV. Naš zaključak koji se zasniva na
rezultatima ROC analize ukazuju da pacijentkinje sa BV imaju povećanu apoptozu vaginalnih
PMN i da je to posledica oslobađanja velikih količina MKKL kod pacijentkinja sa BV. Ovi
rezultati ukazuju da je krajnja vrednost koji izrazimo kao procenta apoptoze ili ekspresiju CD16
u stvari rezultat odnosa velikog broja proapoptotičnih i antiapoptotičnih signala koji stižu iz
mikrobne, citokinske i apoptotske mreže. I u pomenutom ispitivanju autori analiziraju grupe
pacijentkinja koje se nalaze i u našoj metodologiji, ali bez ometajućih faktora koje bi kako smo
to pokazali za BIFIDO forme mogle da imaju značajan uticaj na dobijene rezultate.
Prethodno smo pomenuli značaj proinflamatornih citokina i njihov mogući uticaj na
produžetak životnog veka PMN ali u ovom ispitivanju nismo mogli da potvrdimo takve nalaze.
Ovo je razumljivo ako se podsetimo podataka da su pacijentkinje sa BV na osnovu rezultata
ROC krive imale povišen stepen apoptoze, a opet u toj istoj grupi pacijentkinja nađene su i
202
povišene koncentracije proinflamatornog citokina IL-1β i IL-6 (vidi kasnije) koji bi dakle
trebali da dovedu do odlaganja apoptoze i produže životni vek PMN, što je samo još jedna
potvrda da veliki broj međusobno zavisnih i isprepletanih faktora određuje da li će apoptoza
biti odložena ili ubrzana. Međutim kao što smo objasnili verovatno je i u ovom slučaju
proapoptogeni efekat MKKL jači od efekata citokina, te kao krajnji rezultat imamo produžen
životni vek PMN. da to svakako nije jedini razlog pokazaće i rezultati koje ćemo detaljno
diskutovati kasnije, a ovde ćemo samo napomenuti da su pacijentkinje iz grupe BVF imale
gotovo identične srednje koncentracije IL-6 kao i pacijentkinje iz grupe BVN, što ukazuje da
broj bakterija nije odlučujući za koncentracije citokina, a indirektno bi mogli zaključiti ni za
vek PMN. Kao što smo rekli koncentracijama citokina u odnosu na stanje vaginalne flore
bavićemo se u posebnom delu diskusije, ali ovde ćemo izdvojiti jedan interesantan nalaz s
obzirom da se on odnosi na grupu pacijentkinja sa BIFIDO formama za koje smo već pokazali
da su imale značajno niži procenat apoptoze u odnosu na pacijentkinje sa normalnim nalazom
i BV. Tako su na osnovu NP-6G u kojoj su pacijentkinje sa BIFIDO formama izdvojene u
posebnu grupu nađene značajno niže (p˂0,05) koncentracije IL-10 kod pacijentkinja sa BIFIDO
formama i BV u odnosu na one sa normalnim nalazom (ANOVA, post hoc Tamhaneov test).
napomenućemo takođe da statistička značajnost za IL-10 nije nađena ni za jednu grupu
pacijentkinja na osnovu različitih dijagnostičkih kriterijuma, kao ni korišćenjem različitih
statističkih postupaka.
Tabela 3.14: Srednje vrednosti
IL-10
n
koncentracije IL-10 u grupi BIFIDO
Srednja
vrednost
Standardna
devijacija
Standardna
greška
95% interval
poverenja
NOR
446
1808,86
13121,03
621,30
Donja
granica
587,82
Gornja
granica
3029,91
BV
153
22,88
71,94
5,82
11,39
34,37
BIF
44
27,94
84,01
12,66
2,40
53,48
Ukupno
643
1262,03
10955,036
432,02
413,68
2110,38
203
Tabela 3.15: Statistička
obrada podataka (ANOVA, post hoc Tamhaneov test)
IL-10
NOR
BV
BIF
BV
Razlika
srednjih
vrednosti
Standardna
greška
p
1785.98
621,33
0,013
95% interval
poverenja
Donja
Gornja
granica
granica
296,81
3275,15
BIF
1780.93
621,43
0,013
291,52
3270,33
NOR
-1785.98
621,33
0,013
-3275,15
-296,81
BIF
-5,06
13,94
0,978
-39,25
29,14
NOR
-1780.93*
621,43
0,013
-3270,33
-291,52
BV
5,06
13,94
0,978
-29,14
39,25
Iako se smatra da IL-10 nema značajniji direktan uticaj na apoptozu, ovako niske
vrednosti ovog potentnog antiinflamatornog citokina smatramo interesantnim, jer bi one
suštinski mogle da doprinesu povećanom preživljavanju PMN. Podaci o procentu apoptoze koji
su dobijeni kod pacijentkinja sa BIFIDO formama, naročito ako ih sagledamo uz podatak da je
ova grupa trudnica jedina pokazala skoro 10 X veći rizik od PP, mogli bi biti od velikog značaja
u budućim ispitivanjima. Na osnovu rezultata našeg ispitivanja mogli bi smo zaključiti da
pacijentkinje sa povećanim procentom apoptoze i smanjenim preživljavanjem PMN imaju
verovatno ili normalan nalaz ili BV, a jednostavan test sa pH pomogao bi nam da sa
verovatnoćom preko 90% izdiferenciramo ova dva stanja. Rizičan nalaz bio bi onaj kod koga
pacijentkinje imaju povišene vrednosti pH i povećano preživljavanje vaginalnih PMN
(smanjena apoptoza), a mikroskopski nalaz ne ukazuje na BV, nego više »liči na normalan«.
Ovakav nalaz ukazivao bi na prisustvo inflamacije i kao takav mogao bi da bude bolji prediktor
stepena zapaljenja, što bi bilo značajnije u predviđanju PP za koji smo rekli da je prvenstveno
zapaljenjski događaj. Da je to tako pokazali su rezultati našeg ispitivanja u kome su
pacijentkinje iz grupe BIFIDO imale 9,7 puta veći rizik od PP u odnosu na pacijentkinje sa BV
i normalnim nalazom, a kao što smo rekli procenata apoptoze i koncentracije antiinflamatornog
citokina IL-10 bile su značajno niže kod pacijentkinja sa BIFIDO formama u odnosu na
pacijentkinje sa normalnim nalazom i BV. Iz ovoga možemo zaključiti da bi vijabilnost PMN
mogla da bude vrlo dobar prediktor PP, posebno ukoliko se u takvim analizama ima na umu
činjenica da je apoptoza veća a vijabilnost PMN kraća kod pacijentkinja sa BV, što bi moglo
da utiče na procenu vrednosti ovog parametra u predikciji PP.
204
3.4
UKUPNA PROCENA STANJA MIKROFLORE VAGINE
Na kraju analize rezultata koji se odnose na pregled mikroskopskog preparata različitim
dijagnostičkim procedurama, određivanja broja PMN i značaja mogućih ometajućih činilaca,
još jednom želimo da ukažemo na značaj dijagnostičkih kriterijuma, teškoće u razlikovanju
normalnog i patološkog, kao i raznovrsnost vaginalne flore, jer mislimo da je to neophodno da
bi se na pravi način sagledali drugi rezultati dobijeni u ovom ispitivanju.
Osnovni i najvažniji problem koji stoji na putu da preciznije definišemo
etiopatogenetska zbivanja vezana za infekciju i/ili inflamaciju i PP, jeste činjenica da još uvek
nemamo preciznu definiciju normalne vaginalne flore, ili bolje rečeno nemamo jasnu granicu
između normalnog i patološkog. Odgovor na ovo pitanje nemamo na kliničkom,
mikrobiološkom, a ni na molekularnom nivou. Postojeći dijagnostički kriterijumi razlikuju
suštinski samo 5 vaginalnih infekcija: BV, kandidioza, trihomonoza, postmenopauzalni
vaginitis i deskvamativni inflamatorni vaginitis, od kojih je jedan pre fiziološko stanje nego
infekcija, a drugi veoma redak, tako da ostaje samo “velika trojka” (BV,CA,TV). Sve dok ne
budemo znali koje trudnice i kako trebamo lečiti teško je očekivati bolje rezultate. Rezultati
našeg ispitivanja ukazuju da na osnovu postojećih dijagnostičkih procedura kod najmanje 1030% pacijentkinja ne znamo pravu dijagnozu, niti imamo odgovor na pitanje da li i kako lečiti
ove pacijentkinje. S obzirom na dobijene rezultate mislimo da buduće studije treba da
preispitaju vrednost postojećih dijagnostičkih kriterijuma, i da zajedničkim naporom kliničara,
mikrobiologa i molekularnih biologa, možda budu uspostavljeni novi kriterijumi koji bi na bolji
način odražavali kompleksnost mikrobne zajednice vagine i ukazali na postojanje nekih drugih
stanja, koja nisu BV, a koji bi mogli značajno uticati na reproduktivno zdravlje žena.
Najbrojnija i najrazličitija zajednica na našoj planeti su mikrobi. Za razliku od
makroskopskih organizama čiji su ekološke preferencije i međusobni odnosi u kvalitativnom i
kvantitativnom smislu prilično dobro definisani, takve relacije su gotovo potpuno nepoznate i
u prilično jednostavnim mikrobnim zajednicama. Mikrobiom vagine čini oko 300 do 400
različitih vrsta bakterija, što se u odnosu na druge mikrorekološke zajednice definiše kao
zajednica sa malim diverzitetom. Kao i u svakom drugom ekološkom sistemu članovi formiraju
komplikovanu mrežu međusobnih odnosa, u kojoj se svaki od članova bori za opstanak i
najbolje uslove za svoju vrstu. U ovakvoj ekološkoj zajednici domaćin primarno pokušava da
obezbedi uslove (temperatura, voda, hrana, kiseonik, pH itd.) za “dobre stanare” (laktobacili)
od kojih ima koristi, odnosno koji će ga štititi od potencijalnih neprijatelja. Ova „domaća“ flora
je proizvod koevolucionog odnosa domaćina i različitih mikroorganizama, i kao takva
predstavlja važan deo imunskog sistema domaćina u odbrani od patogena. Za razliku od nekih
205
drugih, u vaginalnom mikrobiomu nije identifikovana bakterijska zajednica koja bi bila na neki
način stalna i nepromenljiva bez obzira na različite uticaje (engl. core microbiom). Danas se
može kultivisati manje od 1% svih mikroorganizama, a taj procenat nije značajno veći ni za
mikrobiom vagine (3-5%). Dakle, za preko 95% bakterija koje se nalaze u vagini ne znamo
kakve uslove sredine zahtevaju, čime i kako se hrane, koliku količinu kiseonika zahtevaju, da
li su sposobni za anaerobnu glikolizu i produkciju mlečne kiseline, koje metaboličke produkte
oslobađaju, kakav imunski odgovor izazivaju, ili kako na njih utiču druge bakterijske vrste.
Pošto su ekološki faktori raznovrsni i promenljivi, jedna organska vrsta ne može biti na sve njih
istovremeno prilagođena. U kolikoj meri se vrsta prilagođava uslovima sredine, zavisi od njene
ekološke valence. Ekološka valenca predstavlja širinu kolebanja pojedinih ekoloških faktora u
čijim je granicama moguć opstanak neke vrste, i prema tome se razlikuju dve vrste organizama:
eurivalentni i stenovalentni. Eurivalentni (gr. eurys = širok) su organizmi sa širokom ekološkom
valencom, I stenovalentni (gr. stenos = uzak) sa uskom ekološkom valencom. Eurivalentni
organizmi poseduju široke mogućnosti prilagođavanja što im omogućava opstanak u vrlo
različitim sredinama. U našem ispitivanju CA je nađena u svim grupama NP-6G, a od 218
pacijentkinja za koje smo znali vrednost pH, kod oko jedne trećine (n=69) sa vrednostima pH
preko 4,5 i srednjom vrednost pH 5,4 mikroskopskim pregledom nađene su spore i/ili hife
gljivica, tako da bi smo CA mogli svrstati u eurivalentne mikroorganizme. Rezultati
mikrobioloških studija ukazuju da i L. iners pripada ovoj grupi mikroorganizama, jer je
detektovan u svim poznatim tipovima vaginalne flore. Nasuprot njima su više ili manje
specijalizovani stenovalentni organizmi, kojima bi u našem ispitivanju pripadali laktobacili
(posebno L. Crispatus) kojih nema kod pacijentkinja sa BV i povišenim pH.
Kod svake ekološke valence razlikuju se tri vrednosti: optimum, maksimum i minimum.
Ekološki optimum predstavlja onu vrednost faktora u okviru ekološke valence pri kojoj se
životni procesi neke vrste najbolje odvijaju. Gornja i donja granica neke ekološke valence su
njen maksimum i minimum. Van tih granica fiziološki procesi se prekidaju i nastupa smrt. U
spoljašnjoj sredini, gde se ekološki faktori uzajamno uslovljavaju; nijedan pojedinačni faktor
ne postiže svoje optimalno dejstvo nezavisno od ostalih faktora. Najčešća situacija u prirodi je
veće ili manje odstupanje od optimalnih uslova života. Što je odstupanje veće, to su uslovi za
opstanak neke vrste manje povoljni. Samo jedan jedini ekološki faktor, čije se dejstvo približava
maksimumu ili minimumu (npr. pH), može da onemogući opstanak nekog organizma na
određenom mestu. Ekološki faktor tada postaje ograničavajući, zbog čega ekolozi
mikroorganizme koji uspevaju da rastu u laboratorijskim uslovima simbolično nazivaju
“korovom” mikroorganizama, ukazujući tako na njihovu sposobnost da prežive u najrazličitijim
206
uslovima. Iz napred navedenog nije teško zaključiti da mikroorganizmi koji izrastu u
Petrijevom tanjiru (na primer posle uzimanja cervikalnog i/ili vaginalnog brisa i zasejavanja)
nisu porasli u kulturi zato što su najbrojniji (kako se često u kliničkoj praksi tumači nalaz
kulture), niti ih možemo smatrati uzročnicima eventualnih kliničkih simptoma pacijentkinje,
nego se u najvećem broju slučajeva radi o eurivalentnim mikroorganizmima. Zbog toga svaku
mikrobiološku zajednicu, a tako i vaginalnu ili intraamnionsku floru, moramo posmatrati kao
kompleksnu, međusobno zavisnu celinu koja se neprekidno menja u vremenu i prostoru. Na
njen sastav mogu uticati ishrana, stres, rasna pripadnost, seksualni odnosi, hormoni, trudnoća,
menstruacije, ispiranje, promena lekova, opšte zdravlje i još mnogo drugih faktora.
Naravno da su međusobne interakcije članova određene mikrobne zajednice veoma
važan faktor u krajnjoj determinaciji kvantitativnog i kvalitativnog stanja u takvoj zajednici. U
ovom trenutku mi sa velikom verovatnoćom možemo pretpostaviti da se u okviru ove
mikroekološke zajednice odigravaju procesi koji se odigravaju u drugim makroekološkim
sistemima. S obzirom da organizmi u prirodi retko žive izolovano, onda je logično pretpostaviti
da i u ovoj zajednici kao većini drugih vladaju različiti odnosi među njenim članovima. Najveći
broj bakterija u mikrobiomu vagine nastao je u dugom koevolucionom procesu domaćina i
mikroorganizama koji podrazumevaju odnose počev od mutualističkih i komensalnih, preko
amensalističkih, kompetitivnih, pa do parazitanih. U mutualističkom odnosu oba “učesnika”
povećavaju svoju adaptivnu vrednost zbog uzajamnog delovanja, oba imaju korist (+/+).
Komensalizam je odnos u kome komensali i domaćini žive u tesnoj vezi, pri čemu komensali
dobijaju korist (hranu, stan, vodu, skrovište) bez snižavanja adaptivne vrednosti domaćina;
(+/0). U amensalizamu jedna od članica u interakciji smanjuje svojom aktivnošću adaptivnu
vrednost druge članice, pri čemu od toga nema nikakvu korist niti štetu (0/-). Parazitizam je
zajednica u kojoj jedan član ima korist, a drugi štetu (+/-), a kompeticija gde oba člana imaju
štetu (-/-). Ovi makroekološki principi važe i za mikroekološku zajednicu vagine, ali su s
obzirom na broj, raznolikost (diverzitet) i mnoge druge nepoznanice, možemo reći da su ovi
odnosi u vaginalnom ekosistemu za sada gotovo potpuno nedefinisani [444]. Vaginalni
mikrobiom je odličan primer fino izbalansirane mutualističke zajednice. Iako smo rekli da u
vagini nema mikrobiološke zajednice koju bi mogli definisati kao core microbiom, ipak najveći
broj studija neminovno ukazuje da postoji zajednica “starosedilaca” od kojih su svakako
najvažniji različiti sojevi laktobacila koji promovišu zdravu vaginalnu sredinu i sprečavaju
kolonizaciju potencijalnih patogena. Takođe, s obzirom na dinamičnost promena u mikrobiomu
vagine potrebno je razumeti još neke ekološke termine kao što su rezilijencija, rezistencija i
perzistencija. Mikroorganizmi vagine i njen domaćin predstavljaju jedan kompleksan
207
prilagodljiv sistem, koji se dinamički i nepredvidivo menja u kvantitativnom i kvalitativnom
smislu, pod uticajem velikog broja faktora. Stabilnost mikrobiološke zajednice zavisi od njene
otpornosti i rezlijencije. Otpornost (rezistencija) podrazumeva da flora u dužem vremenskom
periodu (perzistentnost) suštinski bitnije ne menja uprkos različitim negativnim uticajima.
Rezilijentnost je sposobnost brzog oporavka i vraćanja u prvobitno stanje, odnosno sposobnost
ekosistema da se stalno menja i prilagođava, a ipak ostane u svojim stabilnim okvirima. Ekolozi
kažu da u prirodi ne postoje potpuno homogena staništa. Ovakav stav primenljiv je na različita
staništa (gastrointestinalni trakt, urogenitalni trakt, koža) unutar humanog organizma, i za
očekivati je da sa mikrobna zajednica razlikuje u različitim delovima ovih sistema. Ali, treba
uočiti da ove razlike postoje i unutar na izgled homogenih staništa, kao što je vagina. Tako, ako
samo uzmemo u obzir činjenicu da ćelije grlića materice produkuju veliki broj različitih
hemijskih supstanci, kao i činjenicu da se te supstance produkuju ciklično (mesečni ciklus),
onda je sigurno da uslovi u forniksu vagine nisu identični onima u vestibulumu vagine. Dakle,
sigurno je da će se njihove koncentracije (gradijent uslova ili dostupnih resursa) i njihovi
nutritivni ili imunski potencijali bitno razlikovati u pomenutim delovima vagine i različitim
fazama mesečnog ciklusa, što podrazumeva i diverzitet u sastavu mikrobiološke zajednice na
tim mestima, a svakako i u različitim vremenskim periodima. Sa istraživačkog (metodologija)
aspekta ovo bi značilo da se bris uzet iz forniksa vagine i vestibululma i/ili različitim fazama
ciklusa, mogu bitno razlikovati.
Naravno, svi ovi odnosi i sastav vaginalne flore ne bi nas toliko zanimali da najnovija
ispitivanja nisu jasno pokazala ogroman značaj koji mikroorganizmi imaju za naše zdravlje. I
danas za većinu ljudi bakterija je sinonim za bolesno, a sterilno (bez bakterija) za zdravo.
Međutim, najnovija ispitivanja pokazuju da su “preterana” higijena i nekontrolisana upotreba
antibiotika dva faktora koji značajno utiču na mikrobiom domaćina, i tako povećavaju rizik od
nastanka mnogih bolesti. Naseljavanje ljudskog organizma počinje prolaskom novorođenčeta
kroz vaginalni kanal, a novija ispitivanja pokazuju da deca porođena carskim rezom, baš zbog
neadekvatnog naseljavanja mikroflorom u kasnijem životu imaju veći rizik za nastanak
hroničnih bolesti, kao što je šećerna bolest. Dakle, mikrobna zajednica je od velikog značaja za
sazrevanje i razvoj imunskog sistema pojedinca, počinje već u toku porođaja i traje ceo život.
Jedan od ciljeva u projekta mikrobioma vagine je identifikacija, kako pojedinačnih
mikroorganizama, tako i određenih mikrobioloških zajednice, i utvrđivanje njihove uloge i
značaja u imunskom odgovoru domaćina. Ovaj imunski odgovor mora biti dobro izbalansiran
i precizno kontrolisan, da dovede do eradikacije patogena, a da pri tome ne nanese štetu
domaćinu. Danas je potpuno jasno da pojedini članovi mikrobne zajednice mogu direktno
208
uticati na različite mehanizme imunskog odgovora. Najvažniju ulogu u ovoj toleranciji na
komensale ima posebna subpopulacija T-limfocita nazvanih T-regulatorne ćelije (engl. T
regulatory cells, TREGs). Takođe znamo da veoma važnu ulogu u razvoju imuskog sistema
svakog pojedinca imaju komensalni mikroorganizmi. Pokazano je da nastanak i etiopatogeneza
različitih autoimunih bolesti kao što je dijabetes melitus tip A, inflamatorna crevna bolest,
astma, multipla skleroza, alergije itd. može biti povezan sa mikrobiološkom zajednicom
pojedinca. Naime pretpostavlja se da u značajnom broju ovih oboljenja glavnu ulogu igraju
savremeni životni uslovi koji uskraćuju pojedincu kontakt sa velikim brojem različitih
mikroorganizama, i na taj način čine imunski sistem domaćina nespremnim da u određenim
situacijama adekvatno reaguje. Suprotno, neprestani susreti sa stranim i domaćim
mikroorganizma “vežbaju” imunski sistem i tako ga čine spremnim da u novim situacijama
reaguje adekvatno. Ali imajući u vidu prisustvo na stotine različitih mikroorganizama u vagini
teško je znati koji od njih su oni koji u stvari predstavljaju deo odbrambenog sistema domaćina,
a još teže je odgovoriti na pitanje kako oni ostvaruju svoju ulogu. Pored toga verovatno se u
najvećem broju slučajeva ne radi i pojedinačnim mikroorganizmima i njihovom uticaju na
zdravo-bolesno, već se u najvećem broju slučajeva radi o većem broju mikroorganizama, dakle
ekološkoj zajednici koja promoviše zdravlje, a u kojoj svaki od njenih članova ima veću ili
manju ulogu. Današnji dijagnostički kriterijumi svode se na svega nekoliko članova vaginalne
flore ili preciznije na: Lactobacillus, Gardnerella, Bacteroides, Mobilluncus, C. albicans, T.
vaginalis.
Ili, uobičajena statistička obrada podataka podrazumeva Nugentove kriterijume kao
zlatni standard, na osnovu koga se procenjuje vrednost ostalih “testova” i dijagnostičkih
kriterijuma [208, 444, 445]. Većina dosadašnjih ispitivanja pokazala je da postoji dobra
podudarnost između različitih dijagnostičkih kriterijuma za BV, kao što smo i mi pokazali za
NP-6G i njene modifikacije [446 - 452]. Međutim, za razliku od drugih studija NP-6G je
izdvojila grupu pacijentkinja (NN+BVN) u kojoj je ta podudarnost veoma loša. Navešćemo kao
primer ispitivanje Sha i sar. [455] u kojoj je senzitivnost Amselovih kriterijuma u odnosu na
Nugenta kao zlatni standard bila svega 37% [453-455]. U uvodu autori [455] ukazuju da su
Amselovi kriterijumi subjektivniji jer, zavise od iskustva i pronicljivosti kliničara, i zbog toga
su manje osetljivi i reproducibilni u odnosu na Nugentove. Mi mislimo da je vrednost pH koja
se očitava na test papiru objektivna dijagnostička procedura, što bi se moglo reći i za test sa a
10% KOH, a ono što je subjektivno u obe metodologije jeste mikroskopski pregled. Dakle ,
kako je moguće da je u pomenutoj studiji Sha i sar. [455] samo 75 žena imalo BV na osnovu
Amselovih kriterijuma, a 203 na osnovu Nugentovih kriterijuma. Iz rezultata se vidi da su
209
specifičnost i senzitivnost koje se odnose na CC skoro podudarne navedenim, što znači da je
najvažniji dijagnostički kriterijum za dijagnozu BV bio detekcija CC. Kao što smo detaljno
obrazložili u metodologiji mi prisustvo CC nismo smatrali obaveznim za dijagnozu BV. U
našem ispitivanju dijagnoza BV na osnovu Amselovih kriterijuma postavljena je kod 168/641
pacijentkinje, od čega su 63 na osnovu NP-6G imale BVF 37, 5% (63/168). Ove 63
pacijentkinje su na NPVS imale CC i da je to bio i naš kriterijum dobili bi iste rezultate kao i
Sha i sar. [455]. Ali kako u našem ispitivanju CC nisu bile obavezne za dijagnozu BV mi smo
BV dijagnostikovali kod još 105 pacijentkinja, dok je na osnovu NP-6G dijagnoza BV
(BVF+BVM+BVN) postavljena kod 174 pacijentkinje. Zaključak je dakle da kliničar nije
bitnije uticao na rezultate nego su oni posledica dosledne primene postojećih dijagnostičkih
kriterijuma što ukazuje na potrebu za preispitivanjem njihove vrednosti.
Međutim, drugo i možda u ovom trenutku važnije pitanje jeste da li su 203 pacijentkinje
iz ispitivanja Sha i sar. kod kojih je dijagnoza BV postavljena na osnovu Nugentovih
kriterijuma i stvarno pacijentkinje koje imaju BV ili su neke pacijentkinje sa normalnim
nalazom proglašene za BV, i obrnuto. Naravno s obzirom na činjenicu da su Nugentovi
kriterijumi zlatni standard nemamo mogućnost da to proverimo, ali svakako nam je dozvoljeno
da sumnjamo. Ono što nam svakako daje pravo da sumnju je ispitivanje De Backer i sar. [456]
koji su među prvima pokazali da L.iners često ostaje skriven prilikom mikroskopskog pregleda
zato što se boji Gram negativno. Nakon toga u poglavlju o gardnereli i knjizi „Molekularna
detekcija bakterijskih patogena ljudi“ Rita Verhlest i sar.[213] navode da je zbog sličnosti u
morfologiji kolonija L. iners u nekoliko navrata pogrešno identifikovan kao G. vaginalis, i da
se kao i G. vaginalis kratki Gram pozitivan štapići L. inersa mogu bojiti i pod mikroskopom
videti kao Gram negativni štapići, što može dovesti do pogrešnih zaključke o ulozi (dijagnozi)
ovih vrsta u BV.
210
Rezultati najnovijih molekularnobioloških studija pokazuju da su L.iners i G. vaginalis
dva najčešće detektovana mikroorganizma u mikrobiomu vagine, što praktično znači da ih
gotovo uvek ima i na mikroskopskom preparatu, kako kod normalnih i intermedijarnih nalaza,
tako i kod pacijentkinja sa BV.
Slika 3.28: Fenotipska sličnost L. Inners i G. vaginalis, kako ih razlikovati pod mikroskopom? Vide se
CA, PMN, KOKE (“blue cells”) i LEPTO forme
211
U prethodnoj diskusiji objasnili smo otkuda visoka podudarnost među različitim
metodama, i da je u takvim slučajevima teže pogrešiti (NF, BVF) nego postaviti pravu
dijagnozu.
Jedan od primera je i pacijentkinja pod rednim brojem jedan u tabeli 3.5. Tokom ispitivanja kao
najčešće karakteristike ove “problematične” grupe bile su hipercelularnost (FULL ili MID),
infekcija CA i prisutan veliki broj PMN (PMN2,PMN3), a ne retko i prisustvo drugih formi
(KOKE, BIFIDO, LEPTO), tako da se ceo nalaz vidi kao neki “mešoviti” poremećaj vaginalne
flore. Ono što je problematično u metodologiji gledanja na uvećanju X200 jeste činjenica da u
takvim slučajevima nalaz na prvi pogled liči na BVF i prisustvo velikog broja NŠF. Međutim,
pažljivim gledanjem se vidi (pod mikroskopom jasnije nego na fotografijama) da na preparatu
pored velikog broja NŠF, takođe postoji i veliki broj vrlo kratkih ŠF, a kako smo na osnovu
morfometrijskih merenja utvrdili (vidi metodologiju) formi čija je dužina preko 1,5 μm
(najmanja dužina na kojoj se neka forma prikazuje kao ŠF), ali manja od 3 μm, tako da bi smo
mogli reći da je njihova prosečna dužina oko 2 μm. Dakle vidimo veliki broj SBF i vrlo kratkih
ŠF, a to se bolje vidi na sledeće dve Slike (Slike 3.19 i 3.20) (druga pacijentkinja) na kojim smo
još tokom ispitivanja upisali “najteže za diferencijaciju x200...” i “x200....se vide vrlo kratke
tanke ŠF i SBF” (SBF je sitna bakterijska flora i odgovara BVAB flori kako je to definisano u
Metodologiji).
Na slikama treba uočiti marker dužine 1,99 μm, u skladu sa prethodno navedenim. Na
fotografijama koje slede, sa tekstom upisanim tokom ispitivanja, jasne su i naše dileme kod
ovakvih nalaza. Tako na Slici 3.21 piše: “pre normalan nego BV” što jasno ukazuje na
dubioznost ovakvih nalaza. Naš zaključak da se radi pre o normalnom (L.iners) nego
patološkom nalazu podupirali smo još sledećim činjenicama: Prvo, kod pacijentkinja sa BVF
ove vrlo kratke ŠF su retke ili ih nema, a sa duge strane ovakvi nalazi nikada ne pokazuju tipične
slike “arhipelaga” i “peščanih staza” koje su patognomonične za BVF. Takođe, na ovakvim
preparatima vrlo su retke ako ih uopšte ima clue cells tako da se epitelne ćelije jasno vide. Kako
su clue cells formacije koje po našem mišljenju formira uglavnom G. vaginalis, kada apsolutno
predominira vaginalnom florom, jedna od hipoteza ovog ispitivanja je da u ovakvim
slučajevima zbog manjeg broja G. vaginalis, prilično velikog broja L.iners, a možda i prisustva
CA ili nekih drugih faktora, ne dolazi do “formiranja” clue cells.
Još jedna od hipoteza ovog rada koju ćemo ovde pomenuti jeste da kod nekih
pacijentkinja sa jasnim nalazom BVF nema clue cells i da se u takvim slučajevima radi o
predominaciji drugih anaeroba (A. vagine, Prevotella spp., Megasphaera itd.) dok je G.
vaginalis, svakako, prisutna ali u značajno manjem broju zbog čega i nema clue cells. Dakle
212
tako bi na neki način mogli razlikovati dva tipa BV: Prvi, u kojem predominira G. vaginalis
(kvalitativno i kvantitativno) i koja se karakteriše velikim brojem clue cells, sa manjim brojem
drugih BVAB (A. vagine, Prevotella, Megasphaera) i koji je na fotografiji definisan kao “tip A
BV”(fotografije), i drugi (na fotografijama definisan kao Tip B) kod koga su clue cells retke ili
nedostaju (manji broj G. vaginalis) a predominantne su druge BVAB, uz “sveprisutni” L.iners.
Da budemo jasni, naša hipoteza o predominaciji drugi BVAB u odnosu na G. vaginalis zasniva
se najvećim delom činjenici da kod ovakvih nalaza nemamo clue cells, ali ne isključivo, jer smo
za nalaze nekih mikroskopskih formi na koje smo nailazili tokom ispitivanja pretpostavili da
predstavljaju druge članove BVAB familije (A. vaginae, Prevotella, BVAB3), ali nigde nismo
naći “vizuelnu” potvrdu ovakvih pretpostavki. Rad Datcu i sar. sa priloženim fotografijama
pomogao nam je da potvrdimo neke naše pretpostavke, za koja do tada nismo imali objektivnu
verifikaciju [165]. Veliki broj podataka u poslednjih desetak godina ukazuje da je Atopobium
vaginae jedan od najvažnijih mikroorganizama u etiopatogenezi BV [457-461]. Jedna od
“mikroskopskih hipoteza” našeg ispitivanja je da malo G. vaginalis i predominacija drugih
BVAB (A. vaginae, Prevotella. daje sliku sa malo ili bez clue cells, nalaz na fotografijama
označen kao BV tip B (Slika 3.25). Sledeće fotografije (3.29-3.38) su dokaz da je A. vaginae
moguće prepoznati i na uvećanju x200, a ako imate dobru opremu i izmeriti, a na uvećanju x
1000 to i potvrditi.
Slika 3.29: Na uvećanju X200 na prvi pogled liči na BV;vrlo kratke i tanke ŠF za koje mislimo da
odgovaraju L.inersu ili G.vaginalis dužina ovih formi između 1,5- 2,5 µm; gram-varijabilne
213
Slika 3.30 Uvećanje x200: Gram varijabilni vrlo kratki i tanki šatapići za koje ne možemo reći da li
odgovaraju L.inersu ili G.vaginalis, a ovakav nalaz je čest kod CA i udružen sa povećanim brojem PMN
Slika 3.31: Dijagnoza normalan ili BV smo donosili ukoliko smo videli veći broj ovih sitinih tankih ŠF od
NŠF, ali je često dijagnoza vrlo dubiozna
214
Slika 3.33: Isti preparat na uvećanju x1000 vidi se nekoliko laktobacila tipa L.crispatusa deblji i duži, a ya
ostale Gram negativne ili Gram varijabilne sitne štapiće teško je reći da li su L-iners ili G. vaginalis
Slika 3.32: Uvećanje X100 tipičan nalaz za BVF (tip A)sa clue cells i velikim brojem BVAB čija je dužina
manja od 1,5µm ili bolje rečeno bliže 1µm; primetiti dosta G+ BVAB ali nisu Atopobium vagine
215
Slika 3.34: Više L.inersa ili G.vaginalis? Šta je šta? Uvećanju x200!?
Slika 3.35: Više L.inersa ili G.vaginalis? Šta je šta? Uvećanju x1000!?
216
Slika 3.36: Tipična BVAM kod BVF (Tip B) sa elipsastim izrazito G+ formama za koje verujemo da su
Atopobium vagine, drugi verovatno odgovaraju Prevotella spp. G. vaginalis, a sigurno ima i L.inersa
Slika 3.37: BVF tip A sa clue cells i verovatno predominatnom G. vaginalis u odnosu na druge BVAB,
nema Atopobiuma, a sigurno ima L.inersa; više G. vaginalis više clue cells; uvećanje x1000
217
Slika 3.39: BVF ali bez clue cells (tipB) verovatno predominiraju Prevotella spp. i Atopobium, dok se G.
vaginalis nalazi u manjem broju; uvećanje x1000
Slika 3.38: BVF u kome verovatno predominira Atopobium sa Prevotella spp.; clue cells retke ili odsutne;
x1000
218
Slika 3.40: Atopobium vagine uvećanje x1000+ ; naravno ne možemo biti sigurni da ovo nisu neke druge
gram pozitivne koke ali fenotipske karakteristike odgovaraju A. vagine
Slika 3.41: Predominiraju A.vagine i Prevotella spp. “Biopsija” ovoakvog preparata po Gramu i QPCR
mogli bi nam pomoći da izdiferenciramo neke od ovih bakterijskih morfotipova.
219
Slika 3.42: A. vaginae kod iste pacijentkinje na nativnom preparatu sa jednom kapi metilen blue, fazni
kontrast, uvećanje X400, azni kontrast daje sliku “mehurića” koji se menjaju finim pomeranjem
mikrometra (a-e), a bez faznog kontrasta vide se obojene veće “koke
Slika 3.43: Pored A. vagine vide se PMN, hife CA, retke štapićaste forme i dosta sitnih bakterijskih formi
(SBF), ali nema clue cells.
220
Slika 3.44: Ukoliko su clue cells obavezan dijagnostiki kriterijum u Amselovom kliničkom skoru onda kod
ove pacijentkinje ne bi postavili dijagnoz BV
Slika 3.45: Na uvećanju x400 ne možemo primeniti našu formula o odnosu ŠF/NŠF, jer se na ovom
uvećanju i SBF prikazuju kao kraći štapići; nema clue cells-nema BV, ali ukoliko bi primenili…
221
Slika 3.46: Dondersovu podelu i konstatovali da ovde predominiraju SBF onda bi oni sa više iskustva
postavili dijagnoz parcijalne BV
Slika 3.47: Bez faznog kontrasta nativni preparat sa jednom kapi methilen blue
222
Ove slike sa A. vaginae kod iste pacijentkinje ide u prilog prethodnoj diskusiji u kojoj su Sha i
saradnici na osnovu Amselovih kriterijuma postavili dijagnozu BV samo kod 77 od 203
pacijentkinje kod kojih je na osnovu Nugentovih kriterijuma postavljena dijagnoza BV, i jasno
govori da BV postoji i bez clue cells. Treba malo iskustva da se A. vaginae prepozna fazno
kontrastnom mikroskopijom, jer se njegov “izgled” pod mikroskopom menja sa pomeranjem
mikrometra tako da početniku deluje kao artefakt jer se prvo prikazuje u obliku sitnih belih
mehurića sa tačkicom u sredini, tako da se može pomisliti da se radi o artefaktu (koji inače nisu
retki kod faznokontrastne mikroskopije, pogotovo ako stavite malo više fiziološkog rastvora),
ili se brzim pomeranjem mikrometra može lako prevideti. Međutim, finim mikroskopiranjem
vidi se da se ova formacija menja, smanji se, izgubi okrugao oblik, postane nepravilnija i nekako
opet asocira na artefakt, da bi bez faznog kontrasta (poslednja fotografija) jasnije videli
elipsastu formaciju, za koju verujemo da je A. vaginae .poslednja fotografija) jasnije videli
elipsastu formaciju, za koju verujemo da je A. vaginae.
Na Slikama 3.47-3.49 (videti i Slike 3.28-3.31 3.33-3.34) prikazane su naše poteškoće
tokom studije u razlikovanju L.inersa i G. Vaginalis, a u Tabeli 3.16 su prikazane fenotipske
karakteristike najčešćih članova vaginalnog mikrobioma.
Tabela 3.16: Fenotipske karakteristike najčešćih članova vaginalnog mikrobioma
Naziv
Gram
Morfologija
L.crispatus
L.gasseri
L. jensenii
L.iners
G. vaginalis
Mobiluncus curtisii
Atopobium vaginae
Eggerthella
Peptostreptococcus
Gram +
Gram +
Gram +
Gram ±
Gram ±
Gram ±
Gram +
Gram +
Gram +
Bifidobacteria
Gram +
Actinomyces
Gram +
Štapićaste forme 0.37-0.56x 2.9- 4.8 μm
ŠF, lanci,
ŠF 0.6-0.8x2.0-4.0μm
Polimorfan, kokobacilaran, kratki i vrlo kratki
Poliomorfan, kokobacilaran, 0.4x 1-1.5 to 2-3um
Zakrivljene ŠF <0.5x 1.5-1.9um
Polimorfan,kratak, eliptičan, male koke
ŠF 0.2-0-4 x 0.2-2-0 μm; chains
Koke, kratki lanci, ili grupe
Ravni ili lako zakrivljeni Polimorfanog oblika, Y, V forme,
sa čekićastim (batičastim) krajevima, grana se, 0,5-1,3x 1,5-8 μm
“slične kineskom pismu”, neravnomerno se boje
Vitki, ravni ili zakrivljeni, 0.2-1x2- 5μm ili filamentni oblici 10-50μm
granaje često, kratki oblici sa batičastim krajevima, Y, V,
Corynebacterium
Gram +
Prevotella sp
Megasphaera
Mobiluncus mulieris
Dialister micraero
Sneathia sanguineg.
Leptotrichiaamnionii
Veillonella montpell.
Porphyromonas
Fusobacterium
BVAB1
BVAB2
BVAB3
Gram Gram Gram Gram Gram Gram Gram Gram Gram Nekultivisan
Nekultivisan
Nekultivisan
Ravni ili blago zakrivljeni štapići sa krajevima koji se sužavaju
ili su ponekad batičasti 0,3-0,8x1,5-8,0 μm; prave V formacije;
“slične kineskom pismu”;neravmomerno se boje; granule unutar ćelije
Plejomorfane, 0.7–0.8 μm širine 1.3–2.1 μm
Koke, 1,5x 1,2 μm
Zakrivljene ŠF <0.5x 2.9 μm
Kokobacili, 0.2-0.3x–0.4- 0.6 μm
Vrlo dugački ali i kratki, koke
Polimorfni, ravni ili zakrivljeni 0.8–1.5 x 5–15 μm
Koke 0.3x0.5 μm
Polimorfan, štapićaste ili kokoidne forme 0.4- 0.8x 0.8–6 μm
Štapićaste forme sa zašiljenim krajevima
Zakrivljen tanak rod; 0.4x1.0-1.5 μm
Kratki, debeli
Dugački oblici izgleda lanceta
223
Vide pretežno vrlo kratke (1- 2,5 μm) štapićaste, kokobacilarne forme koje se boje Gram
negativno, a koje morfološki odgovaraju i L.inersu i G. vaginalis. Na fotografijama treba
ponovo uočiti marker i razumeti (kao što je to navedeno u metodologiji) da se na uvećanju
X1000 kao ŠF prikazuju i formacije manje od 1,5 μm. Na sledećoj fotografiji prikazan je Gram
pozitivni, deblji štapić koji najverovatnije odgovara L.crispatusu, pre svega da bi se naglasila
razlika između ova dva soja laktobacila. Shodno tome, jasno je da se ne može govoriti o
iskustvu ili neiskustvu, niti o subjektivnom ili objektivnom, nego pre o objektivnim
nedostacima dijagnostičkih procedura, nezavisno od toga da li preparate po Gramu ili NPVS
gledate dve ili 20 godina. Iz rezultata ovog rada, i ličnog iskustva u gledanju preparatu po
Gramu, zaključili bi da za Nugentove kriterijume nije potrebno nikakvo veliko ili višegodišnje
iskustvo, na čemu se često insistira, nego da se taj posao može uspešno raditi i nakon intenzivne
obuke od desetak dana. Ako već govorimo o iskustvu i krivi učenja, mislimo da je ono mnogo
značajnije, a kriva učenja duža i teža za NPVS nego za pregled preparata po Gramu.
Preliminarni rezultati sa nemedicinskim osobljem (rezultati nisu prikazani u ovom radu)
ukazuju da ovde opisana metodologija i pregled mikroskopskog preparata po Gramu na
uvećanju x200 (NP-6G) ima vrlo kratku krivu učenja i ne zahteva nikakvo prethodno
medicinsko obrazovanje jer se dijagnoza u najmanje 60-70% slučajeva svodi na prepoznavanje
tipičnih slika koje ćemo prikazati na slikama 3.51-3.59.
Slika 3.48: G. vaginalis i L.iners: plejomorfni, Gram varijabilni, sličnih dimenzija (0.7–0.8 μm širine 1.3–
2.1 μm dužine) mikroskopski se ne mogu razlikovati bez obzira na uvećanje x200 ili x1000
224
Slika 3.49: G. vaginalis i L.iners: plejomorfni, Gram varijabilni, sličnih dimenzija (0.7–0.8 μm širine 1.3–
2.1 μm dužine) mikroskopski se ne mogu razlikovati bez obzira na uvećanje x200 ili x1000
Slika 3.50: G. vaginalis i L.iners u Nugentovom bodovnom zbiru imaju potpuno suprotne vrednosti preko
30 morfotipova Gardnerele 4 boda, a preko 30 laktobacila 0 bodova!
225
Slika 3.51: Tipična slika “arhipelaga” i “peščanih staza”kod pacijentkinja sa BVF na uvećanu x200 sa
imerzijom; dijagnoza jednim pogledom na preparat; ponekad se kao na ovoj slici vid ii biofilm
Slika 3.52: Normalan nalaz (NF) predominacija gram pozitivnih štapićastih formi ravnih krajeva; broj
bakterija (laktobacila) kod NF je uvek neuporedivo manji od BVAB kod BVF.
226
Slika 3.54: Veliki broj PMN, spore kvasnica koje se boje intenzivno G+, većina kvasnica je iz roda
Candida i u ovom ispitivanju su obeležavane kao CA, dakle ne mislimo samo na C. albicans nego i druge
sojeve
Slika 3.53: Uvećanje x200 Hipocelularan preparat (NULL) verujemo da je na ovakvim preparatima broj
bakterija manji od 104-105 i da zbog toga mikroskopskim pregledom ne možemo proceniti kvantitativne i
kvalitativne odnose različitih bakterijskih morfotipova; veći dijagnostički značaj pH i KOH test
227
Slika 3.55: Koke su na uvećanju x200 posute kao sitni crni prah obično rapoređene po regionima i
neverovatno zvuči da ih lakše nalazimo i prepoznajemo na uvećanju x200 sa imerzijom; i one sa kao CA
najčešće nalaze u nakupinama epitelnih ćelija
g
Slika 3.56: tapićaaste G+ slične laktobacilima(ravni krajevi) sa ćekićastim zadebljalim krajevima:
neravnomerno se boje, granulirane, u ovom radunazvane BIFIDO forme, a za koje verujemo da su češće
koreiformne bakterije (Corynebacteria)a ređe Bifidobacteria ili Actynomyces
228
Slika 3.57: Slika arhipelaga (BVF) sa brodovima (PMN); dijagnoza BV se postavlja jednim pogledom na
preparat a pregledom veće površine preparata veće su šanseza detekciju CA i precizniju procenu PMN
Slika 3.58: Karakteristične hife CA sa povećanim brojem PMN i bakterijskom florom u pozadini u kojoj
predominiraji L.iners i G. vaginalis
229
1
Slika 3.59: LEPTO forme su dugačke tanke G+ formečesto izvijugane i čudnih oblika, uvek tanje od hifa
kvasnica,a u pozadini je obično mali broj bakterijski (hipocelularana)
Slika 3.60: Disbioza vs homeostaza
1Slika preuzeta iz rada Petersen C, Round JL. Defining dysbiosis and its influence on host immunity and disease. Cell Microbiol. 2014 Jul;16(7):1024-33
230
Iskustvo nije od velikog značaja ukoliko pod mikroskopom gledate hipocelularan preparat,
dakle pacijentkinje koje smo mi u ovom ispitivanju podelili u dve grupe NN i BVN, i za koje
smo već rekli da su osnovni izvor neslaganja u poređenju različitih dijagnostičkih kriterijuma i
o kojima ćemo reći nešto više u ovom delu diskusije. Možda je ovaj mikroskopski nalaz
(NULL) lakše razumeti, ako ga budemo posmatrali u jedno širem kontekstu, kontekstu disbioza.
Disbioza (Slika 3.59) se definiše u najširem smislu kao bilo kakva promena u sastavu rezidualne
komnesalne zajednice, odnosno zajednice koja je nađena kod većine zdravih pojedinaca.
Termin disbioza se ređe koristi u ginekologiji i on je mnogo češći kod gastroenterologa koji
razlikuju tri kategorije disbioza: 1) Smanjenje broja ili potpuni gubitak korisnih
mikroorganizama; 2) Porast u broju patogena ili potencijalno štetnih mikroorganizama; 3)
Gubitak u različitosti (diverzitet) mikrobiološke zajednica.
Naravno da je i ova podela samo načelna, jer se radi o dinamičnim zajednicama u kojima je
moguć prelaz iz jednog oblika u drugi, a i različiti spoljašnji faktori mogu na to uticati. Tako,
terapija antibioticima može dovesti do gubitka korisnih mikroorganizama (L.crispatus)
značajnih za zdravu vaginalnu floru, što onda može omogućiti porast u broju komensala (C.
albicans) i dovesti do bolesti (vaginalna kandidoza), sa sledstvenim inflamatornim odgovorom
koji može imati štetne posledice po domaćina (PP). Preciznija i tačnija od ove teoretske
spekulacije bila bi ona koja bi tvrdila da primena antibiotika dovodi do poremećaja
kvantitativne i kvalitativne ravnoteže između velikog broja mikroorganizama, koji će dovesti
do stvaranja povoljnih uslova za rast i razvoj C. albicans. Kažemo preciznija i tačnija jer se
gotovo uvek radi o poremećaju u mikrobnoj zajednici koji je mnogo značajnije od uticaja
pojedinih mikroorganizama. Dosadašnja ispitivanja ukazuju da sastav i stabilnost vaginalnog
mikrobioma zavise od velikog broja faktora i da se značajno razlikuju kod većine žena, te da se
na osnovu jednostavne formule koja proračunava odnos različitih vrsta bakterija u jednoj
mikrobiološkoj zajednici ne može izračunati šta je " normalan " i " zdravo ", a šta “patološko”
ili “bolesno”. Treba razumeti da ne govorimo o pojedinačnim mikroorganizmima, i njihovom
uticaju na zdravo-bolesno, već o mikrobiološkim zajednicama koje promovišu zdravlje
domaćina. A kao što se vidi iz podele disbioza (3 grupa) i gubitak različitosti (diverziteta)
mikrobiološke zajednice, takođe predstavlja jedan od oblika disbioze, a on suštinski odgovara
pacijentkinjama koje su u ovom ispitivanju definisane kao NN i BVN Naravno treba razumeti
da se ova podela disbioza odnosi na mikrobiom gastrointestinalnog trakta čiji je i kvalitativni i
kvantitativni biodiverzitet neuporedivo veći od mikrobioma vagine koja u odnosu na
gastrointestinalni trakt predstavlja jednostavnu ekološku zajednicu. Ali ovim želimo da
pokažemo da bi po istom principu, ovoj grupi disbioza pripale pacijentkinje koje su Ison/Hay231
a kategorisali kao “0” (u našim tabelama čist), nalaz koji izgleda potpuno “čist” bez bakterijskih
formi. Kako podela po Nugentu nema ovu grupu pacijentkinja one u takvim ispitivanjima bivaju
svrstane u neku od 3 Nugentove grupe, i tako “nestaju” iz ispitivanja. Dondersovi kriterijumi
su ograničeni na dijagnozu AV, ali svakako bolje ukazuju na različite odnose u broju
laktobacilarnih i sitnih bakterijskih formi, i na neki način problem intermedijarnog nalaza
(originalno grupa IIa i IIb), ali takođe ne pominju ovu kategoriju pacijentkinja koja bi
odgovarala Ison/Hayovoj grupi “0”, našoj NULL. Ovakva grupa pacijentkinja, ili bolje rečeno
takav mikroskopski nalaz postoji i na NPVS, i to u istom procentu kao i na preparatu po Gramu
(10-30%). Naša podela (NP-6G) ne samo što prepoznaje ovu grupu pacijentkinja, nego je
smatra veoma važnom, odnosno grupom od posebnog interesa za koju u ovom trenutku
nemamo ni dijagnostičke kriterijume niti znamo njen klinički značaj a oko 17% pacijentkinja
svrstali smo u ovu grupu. Po našem mišljenju u ovakvim slučajevima dolazi pre svega do
značajnog smanjenja broja bakterija u vaginalnom mikrobiomu i zbog tako malog broja ne
možemo da ih vidimo na preparatu bojenom po Gramu. Naime dobro je poznata činjenica da
bakterije moraju da pređu određen broj, koncentraciju ili broj kolonija po mililitru ili gramu
uzorka da bi smo uopšte mogli da ih vidimo na preparatu obojenom po Gramu. U zavisnosti od
uzorka ova se granica obično kreće >104--105. U nekim uzorcima (urin) nalaz po Gramu može
da služi kao skrining test jer ako ne vidimo bakterije ili ih je vrlo malo pretpostavljamo da je
njihov broj manji od 105 i da u takvim slučajevima nema potrebe raditi urinokulturu. Rezultati
našeg ispitivanja jasno ukazuju grupa pacijentkinja sa malim brojem bakterijskih formi izvesno
postoji kao da je diferencijacija između zdravog i bolesnog u ovoj grupi najteža jer ne možemo
primeniti postupak koji smo naveli za nalaz urina. Zato mislimo da kod ovakvih nalaza nije ni
moguća dijagnoza samo na osnovu mikroskopskog nalaza bez obzira o kakvom se preparatu
radi ili na kom uvećanju ga gledamo. Dakle zbog ukupno malog broja bakterija njihovi
kvantitativni ili kvalitativni odnosi ostaju nepoznati nakon mikroskopskog pregleda, jer je
moguće da u toj flori preovlađuju i laktobacili, ali je moguće i suprotno. Ukoliko se oslonimo
samo na mikroskopski pregled onda je sigurno da bi u svakom ponovnom gledanju određen
broj ovih pacijenata svrstali u drugu grupu u odnosu na prethodni nalaz. Naravno, da se ovakav
nalaz može tumačiti i kao tranzicioni, prelazni, ali bi se takođe mogao i tumačiti kao disbioza
sa gubitkom kvantitativnog diverziteta bakterijskih formi. Ako ovo i prihvatimo kao tranziciono
stanje, problem je što ne znamo da li se tranzicija “kreće” u smeru od bolesnog prema zdravom
ili obrnuto, što bi naravno bilo odlučujuće za kliničara, odnosno terapijski pristup takvom
pacijentu. Suštinski, najvažnije praktično pitanje je da li su ove pacijentkinje zdrave ili bolesne,
i da li treba da se leče i kako? S jedne strane, rezultati i studija koje su koristile kulturu kao i
232
rezultati najnovijih molekularnobioloških studija ukazuju na bar dva stanja koja bi mogla
dovesti do ovakvih poremećaja vaginalne flore, a koja bi mogli smatrati fiziološkim. Prvo je
vezano za menstruaciju i period neposredno nakon menstruacionog krvarenja, a drugo je
postmenopauza [462-470]. I u jednom i u drugom slučaju dolazi do smanjenja estrogena, broja
laktobacila i raznolikosti vaginalne flore. Prekomerna primena antibiotika takođe bi mogla
dovesti do ovakvog stanja. Ali 17 % naših pacijentkinja koje su svrstane u grupu NULL su
trudnice koje pre uzimanja uzorka nisu uzimale nikakvu terapiju? Pitanja na koja trenutno
nemamo odgovore jeste koliko su ovakve promene flore česte i kolika je rezilijencija
vaginalnog ekosistema, odnosno sposobnost da se bez intervencije spolja (terapija) vaginalni
ekosistem vrati u zdravo stanje i koliko je vreme potrebno da bi se to desilo. Na osnovu
iznesenih činjenica i našeg kliničkog iskustva mislimo da u ovakvim slučajevima mikroskopski
nalaz ima mali značaj, odnosno da je pokušaj da ovu grupu pacijentkinja na osnovu
mikroskopskog nalaza u zdrave, intermedijarne i BV, kao što smo već rekli osnovni uzrok
dijagnostičkih neslaganja, a verovatno i prilično kontradiktornih rezultata u lečenju, recidivima
i kliničkom ishodu, kao i rizicima za druge neželjene događaje. Na osnovu rezultata našeg
ispitivanja i našeg kliničkog iskustva mislimo da u ovakvim slučajevima dijagnozu treba
postavljati na kliničkog nalaza, odnosno prvenstveno na osnovu rezultata pH testa i probe sa
10% KOH. U našoj svakodnevnoj kliničkoj praksi pacijentkinje sa pozitivnim KOH testom i
pH>4,5 a sa mikroskopskim nalazom NULL posmatramo kao pacijentkinje sa poremećenom
vaginalnom florom ili „mikroskopski nevidljivom“ blagom BV i dajemo terapiju prebioticima
i acidifikantima. I pacijentkinje sa negativna dva testa dobijaju istu terapiju, jer smatramo da
ovakvo stanje može biti rizično za nastanak težih formi BV (parcijalna ili full), a ovakva terapija
ne može naneti nikakvu štetu pacijentkinji. Primenu metronidazola ili drugih antibiorika
predviđenih za lečenje BV u ovakvim slučajevima ne samo da smatramo neopravdanom, nego
mislimo da bi mogla da bude potencijalno štetna. Tako je poznato da terapija metronidazolom
dovodi i do uništavanja određenih sojeva laktobacila, najvećeg broja BVAB, ali je takođe
poznato da je A.vagine rezistentan na ovaj lek. Teoretski, ovakvim „lečenjem“ mogli bi smo da
napravimo idealne uslove za rast i razvoj A.vagine. Još interesantnije je pitanje da li bi nove
objektivnije molekularne metode mogle pomoći da u ovoj grupi pacijentkinja preciznije
povučemo granicu između normalnog i patološkog. Teoretski, svakako bi mogle, jer bi nam
mogli pružiti bolji uvid u kvantitativni i kvalitativni sastav ove mikrobne zajednice, i mogućnost
poređenja sa kliničkim i mikroskopskim podacima. Međutim da bi osmislili buduća ispitivanja
prvi korak je da ovu grupu pacijentkinja moramo izdvojiti u posebnu kategoriju odnosno postići
konsenzus u dijagnostičkim kriterijumima, jer kao što smo prethodno objasnili sadašnje podele
233
ne “prepoznaju” ovu grupu pacijentkinja. Ovo je još jedan razlog što mislimo da bi naša nova
metodologija mikroskopskog pregleda (NMMP) koja omogućava da se na veoma brz i
jednostavan način izdvoji ova grupa (NULL) pacijentkinja, bila bolja od postojećih u
komparativnim studijama kliničkih, mikroskopskih i molekularnobioloških nalaza. Međutim i
stav da se kod ovakvih pacijentkinja radi o disbiozi koja je uzrokovana smanjenjem broja i
različitosti mikrobiološke zajednice potpuno je prihvatljiv, odnosno po našem mišljenju mnogo
prihvatljiviji ili bar podsticajniji za dalja ispitivanja, nego da ovu grupu pacijentkinja
proglasimo intermedijarnom ili zdravom, odnosno onima koje nemaju BV (engl. non-BV). S
obzirom da je ovo ispitivanje rađeno u populaciji trudnica, uticaj menstruacije i menopauze su
isključeni, ali oko 17% naših pacijentkinja (NN+BVN) moglo bi se svrstati u treću kategoriju
disbioza. I zaista, po rezultatima najnovijih molekularnobiološkim studija, prisustvo i
koncentracije L. crispatusa, je svakako najvažniji parametar za “zdravo” u vaginalnoj flori. Na
osnovu našeg iskustva i mikroskopskog pregleda vaginalnog preparata, bez ikakvih
molekularnobioloških ispitivanja, slobodni smo tvrditi da kod ovakvih pacijentkinja gotovo
uopšte nema L. crispatusa, odnosno da je njegov broj značajno smanjen [216, 471, 472]. S
druge strane najnovija ispitivanja pokazuju da u vagini pored L.crispatusa ima i značajan broj
drugih laktobacila koji promovišu zdravlje, ali bi takođe mogli zaključiti da se na osnovu onoga
što znamo o fenotipskim karakteristikama npr. L. jenseniii, ni ovi laktobacili ne nalaze na
mikroskopskom preparatima ove grupe pacijentkinja. Laktobacili odnosno ŠF koje nalazimo
na ovakvim preparatima obično su vrlo kratki, granične veličine u našem razlikovanju ŠF od
NŠF (1,5-2,5 μm), gram-varijabilni i najverovatnije predstavljaju L.iners. S druge strane,
poznato je da je L. iners predominatna vrsta laktobacila kod najvećeg broja pacijentkinja sa BV,
intermedijarnim nalazom, ali da je i sastavni član laktobacilarne zajednice kod zdravih žena
[130-135]. Verhelst i saradnici ukazuju da je predominacija L. inersa i L. gasseri znak
nestabilnosti vaginalnog ekosistema i lakše mogućnosti za nastanak patološke vaginalne flore,
dok De Backer sa saradnicima postavlja pitanje da li se predominacija L.inersa uz nedostatak
drugih laktobacila uopšte može smatrati zdravom vaginalnom florom [456].
Dakle, ako na trenutak i zaboravimo podatak da pod mikroskopom ne možemo razlikovati L.
iners i G. vaginalis, ili pretpostavimo suprotno, dakle da ih možemo razlikovati u 100%
slučajeva, moramo se zapitati da li nam to što smo na hipocelularnom preparatu (NULL)
izbrojali nekoliko ili desetak L.inersa više od G. vaginalis na 20 od 17 000 vidnih polja
dozvoljava da postavimo dijagnozu normalne vaginalne flore (Nugentov skor). Naravno ni naša
metodologija na x200 ne dozvoljava i ne omogućava mnogo precizniju razliku jer kao što smo
rekli i na ovom uvećanju mi vidimo vrlo kratke granične ŠF, za koje verujemo da su L.iners pre
234
nego BVAB. Dakle, ako to i jeste L.iners njihov tako mali broj i prisustvo NŠF (a često i koka)
ne daje nam pravo da postavimo dijagnozu normalnog nalaza. Dakle mi smo u ovom ispitivanju
napravili razliku između pacijentkinja sa nalazom NN i BVN, ali i podela u kojoj ove
pacijentkinje predstavljaju jednu grupu (NP-3G) nije bez osnova. Ponovićemo, u svakodnevnoj
praksi, a i tokom našeg ispitivanja, pacijentkinjama sa ovakvim mikroskopskim nalazom
ordiniramo terapiju, prebiotici sa acidifikacijom vagine. Problem u kliničkom radu mogu biti
pacijentkinje kod kojih su pozitivni nalazi testa sa 10% KOH, vaginalni pH˃4 i pojačanu
sekreciju tako da bi na osnovu Amselovih kriterijuma kod takvih pacijentkinja mogli postaviti
dijagnozu BV. Tako je u našem ispitivanju oko 40% pacijentkinja iz grupe NULL (NN+BVN)
imalo pozitivan test sa KOH i vaginalni pH˃4,5, od čega su oba testa bila pozitivna kod oko
polovine od ovih pacijentkinja. Međutim čak i u takvim situacijama, kada na osnovu Amselovih
kliničkih kriterijuma možemo postaviti dijagnozu BV, naš terapijski pristup se ne menja.
Jednostavnije je ukoliko pogledamo slike (Slika 3.18 i 3.19) na kojima smo na uvećanju
x200 i x1000 postavili dijagnozu BVF i BVN. Dakle na osnovu većine postojećih kriterijuma
ove dve pacijentkinje bile bi svrstane u istu grupu, a pitanje koje se nameće je da li ove dve
pacijentkinje imaju isti poremećaj vaginalne flore i da li se i klinički razlikuju koliko se
razlikuju vizuelno.
Očigledno je da pacijentkinje iz grupe BVF imaju neuporedivo veći broj bakterijskih formi u
odnosu na pacijentkinje BVN i ukoliko bi patogeni potencijal procenjivali na osnovu
kvantifikacije bakterijskih formi onda bi pacijentkinje iz grupe BVF imale daleko veći rizik za
neželjena dešavanja od pacijentkinja sa nalazom BVN. Kako ovo ne može biti jedini parametar,
naravno da ne možemo isključiti ni mogućnost da naprimer inflamatorni odgovor koji
prouzrokuje bakterijska flora tipa BVN ne nosi veći rizik od PP u odnosu na nalaz BVF. Ali
ako prihvatimo neke opšte imunološke postulate, kao što je činjenica da interakcija između
bakterija i ćelija domaćina neminovno dovodi do oslobađanja određenih koncentracija jednog
ili više citokina, i da ta produkcija citokina u velikoj meri zavisi od prirode mikrobiološkog
agensa, a i od njegovog broja (load) onda je vrlo verovatno da će se imunski odgovor i spektar
i koncentracije oslobođenih citokina i drugih inflamatornih medijatora razlikovati kod ove dve
grupe pacijentkinja. Pri tome treba imati u vidu činjenicu da kod BV, a i većine drugih stanja
vaginalne flore ne govorimo kao kod većine infektivnih bolesti o jednom mikrobiološkom
agensu, nego o odnosu velikog broja različitih bakterijskih vrsta, i u kome predominacija jednih
ili drugih definiše bolesno ili zdravo. Ono što smatramo veoma važnim da još jednom
naglasimo jeste da je pacijentkinja sa BVN na osnovu Nugentovih dijagnostičkih kriterijuma
za prosečan broj bakterija na 5 nesusednih vidnih polja i uvećanju x1000 imala ukupan zbir 9
235
(0 laktobacila=4 boda+ 6 Gardnerela morfotip=3 boda+6 zakrivljenih Mobiluncus=2 boda) što
znači BV.
Slika 3.61: Uvećane x200 pacijentkinja sa nalazom BVN sa 10-1000 puta manje bakterija u odnosu na
pacijentkinje sa nalazom BVF(slika 3.61); da li se razlikuju u kliničkom i terapijskom pristupu koliko se
razlikuju vizelno? Koliki je ruizik za PP? Nugentov skor ovde je bio 8=BV!
Druga pacijentkinja je imala ukupan zbir 8 (0 laktobacila=4 boda+ >30 Gardnerela morfotip=4
boda+ nije viđen Mobiluncus morfotip=0) što opet znači BV. Dakle pacijentkinja sa
neuporedivo manjim brojem bakterijskih formi ima veći skor po Nugentu. Cilj ove diskusije
jeste da ukažemo da Nugentovi kriterijumi ne razlikuje ove grupe pacijentkinja niti u
praktičnom bilo istraživačkom smislu ima razlike između pacijentkinja sa zbirom od 7 bodova
ili zbirom od 10 bodova po Nugentu. Ili kada ginekolog koji ne gleda mikroskopski preparat po
gramu dobije izveštaj iz mikrobiološke laboratorije najčešće ne stoji broj bodova nego samo
dijagnoza: normalan, intermedijaran ili BV. Na kraju krajeva i da takav skor piše u nalazu i
terapija koju će odrediti ginekolog je ista: metronidazol 2x500 grama 7 dana. Kao što smo rekli
suština NP-6G je što razlikuje pacijentkinje po celularnosti (BVF, BVM, BVN) a i terapijski
pristup se značajno razlikuje.
236
Slika 3.62: Uvećane x200 pacijentkinja sa nalazom BVF sa 10-1000 puta više bakterija u odnosu na
pacijentkinje sa nalazom BVN (slika 3.60); Da se li koncentracije nekog citokina razlikuju koliko se
razlikuje “koncentracije” bakterija?Koliki je rizik za PP? Nugentov skor ovde je bio 10=BV
Tako bi nulta hipoteza mogla biti da ove pacijentkinje predstavljaju grupu sa posebnim
poremećajem vaginalne flore, i da su neophodna dalja ispitivanja koja će ovu grupu definisati
u epidemiološkom, kliničkom i terapijskom smislu, kao i nova istraživanja koja bi dokučila
etiopatogenetske mehanizme stanja vaginalne flore u kojoj nestaju i „dobre“ i „loše“ bakterije.
Stanje u vaginalnom ekosistemu na ovakvim preparatima odgovaralo bi stanjima u
makroekološkim sistemima posle elementarnih nepogoda (poplava, požar), u kojima je oko
polovine stanovnika stradalo. Kao što smo rekli pretpostavke o menstruaciji, ispiranju vagine
različitim rastvorima, menopauzi ili primeni antibiotika su
potpuno prihvatljive kao
“elementarne nepogode” koje su gotovo u potpunosti uništile i normalnu i patološku vaginalnu
floru. Ali mi tražimo odgovor na pitanje kakva je to “elementarna nepogoda” u našoj populaciji
trudnica dovela do ovakvog stanja vaginalne flore, s obzirom da naše pacijentkinje nisu uzimale
nikakve lekove, nisu ispirale vaginu ili krvarile, nisu imali seksualne odnose najmanje 7 dana
pre ispitivanja? Dakle, sigurno je da su kod naših pacijentkinja neki drugi, nama nepoznati,
mehanizmi i stanja doveli do ovakvih promena u vaginalnoj flori. Naravno ne možemo isključiti
ni mogućnost da se u ovakvim slučajevima radi o cikličnim fiziološkim procesima u kojima
“čistači” (scavenger) domaćina prave “veliko spremanje”, posle čega kreće ponovna
237
kolonizacija i uspostavljanja novih odnosa mikrobnoj zajednici. Moguće je da se radi o
odbrambenom mehanizmu kod žena koji podrazumeva da se potencijalne opasnosti za
domaćina, nastale zbog poremećaja odnosa među članovima vaginalne flore, najefikasnije ili
jedino tako mogu sprečiti, odnosno omogućiti uslovi za ponovnu rekolonizaciju vagine
laktobacilima. U svakom slučaju mislimo da ovaj interesantan fenomen
i ova grupa
pacijentkinja zaslužuju posebnu pažnju, kako u kliničkim tako i u mikrobiološkim, odnosno
molekularnobiološkim ispitivanjima. Najinteresantnija pitanja su: Da li se radi o normalnim i
prolaznim fiziološkim poremećajima, ili patološkim poremećajima vaginalne flore? Da li i
kakva terapija treba ovoj grupi pacijentkinja? Da ova grupa u budućnosti treba da bude
intenzivnije ispitivana indirektno ukazuju i rezultati internacionalne studije u kojoj su
najiskusniji ispitivači procenjivali vrednost različitih dijagnostičkih kriterijuma (Nugent,
Amsel, Ison/Hay) u dijagnozi BV. Rezultati ove studije pokazali su da je ukupna podudarnost
između različitih metoda dobra, ali upozoravaju da su najveća neslaganja među ispitivačima
bila kod nalaza sa malim brojem laktobacila, dakle hipocelularni nalazi, što se u potpunosti
podudara sa rezultatima našeg ispitivanja [473]..
Tako rezultati ovog ispitivanja, ukazuju da gotovo kod jedne trećine pacijentkinja na
NPVS nismo detektovali prisustvo CA, a posle smo je detektovali na preparatu po Gramu.
Drugo, rezultati našeg ispitivanja pokazuju da je oko 40% pacijentkinja imalo mešovitu
infekciju CA/BV ili BV/CA. Dakle mikroskopska slika koju vidite na NPVS, sa
predominacijom SBF i velikim brojem PMN ukazuje na AV, ali ista takva slika je i kod
pacijentkinja sa patološkom vaginalnom florom (LBG IIb i LBG III) koje imaju u manjem ili
većem broju spore i hife gljivica. A ponekad treba mnogo strpljenja i truda da se elementi
gljivica detektuju na NPVS sa 10% KOH. Naime i na NPVS, vrlo je često da CA bude prisutna
samo na malom delu preparata i vrlo lako može da se previdi. I ovde važi generalno
mikroskopsko pravilo: Verovatnoća da ćete mikroskopskim pregledom detektovati ono što
tražite upravo je proporcionalna površini preparata koju pregledate i vremenu kojem provedete
gledajući preparat. Podatak, da smo u ovom ispitivanju pregledom NPVS CA detektovali kod
115 od 642 (18%) pacijentkinja, dok smo višestrukim gledanjem preparat po Gramu na
uvećanjima 200 i x1000 CA detektovali kod 239 od 699 ( 34%) pacijentkinja. Od tih 114
pacijentkinja 82 su imale patološki broj PMN (uvećanje x200), odnosno
kod ove 82
pacijentkinje mogli smo na osnovu kriterijuma po Dondersu i saradnicima postaviti dijagnozu
AV. S druge strane, ako retrospektivno pogledamo rezultate našeg ispitivanja (samo preparat
po Gramu) to bi bile naše pacijentkinje patološkim brojem PMN kod kojih nije nađena CA, a
po podeli NP-6G bile su svrstane u grupu BVF (n=2), BVM (n=6) i BVN (n=3). Dakle samo
238
kod 11 pacijentkinja bi mogli postaviti dijagnozu AV. Tako bi epidemiološka studija zasnovana
na nalazima NPVS zaključila bi da je učestalost AV u ispitivanoj bila 12,7%, (82/642), dok bi
na osnovu pregleda preparata po Gramu (NP-6G) učestalost AV iznosila svega 1,7% (11/642).
Takođe, nismo uspeli da izdiferenciramo šta Donders podrazumeva pod „toksičnim
leukocitima“ posebno ne na NPVS, gde je najčešće ponekad zbog velikog broja optičkih
fenomena na faznom kontrastu teško izdiferencirati finiju strukturu PMN, kao što se to lepo
vidi pod imerzijom na uvećanju x1000. Takođe smo primetili da T. vaginalis koji nije živ, daje
sliku koja nama liči na toksične, rasprsnute leukocite. Gledajući preparat po Gramu, nismo
nalazili forme koje bi mogle odgovarati ovom opisu, ali smo primetili da se kod značajnog broja
pacijentkinja sa CA PMN prikazuju drugačijim, slabije se boje, teško se diferenciraju bisagasta
jedra, odnosno teško se uočava ćelijska membrana i kao da je došlo do citolize takvih PMN.
Dakle, s obzirom na činjenicu da je u našem ispitivanju uzrok patološkog broja PMN u oko
80% slučajeva CA, za konačan stav o dijagnozi i stvarnoj učestalosti AV, trebalo bi tražiti
odgovore u novim studijama i detekcijom CA kvantifikacionim PCR (Q-PCR).
Zato mislimo da metodologija koju smo koristili u našem ispitivanju može dati bolje rezultate
u definisanju kvantitativnog i kvalitativnog biodiverziteta vaginalnog mikrobioma, prevazići
mnoge od pomenutih nedostataka koji se odnose na postojeće metode i veoma lako se
implementirati u svakodnevnu kliničku praksu, istovremeno omogućavajući da se preparati
sačuvaju (nije moguće kod NPVS) i koriste za dalja naučna istraživanja. Sumiraćemo po našem
mišljenju najvažnije prednosti NMMP i NP-6G:
Površina pregledanog preparata bojenog po Gramu - Prva bitna razlika između naše i
postojećih metodologija je što mi preparat bojen po Gramu posmatramo na mikroskopskom
uvećanju x200, a prethodne tri metodologije podrazumevaju imerziju i uvećanje x1000.
Ovakvim pristupom, za isto vreme, možemo pregledati površinu preparata koja je za oko 200300 puta veća u odnosu na postojeće metode kojima se gleda 5-20 VP na uvećanju x1000. S
obzirom da je vaginalni razmaz prilično nehomogen naša nova metodologija predviđa
ispitivanje VP na tri različita dela preparata, uvek u smeru okomitom na razmaz, jer se tako
izbegava “praćenje” razmaza i gledanje male površine na kojoj je razmaz isti. Ovakvom
metodologijom stiče se objektivniji utisak o prisustvo različitih bakterijskih morfotipova,
gljivica (kvalitativno) i njihovog relativnog broja i odnosa (kvantitativno) na mikroskopskom
preparatu, kao i prisustva drugih nebakterijskih celularnih formi (PMN). Imajući u vidu
nehomogenost preparata i kompleksnost vaginalne flore, mislimo, da numerički odnos 3
bakterijska morfotipa detektovan na 0,001% (20/15 000 VP) površine preparata nije dovoljan
239
za donošenje pouzdani zaključka o kvantitativnom i kvalitativnom odnosu različitih
bakterijskih morfotipova i drugih nebakterijskih elemenata.
Semikvantifikacija bakterijskih i drugih ćelijskih morfotipova - Druga, i po našem
mišljenju važnija razlika u odnosu na postojeće metodologije, odnosi se na činjenicu da je naša
NP-6G prva klasifikacija koja i pacijentkinje sa normalnim nalazom (predominacija ŠF,
lakotobacila) i pacijentkinje sa BV (predominacija NŠF, BVAB) razvrstava u tri kategorije na
osnovu semikvantifikativne procene njihovog broja. Mislimo da bi ovakva kategorizacija bila
korisna i da bi se u budućim ispitivanjima utvrdilo da li se ove grupe pacijentkinje razlikuju
klinički koliko se razlikuju vizuelno, gde pre svega mislimo na pacijentkinje sa hipocelularnim
nalazom (NN i BVN). Takođe, mislimo da bi ovakva podela omogućila mnogo bolje uporedne
rezultate sa molekularnobiološkim studijama u kojima se koristi Q-PCR, i tako doprinela
daljem napretku u razlikovanju normalnog i patološkog u vaginalnoj flori.
Ista vrednost uvećanja na x200 i x1000 u razlikovanju L. inersa i G. vaginalis -Podaci
iz literature, kao i rezultati našeg ispitivanja, ukazuju da je najveći problem mikroskopskog
pregleda preparata vaginalnog sekreta, nezavisno od uvećanja ili tehnike bojenja, predstavlja
velika fenotipska sličnost dva najčešće detektovana mikroorganizma vaginalnog mikrobioma
L. inersa i G. vaginalis. Verovatne posledice su da određen broj pacijentkinja u ispitivanjima
pogrešno klasifikujemo u normalne, intermedijarne ili one sa BV. Moguće rešenje je u
uporednim studijama sa qPCR koji bi možda mogle ukazati na neke fenotipske (mikroskopske)
karakteristike ova dva mikroorganizma koji bi nam pomogli da ih preciznije izdiferenciramo.
Rezultati i iskustvo tokom našeg ispitivanja čija se metodologija prvenstveno zasniva na
prepoznavanju štapićastih formi na uvećanju x200, odnosno dimenzijama mikroorganizama
dozvoljava nam da postavimo sledeću hipotezu: Ukoliko na uvećanju x200 vidimo vrlo kratke
i tanke ŠF verujemo da one u najvećem broju slučajeva predstavljaju L.iners, dok se G,
vaginalis na ovom uvećanju najčešće ne prikazuje kao štapićasta forma. Dakle prisustvo vrlo
kratkih ŠF ukazuje na normalan nalaz, dok u slučaju predominacije NŠF imamo BV, uz
napomenu da su ovakvi nalazi vrlo česti kod pacijentkinja sa CA i povećanim brojem PMN.”
Jednostavna - jedini parametar koji razlikuje zdravu od patološke vaginalne flore je kao
što je rečeno odnos ŠF i NŠF, tako da za ovu metodologiju nije potrebno nikakvo prethodno
medicinsko ni mikrobiološko znanje, i za veoma kratko vreme može se vrlo lako savladati.
Dijagnoza BVF se postavlja bukvalno jednim pogledom na preparat, na kome se vide
patognomonične mikroskopske slike “arhipelaga” i “peščanih staza” kao što je to prikazano na
fotografijama . Ova slika je patognomonična za BV, i suštinski svako ko je vidi nekoliko puta
lako će je prepoznati bez obzira na medicinsko obrazovanje. Sva dalja aktivnost usmerena je
240
na otkrivanje, drugih uzročnika i prisustva PMN, odnosno dijagnozu eventualnih mešovitih
infekcija. Isto je kada su u pitanju pacijentkinje iz grupe NF gde predominiraju laktobacilarne
flore. Ništa teže nije kada su u pitanju pacijentkinje sa BVM ili NM jer se i tu najčešće i bez
ikakvih problema mogu lako razlikovati ove dve grupe nalaza. Pacijentkinje iz grupe NUL je
takođe jednostavno prepoznati, ali je u principu veoma teško povući granicu između NN i BVN,
o čemu ćemo kasnije opširno diskutovati.
Brza – Vreme potrebno da se ovakav preparat pregleda višestruko je kraće u odnosu na
pregled i računanje zbira po Nugentovoj metodologiji. Generalno, pregled preparata na manjem
uvećanju je neuporedivo brži pre svega zahvaljujući činjenici da se mikrometar i izoštravanje
slike koriste mnogo ređe nego na većim uvećanjima. Prema našim merenjima vreme potrebno
da pregledate 20 VP na pod imerzijom brojeći pri tome bakterijske morfotipove i računajući
Nugentov numerički skor je vreme za koje možete pregledati najmanje polovinu površine
preparata na uvećanju x200. Nema potrebe za standardizacijom površine vidnog polja jer je
metodologija semikvantitatvna a površina koju gledamo neuporedivo veća. S obzirom na veliku
površinu istovremeno se povećava verovatnoća da pod mikroskopom detektujemo prisustvo C.
albicans, T. vaginalisa lii drugih ćelijskih formi od interesa (PMN). Ovakvim prisustvom
detektuje se i prisustvo nekih drugih bakterijskih formi koje bi mogle biti od značaja za stanje
vaginalne flore, kao što je to slučaj sa formama koje su u ovom radu nazvane bifido i lepto.
Lako se uvodi u svakodnevnu kliničku praksu - Ovakav pristup omogućio bi na neki
način kombinaciju kliničkog nalaza koji su bili privilegija Amselovih kriterijuma i nalaza
mikroskopskog preparat bojenog po Gramu. Ono što je nedostatak, svakako je potreba da se
organizuje bojenje preparata po Gramu, a što je ranije rađeno uglavnom u mikrobiološkoj
laboratoriji. Naša iskustva govore da to nije nimalo komplikovano i da se može vrlo lako
organizovati prostor i obučiti osoblje, tako da lekar u veoma kratkom vremenu dobije preparat
obojen po Gramu. Odnosno, vreme koje “potrošite” na pripremu mikroskopskog preparat,
višestruko će vam se vratiti, čak ukoliko se i poredite sa pregledom NPVS. U našoj sada već
svakodnevnoj kliničkoj praksi to izgleda ovako: Na početku pregleda uzima se vaginalni bris,
uradi test sa 10% KOH i odredi vaginalni pH. Sušenje, fiksiranje i bojenje preparata ne traje
duže od 5-10 minuta, što je vreme za koje lekar završava pregled i upiše nalaz. Ovde želimo
takođe dodati da bojenje ne mora da podrazumeva relativno komplikovanu proceduru bojenja
po Gramu, nego se mogu primeniti i jednostavnije procedure, kao što je bojenje metilen plavim
ili samo gencijana violetom. Kako je za NP-6G metodologiju dužina i oblik ćelijskih formi
jedini parametar na osnovu kojih ih razlikujemo, i s obzirom na činjenicu da su i G. vaginalis
i L.iners Gram varijabilni, ukoliko ne želite praviti uporedne studije sa Nugentom, ovakav
241
pristup je jednostavniji i brži. Po završetku pregleda preparat obrišete ksilolom i može da se
koriti za dalja ispitivanja. Želimo naglasiti da pri ovom protokolu pored mikroskopskog nalaza
lekar zna subjektivne tegobe pacijentkinja, klinički nalaz, rezultat testa sa 10% KOH i vrednosti
pH vagine, što sve zajedno u određenim slučajevima može bitno uticati na konačnu dijagnozu,
odnosno odluku da li i kako lečiti pacijentkinju. Dakle za razliku od drugih protokola u kojima
pregled preparata po Gramu (Nugent, Ison/Hay, Claeys) uglavnom podrazumeva
mikrobiološku laboratoriju bez podataka o kliničkoj slici ili rezultatima pomenutih testova,
ovde se pregled preparata po Gramu radi u ordinaciji, tako da su šanse za ispravnu dijagnozu
mnogo veće nego u slučajevima kada kliničar za dan ili dva dobije nalaz mikrobiologa na kome
piše da je nalaz intermedijaran. U odnosu na Amselove kliničke kriterijume jasno je da je razlika
u mikroskopskom pregledu, Amsel podrazumeva pregled NPVS na uvećanju x400, zbog čega
ćemo uporediti i ova dva pristupa. Mikroskopski pregled NPVS svakako je brži i jednostavniji
metod u odnosu na postojeće, a i odnosu na NP-6G jer umesto bojenja preparata po Gramu,
razmažete bris na pločicu stavite kap fiziološkog rastvora, prekrijete pokrovnim stakalcem i
odmah mikroskopirate. Sve ovo izgleda stvarno brzo i jednostavno, ali posle 15 godina iskustva
u gledanju NPVS, na najrazličitijim mikroskopima, slobodni smo reći da to uvek i nije baš tako
brzo ni tako jednostavno. Prvo da bi ste mogli da gledate NPVS treba da imate da imate fazni
kontrast na uvećanju x400, jer je sve ostalo mnogo mukotrpnije i manje precizno., dok je za
NP-6G dovoljan svaki mikroskop sa uvećanjem x200. Međutim i kada imate fazno kontrastni
kap fiziološkog rastvora (a posebno nekoliko kapi više) prave problem jer na neki način morate
čekati da se preparat “smiri” jer svi ćelijski elementi plivaju. Pitanje koliko ova jedna kap (koja
pod mikroskopom deluje kao poplava u ekosistemu) može “razblažiti” čitav preparat i uticati
na procenu kvantifikacije pojedinih ćelijskih elemenata, odnosno koliko ga čini uporedivim sa
preparatom po Gramu (na kome nema kapi fiziološkog rastvora) ostavljamo budućim
istraživačima. Pored toga, fazni kontrast u ovakvim situacijama daje mnogo optičkih
“artefakata” tako da vrlo često morate da pomerate mikrometar da bi ste dobili dobru sliku, što
sve značajno produžava vreme pregleda, za razliku od preparat bojenog po Gramu i pregleda
na uvećanju x200 gde mikrometar koristite veoma retko zbog čega u istom vremenu možete da
pregledate neuporedivo veću površinu preparata. Takođe, na osnovu dosadašnjeg iskustva
mislim da je na uvećanju x400 mnogo teže izdiferencirati ŠF od NŠF jer se na ovom uvećanju
i forme dužine 1 μm prikazuju kao štapići, a prilikom pregleda NPVS nema mogućnosti da
preparat po potrebi pogledate na uvećanju x1000, kao što je to slučaj kod NP-6G. Ukoliko želite
da dijagnostikujete CA, neophodno je da na drugom preparatu dodate kap 10% KOH, ili to
uradite po završetku pregleda na istom preparatu. I na kraju to što ste videli ukoliko nemate
242
kameru ne možete da arhivirate i koristite za dalji naučno istraživački rad. Naravno da
navedene prednosti tehničke prednosti NP-6G u odnosu na postojeće predstavljaju uglavnom
subjektivne kategorije i da je za njihovu verifikaciju potrebna verifikacija od strane drugih
istraživača. Ono što je svakako značajnije, a srećom i uporedivije jesu rezultati mikroskopskog
pregleda dobijeni korišćenjem različitih dijagnostičkih procedura. Takođe verujemo da bi drugi
ispitivač na osnovu Nugentovih kriterijuma značajan broj ovih pacijentkinja svrstao u grupu
intermedijarnih nalaza. Podatke koje smo mi dobili, saglasni su rezultatima interobservacione
studije koji su pokazali da su najveća neslaganja među ispitivačima upravo kod mikroskopskih
nalaza koji imaju mali broj ćelijskih elemenata.
3.5
pH VAGINE U PROCENI STANJA VAGINALNOG EKOSISTEMA
U uvodu smo ukazali na neka pitanja koja su proistekla iz rezultata molekularnobioloških
studija od kojih su za kliničara najvažnija dva. Prvo, da li je četvrtina žena koje nemaju
predominantnu laktobacilarnu floru zdrava ili bolesna? Drugo, da li su vrednosti vaginalnog pH
preko 4,5 zdrave (nalazimo ih kod 50% zdravih pacijentkinja) [169, 474, 475]. U uvodu smo i
pomenuli da ove činjenice navode na preispitivanje vrednosti Nugentovih i Amselovih
kriterijuma.
Pre nego što u ovom delu diskusije pokušamo na osnovu dobijenih rezultata da odgovorimo na
pitanje koje se odnosi na granične vrednosti pH, želimo da ukažemo na neke važne evolucione
podatke.
Tabela 3.17: distribucija pH kroz rase
RASA
Srednja vrednost pH±SD
Medijana pH±MAD
Belci
4,5±0,66
4,4±0,59
Crnci
4,7±0,66
4,7±1,00
Hispano
4,8±0,64
5,0±0,74
Azijati
4,6±0,64
4,4±0,59
UKUPNO
4,7±0,76
4,4±0,59
*Trenutna procena vrednosti vaginalnog pH je: Nisi normalan ili nisi zdrav, a nije važno da li si Hispano ili Crnac
Prvi, i veoma bitan podatak odnosi se na činjenicu da se vaginalna sredina u humanoj populaciji
značajno razlikuje od drugih vrsta [476]. Tako, za razliku od većine sisara, uključujući tu i
primate, ili laboratorijskih životinja (miševi, pacovi, zečevi) čiji se vaginalni pH kreće oko
neutralnog, normalan pH vagine je obično <4,5, za šta je priroda svakako imala svoje razloge
[476]. Ako znamo da vaginalni pH bitno utiče na sastav i koncentracije različitih metabolita
(uslovi sredine, ishrana) od čega u velikoj meri zavisi mikrobna flora ekološke zajednice, kao i
već pomenute interakcije između njenih pojedinih članova, onda je jasno koliki je uticaj ovog
243
parametra na sastav i stanje vaginalne flore. Priroda nije bez nekog razloga odlučila da vagina
bude slabo prokrvljen organ koja će dobijati kiseonik difuzijom iz submukoznog tkiva, a
svakako da je jedan od razloga što je to tako i činjenica da se na ovakav način obezbeđuju
anaerobni uslovi, odnosno favorizuje naseljavanje uglavnom anaerobima. Takođe se potrudila
da ćelije vaginalne sluznice budu među retkim u organizmu kojima nije potreban insulin za
ulazak glukoze, da bi ih učinila sposobnim da u procesu anaerobne glikolize stvaraju mlečnu
kiselinu, odnosno održavaju kiselu vaginalnu sredinu. Ništa manje važni nisu ni podaci koji
ukazuju da je kolonizacija bakterijama koje produkuju mlečnu kiselinu karakteristična za
ljudski vrstu i da se razlikuje od drugih sisara uključujući tu i primate. Kako verovatno samo
vaginalne ćelije nisu u stanju da održavaju pH kiselim, naseljavanje vagine i izbor stanovnika
podrazumevao je da prednost imaju oni koji produkuju mlečnu kiselinu, dakle različiti sojevi
laktobacila. Pored laktobacila, kao što smo već pominjali, i neke druge bakterije mogu da
produkuju mlečnu kiselinu (Atopobium, Megasphaera, Leptotrichia). Potrebna su dalja
istraživanja da bi se utvrdio značaj ovih (verovatno i mnogih drugih) bakterija na vrednosti
vaginalnog pH, jer svaki mikroorganizam sposoban za anaerobnu glikolizu produkuje mlečnu
kiselinu. Tako je ukupna produkcija mlečne kiseline zbir one koju produkuju epitelne ćelije i
različite vrste bakterija, a mišljenja o tome čija je uloga važnija su podeljena. Najnovija
ispitivanja ukazuju da epitelne ćelije vagine luče samo L-izomer mlečne kiseline, dok bakterije
luče i D i L-mlečnu kiselinu, a Boskey i sar. su u vagini našli mnogo veće koncentracije Dmlečne kiseline i zaključili da bakterije predstavljaju glavni izvor mlečne kiseline [477]. Ipak,
pad pH u periovulatornom periodu, ili činjenica da je pH vagine niži u forniksu nego u srednjoj
i disatalnoj trećini, govori više u prilog tome da važniju ulogu u regulisanju vaginalnog pH
imaju EĆ, odnosno faktori domaćina [169, 470, 473, 474-476].Witkin i sar. [476] su pokazali
da su koncentracije vaginalnog induktora ekstraćelijske matriks metaloproteinaze (EMMPRIN
) zavise ne samo od sastava mikrobne zajednice nego i od koncentracija i odnosa D i L-izomera
mlečne kiseline. Ovi izomeri kao signalni molekuli utiču na gensku ekspresiju domaćina,
dovode do povećanja koncentracija EMMPRIN a on indukuje produkciju MMP-8, poremećaja
244
u ekstraćelijskom matriksu grlića čime je olakšan ascedentni put bakterijama nastanak IUU i
PP.
Slika 3.63: Vaginalni mikrobiom kroz život
Ranije se smatralo da produkcija hidrogen peroksida predstavlja čak i važniji faktor u odbrani
od različitih patogena od mlečne kiseline, međutim novija ispitivanja nisu potvrdila takve
nalaze, a Hanlon i sar. su pokazali se da je H2O2 toksičniji za laktobacile nego za drugih 17
vrsta BVAB [478]. Oni su ukazali na širok spektar antimikrobnih aktivnosti laktobacilarne
flore, kao i da laktobacili najverovatnije predstavljaju najvažniji izvor mlečne kiseline u vagini.
Ovo je u skladu sa dobro poznatim činjenicama o odsustvu laktobacila i niskim koncentracijama
245
mlečne kiseline, odnosno povećanim vrednostima vaginalnog pH kod pacijentkinja sa BV.
Mlečna kiselina se za razliku od H2O2 produkuje u hipoksičnim uslovima u vagini, nema štetne
efekte na laktobacile, ne može biti neutralisana cervikalnim sekretom, a deluje mikrobicidno na
BVAB, zbog čega Bai i sar. [479] smatraju najvažnijim pojedinačnim faktorom u odbrani od
različitih patogena [477-481]. Dodaćemo još neke argument koji brane našu hipotezu, a koji se
opet odnose na savršenosti prirode u regulisanju vrednosti pH vagine. Izgleda da kontrola i
regulacija pH vagine počinje rađanjem i traje ceo život. Tokom i neposredno posle porođaja
estrogeni poreklom od majke omogućavaju bogatstvo vaginalnog epitela glikogenom, odnosno
naseljavanje i rast mikroorganizama koji produkuju mlečnu kiselinu [482].Ovi mikroorganizmi
i kisela sredina verovatno štite novorođenče tokom i neposredno posle rađanja od poremećaja
vaginalne flore i nastanka infekcije. Kratko potom i u ranom detinjstvu pa sve do perioda
menarhe pH vagine je neutralan do blago alkalan, a broj mikroorganizama koji produkuju
mlečnu kiselinu značajno manji [483]. Onoga trenutka kada počinje potencijalno “opasni”
period počinje proces ponovne acidifikacije vagine. Porast estrogena će dovesti do porasta
glikogena u vaginalnim EĆ i kolonizacije florom koja će produkovati mlečnu kiselinu [484].
Tako, ako znamo da krv predstavlja idealnu podlogu za veliki broj mikroorganizama, onda je
jasno da bi menarha, bez prethodne acidifikacije vagine, verovatno predstavljala potencijalnu
opasnost za nastanak vaginalnih infekcija i drugih komplikacija. Posle toga dolazi period u
kome se povećavaju rizici za poremećaj vaginalne flore (seksualna aktivnost), što je još jedan
alarm da se odbrambene snage pojačaju. Podatke Shafera i sar. [485]
po kojima su
adolescentkinje koje su imale seksualne odnose imale dvostruko veću kolonizaciju vagine
laktobacilima od vršnjakinja koje nisu imale seksualne odnose, mogli bismo tumačiti kao još
jedno “razumevanje” prirode koja sa povećanjem rizika, povećava broj bakterija koje mogu
produkovati mlečnu kiselinu [485]. Ulaskom žene u menopauzu, odnosno prestankom funkcije
gonada, dolazi do pada glikogena u EĆ i smanjenja broja laktobacila, smanjene acidifikacije
vagine i porasta pH vagine, što omogućava kolonizaciju i razvoj patogenih bakterija [486, 487].
Studija Gupte i sar. [487] o uticaju hormonske supstitucione terapije na pH vagine i sastav
vaginalne flore ukazuju da estrogeni imaju odlučujuću ulogu. I rezultati molekularnih studija
ukazuju da HRT, povećava kolonizaciju laktobacilima i smanjuje vaginalni pH, dok je kod žena
koje ne koriste ovu terapiju pH vagine značajno viši, a vaginalna flora slična onoj kod BV [486,
488, 489]. Dakle estrogen, kao najvažniji ženski hormone, upravlja većinom promena u
organizmu žene i pod svojom kontrolom drži depoe glikogena, produkciju mlečne kiseline,
održavanje kiselog pH vagine i naseljavanje odgovarajućim mikroorganizmima. Vaginalna
246
mukoza prolazi kroz ciklične promene proliferacije, sazrevanja i deskvamacije EĆ koji traje
oko 96 sati. Normalni vaginalni epitel ima veliku metaboličku aktivnost i proizvodi na stotine
različitih hemijskih supstanci, a energiju za ove procese u najvećoj meri obezbeđuje se
metabolizmom glukoze. Depoi glukoze u obliku glukogena nalaze se u EĆ i u stanjima kada je
ćeliji potrebna energija glikogen se razgrađuje u glukozu, i u procesu anaerobne glikolize
oslobađa se energija i produkuje mlečna kiselina, koja izlazi iz ćelije i nagomilava se u
ekstracelularnom prostoru i tako predstavlja jedan od najvažnijih odbrambenih faktora. Tako
su najnovija ispitivanja pokazala da mlečna kiseline (pored acidifikacije vagine) ima specifična
imunološka svojstva. Tako L-mlečna kiselina pod određenim uslovima dovodi do produkcije
proinflamatornih citokina u kulturi humanih vaginalnih ćelija koji potom aktivišu TLR3 na tim
ćelijama. Ovakav imunski odgovor specifičan je za prisustvo L-mlečne kiseline i dešava se
samo u uslovima kisele sredine, jer nestaju dodavanjem sirćetne ili neutralizacijom mlečne
kiseline. Veruje se da su i mnoga druga imunološka dešavanja zavisna od pH sredine i prisustva
mlečne kiseline [490].
Kisela vaginalna sredina je posledica evolucionih procesa samo što mi u ovom trenutku
verovatno nedovoljno razumemo njen pravi značaj. Međutim, istraživači su uglavnom okrenuti
novom i još neistraženom, smatrajući polja kiselosti vagine “iscrpljenim” za nove naučne
poduhvate. I u svakodnevnoj kliničkoj praksi malo je ginekologa koji koriste ovaj test ili ga
smatraju vrednim u definisanju stanja vaginalne flore. Naravno, ovakvom stavu doprinose i
stručni radovi koji ukazuju “na nisku specifičnost i senzitivnost” ovog testa u dijagnozi
poremećaja vaginalne flore. Verujemo da neki evoluciono očuvani mehanizmi obezbeđuju da
se vaginalni pH održi kiselim i da bi prelazak neke granice ukazivao na potencijalno rizična
dešavanja pre nego mikroskopski pregled ili čak i nalaz PCR sa velikim brojem prajmera.
Verovatno se tek prelaskom te granice stvaraju preduslovi za nastanak patološke vaginalne
flore. Dakle, bez obzira kakav je sastav mikrobiološke zajednice vagine (broj i vrsta
mikroorganizama), sve dok je vaginalni pH u zoni kiselog, to najverovatnije znači da
metabolički odnosi između samih bakterija i domaćina nisu poremetili jedan od najvažnijih
odbrambenih mehanizama vagine, te je rizik ili samo postojanje patološkog stanja malo
verovatno. Iz ove diskusije je isključena infekcija CA. Suštinsko pitanje je možemo li
pacijentkinji koja ima vrednost pH 5,5 reći da je zdrava na osnovu postojećih mikroskopskih,
mikrobioloških i molekularnobioloških oruđa kojima raspolažemo, ili se moramo upitati da ne
postoje nešto što izmiče postojećim dijagnostičkim procedurama i našim dijagnostičkim
protokolima. Zbog toga su podaci koje smo dobili u ovom ispitivanju, a koji pokazuju da su
pacijentkinje sa nalazom LEPTO i BIFIDO formi imali vrednosti pH preko 4,5, još značajniji.
247
Verujemo da neki evoluciono očuvani mehanizmi obezbeđuju da se vaginalni pH održi kiselim
i da bi prelazak neke granice ukazivao na potencijalno rizična dešavanja pre nego mikroskopski
pregled ili čak i nalaz PCR sa velikim brojem prajmera. Verovatno se tek prelaskom te granice
stvaraju preduslovi za nastanak patološke vaginalne flore. Dakle, bez obzira kakav je sastav
mikrobiološke zajednice vagine (broj i vrsta mikroorganizama), sve dok je vaginalni pH u zoni
kiselog, to najverovatnije znači da metabolički odnosi između samih bakterija i domaćina nisu
poremetili jedan od najvažnijih odbrambenih mehanizama vagine, te je rizik ili samo postojanje
patološkog stanja malo verovatno. Iz ove diskusije je isključena infekcija CA. Suštinsko pitanje
je možemo li pacijentkinji koja ima vrednost pH 5,5 reći da je zdrava na osnovu postojećih
mikroskopskih, mikrobioloških i molekularnobioloških oruđa kojima raspolažemo, ili se
moramo upitati da ne postoje nešto što izmiče postojećim dijagnostičkim procedurama i našim
dijagnostičkim protokolima. Zbog toga su podaci koje smo dobili u ovom ispitivanju, a koji
pokazuju da su pacijentkinje sa nalazom LEPTO i BIFIDO formi imali vrednosti pH preko 4,5,
još značajniji. Podsetićemo na činjenicu da je srednja vrednost pH i kod pacijentkinja iz LEPTO
grupe bila preko 4,5, što na neki način nije u skladu sa činjenicom da je mlečna kiselina krajnji
produkt Leptotrichia. Međutim, treba se prisetiti da je najveći broj pacijentkinja iz te grupe bio
u grupi NULL (niska celularnost) što bi značilo da je kod ovih pacijentkinja značajno smanjen
i broj laktobacila, odnosno da u krajnjem, kapacitet domaćina i postojeće bakterijske flore
nemaju kapacitet da pH održe u zoni kiselog, a odsustvo clue ćelija ili niske koncentracije G.
vaginalis i A. vaginae određene qPCR svakako nam ne bi dali za pravo da ovu pacijentkinju
proglasimo zdravom ili bez rizika za PP. I pacijentkinje iz grupe BIFIDO imali su pH 4,6 a
kako je najveći broj ovih pacijentkinja na osnovu mikroskopskog nalaza NPVS proglašen
zdravim (ove pacijentkinje su bile zdrave i u našim prvim gledanjima preparata po Gramu) ovo
je najbolja praktična potvrda našeg prethodno iznesenog stava da povećane vrednosti pH mogu
govoriti u prilog patološkog stanja koje izmiče mikroskopskom pregledu NPVS ili preparata
bojenog po Gramu. Pomenuta studija Sha i sar. [455] je najbolji primer da su vrednost pH
mnogo bolje procenjuju stanje vaginalne flore jer je na osnovu Amselovih kriterijuma dijagnoza
BV postavljena kod 77 od 203 pacijentkinje kod kojih je dijagnoza postavljena na osnovu
Nugentovih kriterijuma. Vrednosti specifičnosti (69%) i senzitivnosti (83%) pH> 4.5 u toj
studiji, u odnosu na Nugenta kao zlatni standard, ustvari najrealnije odražavaju broj
pacijentkinja sa nekim poremećajima vaginalne flore, odnosno da na osnovu Nugentovih
kriterijuma sigurno je značajan broj pacijentkinja lažno pozitivnih. Korektnije rezultate bi
verovatno dobili ukoliko bi u statističkoj analizi pH bio zlatni standard, a Nugentov metod
“test” čiju vrednost ispitujemo. Pored velikog broja primera koji su navedeni od uvoda preko
248
metodologije i diskusije, a koji se odnose na mane Nugentovih kriterijuma ovde ćemo
komentarisati i odličnu studiju Menard i sar. [491] u kojoj autori ispituju mogućnost da na
osnovu koncentracija (loads) Gardnerella vaginalis i Atopobium vaginae dijagnostikuju BV ali
koja, s druge strane, govori mnogo i o Nugentovim kriterijumima i prethodno pomenutim
nedoumicama. Kao i u većini drugih, i u ovoj studiji su Nugentovi kriterijumi bili zlatni
standard na osnovu kojih je 167 uzoraka procenjeno kao normalna flora, 44 su imale
intermedijaran nalaz, dok je kod 20 pacijentkinja dijagnostikovana BV. Oni su u ovoj studiji
pokazali da kombinacija koncentracije A. vaginae izražene kao broj DNA kopija/ml (≥108) i
G. vaginalis (≥109 kopija/ml) imaju senzitivnost i specifičnost 95%, odnosno 99%. Treba
uočiti da u ovoj analizi nedostaju pacijentkinje sa intermedijarnim nalazom. Autori u diskusiji
ukazuju da molekularni kriterijumi imaju nisku pozitivnu prediktivnu vrednost (73%), što
ukazuje da su neki slučajevi kod kojih je postavljena „molekularna“ dijagnoza bakterijske
vaginoze (5,5%) bile lažno pozitivni. Iako su u konkretnom slučaju (5,5%) ove pacijentkinje
imale potpuno isti molekularni obrazac kao i pacijentkinje sa BV, analizirane su kao lažno
pozitivne. Autori [491], kao i mi uostalom, ukazuju na mogućnost da se radi o stvarno
pozitivnim
koje nisu dijagnostikovane tradicionalnim
dijagnostičkim
procedurama.
Molekularni metod je mnogo objektivniji od gledanja preparata po Gramu i teško je verovati
da je kod 5,5% slučajeva „pogrešno izbrojao“ kopije DNA (mašina). Kada smo kod brojanja
onda je mnogo verovatnije da onaj koji je brojao ćelijske morfotipove (čovek) pogreši u odnosu
na onoga ko je brojao kopije DNA. Još važnije pitanje od samog broja je pitanje: šta je brojano?
Najnovija molekularno biološka oruđa ne mogu zameniti kopije DNA (prajmer) naprimer, L.
inersa i G. vaginalis, a mi možemo da brojimo L.iners kao G. vaginalis i obrnuto. Dakle,
verovatnije je da je onaj koji je gledao preparat po Gramu u ovim slučajevima G. vaginalis
brojao kao laktobacile i tako postavio dijagnozu normalnog nalaza. Jasno je da bi rezultati pH
kod ovih 5,5% pacijentkinja bili “lažno pozitivni”. U literaturi smo i ranije često nailazili na
podatke u kojima su se vrednosti senzitivnosti i specifičnosti pH vagine u dijagnozi BV
dramatično razlikovale. Tako su u svojoj studiji Pastore i sar. [492] kod 22% žena sa BV
izmerili normalne vrednosti pH, a kod 57% žena sa pH ≥4.5 nisu dijagnostikovali BV, dok je
kod Zodizka i sar. [493] specifičnost i senzitivnost u dijagnozi BV iznosila 85% i 100%,
respektivno. Treća bi mogla biti već analizirana studija Sha i sar. [455] u kojoj je senzitivnost
bila 83%, a specifičnost 69%. Metodološke razlike su najverovatniji uzrok razlika u
zaključcima. I u našem ispitivanju, bilo da se radi o međusobnoj podudarnosti različitih
dijagnostičkih metoda, bilo da se radi o vrednosti KOH testa, ili određivanja vaginalnog pH,
mogli bi uvek zaključiti isto: Najveća podudarnost ili korelacija i dobri rezultati koji se dobiju
249
u ovakvim statističkim analizama posledica su podudarnosti rezultata u grupama NF ili BVF
(koji su uvek najbolji). Ti rezultati su značajno slabiji u grupi pacijentkinja sa hipocelularnim
razmazom. Dakle na osnovu dobijenih rezultata mi bi svakako mogli zaključiti, da vrednosti
pH u proceni stanja vaginalne flore (izuzimajući infekciju CA) imaju najveću pojedinačnu
vrednost, i da verujemo (u procentima koji su veći nego oni prikazani na ROC krivi) da u
slučajevima kada kod pacijentkinje detektujemo vrednosti pH>4,8 možemo sa 99 %
verovatnoćom reći da je došlo do “nekog” poremećaja stanja vaginalne flore, i takvoj
pacijentkinji treba da pristupimo sa maksimalnom ozbiljnošću i opreznošću. Činjenica da mi u
ovom trenutku ne raspolažemo dijagnostičkim oruđima ili ne prepoznajemo takve poremećaje
u svakom slučaju nas ne oslobađa odgovornosti i pokušaja da pomognemo. Možemo sa velikom
sigurnošću da tvrdimo da je u takvim slučajevima indikovana acidifikacija vagine i primena
prebiotika, jer se radi o postupcima koji ne mogu naškoditi pacijentkinjama. Verovatnoća da
ćemo kod pacijentkinje sa BVF imati pH<4,4 praktično je nikakva. Tako u našem ispitivanju
od 66 pacijentkinja sa BV (bez CA), samo su tri imale pH 4,4. Naknadno smo analizirali
mikroskopske preparate ovih pacijentkinja i verujemo da smo u sva tri slučaja postavili
pogrešnu dijagnozu, odnosno da smo za razliku od slučaja u Menardovoj studiji veliki broj L.
inersa videli kao G. vaginalis, i postavili dijagnozu BV, a s obzirom na naš klinički stav sve tri
su lečene, a možda, nepotrebno. Sporna i najteža, treća grupa, kao da ponovno traži da, posle
toliko godina dominacije BV na “ginekološkoj sceni”, najzad neko i na nju obrati pažnju. Čini
se da bi kapacitet produkcije mlečne kiseline bio primaran kod ovih pacijentkinja.
Pretpostavljamo da normalne vrednosti pH (mislimo na manje od 4,5) kod pacijentkinja sa
ovakvim mikroskopskim nalazom na neki način ukazuju na normalno, ili kao što smo ranije
pominjali tranziciju u vaginalnoj flori koja bi trebala da ide ka zdravom, dok u slučaju sa
patološkim vrednostima pH ta tranzicija bi mogla da ide u suprotnom smeru. U svakom slučaju
u svakodnevnom kliničkom radu najveći broj pacijentkinja bio je lečen kombinacijom
prebiotika i acidifikacije. Da je ovakav pristup poželjan ukazuju i rezultati našeg ispitivanja koji
se odnose na grupu BIFIDO i PP, jer kao što smo već opomenuli pacijentkinje sa mikroskopski
detektovanim BIFIDO formama imale su najveći rizik od PP, i uz pacijentkinje sa kraćim
grlićem, gde je taj rizik bio značajno manji (vidi kasnije), predstavljaju jedina dva parametra
koji su pokazali povećan rizik za PP.
Na osnovu rezultata pomenutih molekularnobioloških studija i vrednosti pH poslednjih
godina se u literaturi sve češće sreću radovi koji ili u analizi podataka ili tokom ispitivanja
pomeraju granicu pH na 4,7 a neki i na 5, često i u zavisnosti od etničke pripadnosti jer su
rezultati pomenutih molekularnobioloških studija i merenja vaginalnog pH pokazale da
250
crnkinje i latinoamerička populacija imaju više vrednosti pH (Tabela 3.7). Zbog toga je u analizi
statističkih podataka posle regresione analize na osnovu N/T odnosa određivana granična
vrednost (Tabela 3.8).
Kada je pH 4,8 poremećaje u vaginalnoj flori detektujemo kod 91,2% (senzitivnost)
slučajeva, pri čemu je 9,3% lažno pozitivnih (specifičnost 90,7%) iz čega možemo zaključiti da
test ima korektnu senzitivnost i specifičnost. Dakle, kriva za graničnu vrednost 4,8 izgleda kao
u donjem grafikonu.
PH
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
2,500
3,750
4,200
4,500
4,650
4,850
5,150
5,400
5,600
5,750
5,900
7,000
Grafikon 3.43: Grafikon senzitivnost specifičnost za pH
251
Tabela 3.18: Granične vrednosti N/T ratio
pH
.........
4,20
4,50
4,65
4,85
.........
pH
.........
4,20
4,55
4,65
4,85
.........
Senzitivnost
.........
1,00
0,97
0,97
0,91
.........
Senz.
.........
0,95
0,87
0,87
0,75
.........
Specifičnost
..........
0,48
0,79
0,80
0,91
..........
Spec
..........
0,51
0,79
0,80
0,90
..........
Grafikon 3.44: ROC kriva pH
Pri pH 4,5 senzitivnost i specifičnost su približno jednaki. Drugim rečima, kod pH 4,55
senzitivnost je 87,3 %, a specifičnost 79,5%.
Na osnovu dobijenih rezultata možemo da zaključimo da je u našem ispitivanju vrednost
pH pokazala najbolje rezultate u predikciji poremećaja vaginalne flore kao i da je u populaciji
252
srpskih trudnica granična vrednost pH vagine ˂4,5 optimalna. Tako treba postupati i u
svakodnevnoj kliničkoj praksi. Dosadašnja praksa u kojoj se procena vrednosti pH zasnivala na
poređenju u kome je pH uvek test, a različite podele zlatni standard, neće nam pokazati njegovu
stvarnu kliničku vrednost. Najbolji primer za to su trudnice sa BIFIDO formama, koje smo na
osnovu pregleda NPVS proglasili zdravim, a povišene vrednosti pH bi se onda mogle tumačiti
kao lažno pozitivne. Naprotiv, mislimo da gotovo sve pacijentkinje sa vrednostima pH˃ 4,5
imaju neki poremećaj vaginalne flore koje, na osnovu postojećih dijagnostičkih kriterijuma i
postupaka, previđamo. Po nama, vaginalni pH kao pojedinačni parametar ima veću vrednost u
razlikovanju zdravog i patološkog stanja vaginalne flore u odnosu na postojeće dijagnostičke
metode i sve druge pojedinačne parametre. Odgovor na pitanje sa početka ove diskusije je da
vrednost preko 4,5 uvek treba smatrati patološkim, čak i u slučajevima kada nam je klinički
nalaz uredan i mikroskopska slika izgleda (“liči”) na normalnu. I u takvim slučajevima potreban
je oprez kliničara, a kao što smo već pominjali za druge “granične” slučajeve, acidifikacija
vagine i primena prebiotika ne bi trebalo da naude pacijentkinji. Potrebna su dalja i detaljna
ispitivanja ove grupe pacijentkinja da bi se procenila prava vrednost ovog testa u kliničkoj
praksi, jer na osnovu rezultata našeg ispitivanja on bi mogao da se koristi ne samo u dijagnozi
BV, nego bi kao skrining mogao da izdvoji grupu pacijentkinja koja nema BV, imam povišen
pH, i po našim rezultatima značajno veći rizik za PP.
3.6
VREDNOST NALAZA KULTURE CERVIKOVAGINALNOG BRISA
Danas znamo da na mikroskopskom preparatu ima oko 95% mikroorganizama koje ne možemo
kultivisati, to znači da su nam njihove fenotipske karakteristike potpuno nepoznate. Na osnovu
ovih podataka možemo tvrditi da na mikroskopskom preparatu vidimo koke koje se ne mogu
kultivisati. Potvrdu ovakvom stavu nalazimo i u ekološkim ispitivanjima koja se bave
proučavanjem mnogo složenijih mikrobnih zajednica nego što je mikrobiom vagine i u kojima
je odavno opisan fenomen “great plate count anomaly”, što znači da se preko 99%
mikrobioloških vrsta koje vidimo pod mikroskopom ne može kultivisati u laboratoriji. Preparat
po Gramu bi pre mogao biti “zlatni standard” na osnovu koga bi se procenjivala vrednost
kulture, dakle potpuno suprotno čestom stavu kliničara u kome se negativan nalaz kulture
poistovećuju sa zdravim, a pozitivan nalaz sa bolesnim. Zato je jedan od ciljeva ovog ispitivanja
bio da pokažemo da kultura cervikalnog i vaginalnog brisa nema vrednost u svakodnevnoj
kliničkoj praksi, i da bi češća primena jednostavnih i brzih postupaka, kao što su mikroskopski
pregled NPVS, određivanje vaginalnog pH i test sa 10% KOH, dovela do mnogo boljih rezultata
253
u dijagnozi i lečenju vaginalnih infekcija, i prevenciji ozbiljnih komplikacija do kojih one mogu
dovesti. Godinama unazad Wiesenfeld i Macio [494]. ukazuju na iznenađujuće retku upotrebu
jednostavnih postupaka kao što su mikroskopski pregled NPVS, test sa 10% KOH, i
određivanje vaginalnog pH u dijagnozi najčešćih vaginalnih infekcija, kao i na činjenicu o
relativno visokom procentu pacijentkinja (u njihovoj studiji 17% prva citirana) kod kojih je
uziman bris na vaginalnu kulturu, s obzirom na njegovu sumnjivu vrednost u dijagnozi
vaginalnih infekcija. U Srbiji je kultura vaginalnog i cervikalnog brisa je još uvek vrlo čest
postupak u svakodnevnoj praksi, dok se pomenute jednostavne i brze procedure koriste veoma
retko. Nemogućnost kultivacije većine mikroorganizama nije začuđujuća ako razumemo da
smo jedan mikroorganizam izmestili iz njegove prirodne sredine u kojoj je imao optimalnu
količinu
hranljivih
materija,
nivo
kiseonika,
temperaturu,
pH,
prisustvo
drugih
mikroorganizama, u novu veštačku gde bi morali da mu obezbedimo bar slične uslove da bi
preživeo i rastao. Imajući u vidu ove činjenice,
rezultati koji dobijemo standardnom
mikrobiološkom kulturom (bez korišćenja specijalnih transportnih medijuma i podloga,
anaerobnih uslova, kokultivacija i sl.) mogli bi da se tumače i kao sposobnost nekog
mikroorganizma da opstane u novim uslovima, odnosno da preživi metodologiju ispitivanja. U
prilog ovome govori i činjenica da su aerobi ili fakultativni anaerobi najčešći rezultat kulture
cervikalnog ili vaginalnog brisa, dok je s druge strane poznato da vaginu uglavnom kolonizuju
obligatni anaerobi. S obzirom da smo rezultate ovih ispitivanja kod 505 naših pacijentkinja
prikazali u našem radu pod naslovom: »Vrednost bakterijske kulture vaginalnog brisa u
dijagnozi vaginalnih infekcija« i da je on prihvaćen za štampu, zainteresovanog čitaoca
upućujemo na taj rad, a ovde ćemo samo ukratko izneti delove diskusije zaključke do kojih smo
došli [495]. Tako se na početku diskusije ukazuje da su pre više od 30 godina Hammerschlag i
sar. [496]. su objavili dve studije, kod devojčica starosti od 2 meseca do 15 godina, kod kojih je
rađena kultura vaginalnog brisa tradicionalnim mikrobiološkim metodama, koje su pokazale da
je vagina i u tom periodu, pored laktobacila, kolonizovana sa velikim brojem drugih bakterija
kao što su: Diphtheroids (78%), Staphylococcus epidermidis (73%), α-hemolytic streptococci
(39%), Escherichia coli (34%), Candida species (28%), U. urealyticum (27%), Klebsiella
(15%), Enterococcus species 10%, Group D streptococci (8.5%), S. aureus (7%), M. hominis
(6%), Haemophilus influenza (5%), Pseudomonas aeruginosa (5%), Proteus (5%).
Metodološki slične studije kod žena u reproduktivnom periodu pokazuju da se pored pomenutih
bakterija sa manjom ili većom učestalošću mogu izolovati i drugi aerobi ili fakultativni anaerobi
(Peptostreptococcus, Gardnerella, Bacteroides,Veillonella, Bifidobacterium itd) [497].
Naravno, izolacija bilo kog od pomenutih mikroorganizama znači samo njihovo prisustvo i
254
nikako ne podrazumeva kauzalnu povezanost sa bilo kakvim znacima ili simptomima kod
pacijentkinje. Rezultati našeg ispitivanja pokazuju da bi korišćenjem kulture cervikalnog i
vaginalnog brisa najveći broj pacijentkinja sa patološkom vaginalnom florom ostao
nedijagnostikovan i nelečen,
dok bi s druge strane neke pacijentkinje sa normalnom
vaginalnom florom zbog izolacije neke od bakterija verovatno bile nepotrebno lečene. Takođe,
za razliku od većine infektivnih bolesti koje se dijagnostikuje izolacijom ili identifikacijom
određenog mikroorganizma, najčešće i bez njegove kvantifikacije, kod BV kao polimikrobnog
sindroma nemamo pojedinačnog uzročnika, tako da su nalazi kulture (podrazumeva se i
izolacija G. vaginalis) praktično neupotrebljivi u dijagnozi ovog sindroma. Rezultati našeg
ispitivanja takođe pokazuju da bi samo primena dva jednostavna testa, merenje vaginalnog pH
i proba sa 10% KOH bila dovoljna da u najvećem broju slučajeva, ako ne postavimo preciznu
dijagnozu, onda svakako sa velikom verovatnoćom isključimo postojanje bolesti, ili izdvojimo
one koje treba uputiti na dalja ispitivanja. Dalje ispitivanje, u ovakvim slučajevima pre svega
podrazumeva mikroskopski pregled NPVS ili preparata po Gramu, a tek nakon toga (u malom
broju slučajeva) korišćenje drugih mikrobioloških i/ili molekularnih postupaka u cilju detekcije
specifičnih mikroorganizama (npr. C.trachomatis). Dakle, mikroskopski pregled NPVS i/ili
preparata bojenog po Gramu je još uvek najvažniji u evaluacija stanja vaginalne flore, i tako će
i ostati, sve dok se ne uspostave molekularna oruđa koja bi na personalnom nivou definisala
kvantitativni i kvalitativni sastav vaginalne flore, i možda preciznije definisala granicu između
normalnog i patološkog. Zaključak ove studije je da uprkos velikom broju činjenicama koje
nedvosmisleno ukazuju na malu (nikakvu) vrednost kulture vaginalnog i ili cervikalnog brisa u
kliničkoj praksi, iz nama neobjašnjivih razloga, ovo u našoj zemlji još uvek najčešća procedura
za procenu stanje vaginalne flore. S druge strane, i rezultati našeg ispitivanja pokazuju da
korišćenje samo dva jednostavna testa, dakle i u uslovima kada lekar nema ili nije obučen za
mikroskopski pregled, mogu kod najvećeg broja pacijentkinja isključiti postojanje infekcije, ili
ukazati na potrebu za daljim ispitivanjima. Ovakav pristup doveo bi do mnogo boljih rezultata
u dijagnozi, lečenju i prevenciji ozbiljnih komplikacije do kojih one mogu dovesti.
Naravno rezultati se nisu bitnije promenili ni kod 701 pacijentkinje (u odnosu na 505
pacijentkinja analiziranih u pomenutom radu) za koje smo imali nalaz kulture i kod 51 (7,2 %)
je kultura bila pozitivna i iz cervikovaginalnog brisa su izolovani: Staphylococcus coag. neg.
(n=15), Enterococcus (n=10), E. coli (n=7), Staphylococcus aureus (n=6) Streptococcus β
haemoliticus (n=5); G. vaginalis (n=5), Streptococcus viridans (n=2) i Proteus mirabilis (n=1).
Dakle, kulturom smo detektovali KOKE kod 5,4% (38/701) pacijentkinja, mikroskopskim
pregledom na uvećanju X1000 detektovali smo ih kod 6,4 % (45/704), a mikroskopskim
255
pregledom na uvećanju x200 kod 36,6% (258/704) uzoraka. Vrednost pH i KOH testa pokazala
se i značajnijim nego što je to izneto u pomenutom radu, i samo potvrdila da bi ova dva
jednostavna testa trebalo da se koriste kao skrining metode u dijagnozi vaginalnih infekcija,
kako u populaciji trudnica tako i generalno, što bi značajno doprinelo poboljšanju
reproduktivnog zdravlja naših pacijentkinja.
U ovom ispitivanju svim pacijentkinjama uziman je i cervikalni bris na prisustvo M.
hominis, U. urealyticum i C. Trachomatis, ali s obzirom na vrlo malu učestalost oko 1% (M.
Hominis) 3% (U. Urealyticum) i oko 2% C. Trachomatis ovi podaci nisu analizirani.
256
3.7
KONCENTRACIJE ISPITIVANIH CITOKINA
Citokini su proteina ili glikoproteina male molekulske mase koje sekretuju gotovo sve ćelije
organizma a čija je najvažnija ulogu održavanje međućelijskih komunikacija. Nije podela
citokina idealna s obzirom na njihove karakteristike i činjenicu da ih luče gotovo sve ćelije u
organizmu zbog čega ćemo navesti nekoliko najčešćih Tako ih možemo podeliti na one koji
učestvuju u celularnom (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, INF-γ,TGF-β, TNF-α)
ili humoralnom imunom odgovoru (IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, and IL-13) ili na Th1 i Th2 citokine
u kojoj Th2 ćelije luče uglavnom antiinflamatorne, a Th1 proinflamatorne citokine. Međutim
napredak nauke i otkrivanje novih citokina i njihove uloge i značaja u različitim imunskim
mehanizmima nameće potrebu za novim podelama. Tako smo i mi u ovom rada sve ispitivane
citokine načelno podelili na Th1 (IL-2, IFN-γ, IL-12 p70), Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13), Th17
(IL-17a, IL-22), Th9 (IL-9), proinflamacijske citokine (IL-1β, TNFα) i imunoregulatorni IL10. Podela na Th1, Th2, Th17 i Th9 govori samo o ćelijama koje predstavljaju dominatan izvor
određenog citokina, i o njegovoj ulozi u celularnoj ili humoralnoj imunskoj reakciji. Tako, Th2
ćelije luče uglavnom antiinflamatorne citokine (IL-3, IL-4, Il-5, IL-6, IL-10, IL-13), ali i manji
broj proinflamatornih citokina i hemokina ( IL-6, Il-8). Th1 ćelije primarno produkuju
uglavnom proinflamatorne i u manjim količinama antiinflamatorne citokine. Dakle jasno je da
pravu prirodu nekog citokina teško možemo sagledati iz informacije o pripadnosti nekoj od Th
ćelija. Reproduktivni imunolozi citokina najčešće dele na proinflamatorne, antiinflamatorne,
hemokini i polipeptidne faktore rasta. Nakon prepoznavanja antigena dolazi do aktivacije APC
i njihove migracije u sekundarne limfne organe, gde one aktiviraju naivne (TH0) ćelije koje se
dalje diferenciraju u različite subpopulacije: TH1, TH2, TH3, TH9, TH17, TFH, TReg ili
citotoksične T ćelije [33] Diferencijacija Th0 u ove subpopulacije zavisna je od mnogobrojnih
faktora, ali svakako da je jedan od bitnijih vrsta i koncentracija antigena, odnosno u našem
slučaju broj i vrsta mikroorganizama. Od istog faktora najviše zavisi i tip citokinske mreže koji
će se formirati, a u zavisnosti od citokinske mreže koja dominira tokom prezentacije antigena
zavisi u kom će pravcu krenuti diferencijacija Th0 ćelija. Odmah posle aktivacije citotoksični
T limfociti (CTL) su potpuno funkcionalni i spremni da upotrebe svoj arsenal oružja u cilju
eliminacije inficiranih ćelija. Aktivirane CD4+ T kao što im samo ime kaže, pomažu, aktivaciju
B-ćelija i CTL, ili tako što sekretuju citokine ili samim ćelijsko-ćelijskim kontaktima.
Istovremeno TH ćelije učestvuju u inicijaciji, održavanju i regulaciji urođenog imunskog
odgovora tako što dovode do aktivacije i regrutacije PMN, makrofaga, mast ćelija i monocita.
Dakle kombinacije različitih citokina su odlučujući faktor u diferencijaciji Th0 u različite
257
subpopulacije Th limfocita, a ponovićemo da one u najvećoj meri zavise od broje i vrsta
mikroorganizama koji se trenutno nalaze u vagini. Trenutno, zbog toga što su najnovija
molekularna ispitivanja pokazala veliku dinamičnost vaginalnog ekosistema na koju može da
utiče veliki broj endogenih i egzogenih faktora, a pretpostavljamo da ovakva dinamičnost
neminovno dovodi do promena u koncentracijama pojedinih citokina. Postojanje TH1 i TH2
subpopulacije je odavno poznato i dobro su proučeni mehanizmi koji dovode do diferencijacije
naivnih ćelija u jednu od ove dve subpopulacije. TH1 ćelije produkuju IFNγ i učestvuju u
ćelijski posredovanom imunskom odgovoru, uglavnom protiv intraćelijskih patogena. IFN-γ
produkuju uglavnom TH1 limfociti, CTL, NK-ćelije i makrofagi, dok TH2 subpopulacija
limfocita ne luči IFN-γ. Sve ove ćelije luče IFN- γ samo kada su aktivirane, odnosno kao deo
imunskog odgovora na IL-2, antigene, mitogene, aloantigene ili udružene efekte IL-12 i IL-18.
Produkciju IFN-gama inhibiraju IL-4, IL-10, TGF-beta, glukokortikoidi, vitamin D3. IFN-γ
promoviše specifične i nespecifične mehanizme odbrane domaćina od infektivnih agenasa.
Jedan je od najvažnijih citokina odgovornih za pojačanu ekspresiju MHC molekula klase I, i
indukciju ekspresije MHC molekula klase II na leukocitima i epitelnim ćelijama. Smatra se
najvažnijim citokinom u aktivaciji i regulaciji aktivnosti mononuklearnih fagocita i učestvuje
u regulaciji produkcije drugih imunomodulatornih i proinflamatornih citokina, kao što su TNFalfa i IL-12 [498]. TH2 ćelije produkuju IL4, IL5, IL13 i IL10 i njihove aktivnosti su vezane
uglavnom za humoralni imunski odgovor protiv različitih parazita. Ključni citokin koji
indukuje diferencijaciju TH naivnih ćelija u TH1 je IL-12, dok IL4 dovodi do indukcije
transkripcionog faktora GATA-3, sekrecije IL4, IL5 i IL13 i diferencijacije u TH2
subpopulaciju. Glavne efektorske ćelije TH1 imunskog odgovora su makrofagi, CTL, IgB B
ćelije i CD4 T ćelije koje produkuju IFNγ, a u TH2 imunskom odgovoru to su eozinofili,
bazofili, mast ćelije, IgE B-ćelije i CD4 ćelije koje produkuju IL4 i IL5. Poslednjih godina
međutim pokazano je postojanje još nekoliko T ćelijskih subpopulacija koje se razvijaju
nezavisno od TH1/TH2 puta. Treća subpopulacija nazvana je Th17 ćelijama, otkrivena je u
ispitivanjima autoimunih oboljenja, gde je pokazano da se razlikuje od klasičnog Th1/TH2 puta.
Transkripcioni faktori kao što su T-beta i GATA-3 koji u važni faktori regulacije TH1/TH2
diferencijacije, imaju negativne efekte na diferencijaciju TH17. TH17 ćelije sekretuju IL-17,
IL-1, TNF-α, IL-21 i IL-22 i posreduju u odbrani od ekstraćelijskih bakterija ili gljivica. IL-17
spada u grupu proinflamatornih citokina i značajan je faktor u etiopatogenezi različitih
inflamatornih oboljenja. IL-17 promoviše inflamatorne procese tako što indukuje produkciju
različitih proinflamatornih citokina i hemokina, MMP, regrutuje PMN, povećava produkciju
antitela i aktivira T ćelije. IL-23 koji produkuju dendritske ćelije povećava produkciju IL-17 u
258
kulturi T ćelija. IL-23 je heterodimeričan protein sa dve subjedinice, IL-23p19 i IL-12p40.
Precizno je regulisana ravnoteža između TH-17 i TREGs posebno na mukoznim površinama ,
a TGF-β je neophodan u diferencijaciji oba puta. Dakle, najvažniji citokin za razvoj TH17 tipa
imunskog odgovora je faktor transformacije rasta beta (TGF-β), zajedno sa IL-6, IL-17, IL-21,
IL-22, IL-1 i IL-23. Ova diferencijacija se pojačava u odsustvu IFN-γ i IL-4. IL-6 i IL-21
dovode do aktivacije tipičnog TH17 transkripcionog faktora RORγt, što dovodi do
diferencijacije u TH17. Vitamin A, retionska kiselina i IL-6 promovišu TREGs diferencijaciju,
a inhbicija IL-6 dovodi do promocije TH17. Dakle, TGF-β je najčešće udružen sa
diferencijacijom TREGs ćelija, odnosno inhibicijom TH1 i TH2, prisustvo antiinflamatornog
citokina kao što je IL-6, dovodi do inhibicije razvoja Treg ćelija i diferencijacije Th0 u TH17.
Nakon IL-17 identifikovana je još jedna subpopulacija nazvana TH9, jer luči značajne količine
IL9, a za diferencijaciju iz TH0 ćelija neophodno je prisustvo TGF-β i IL-4, mada stimulacija
ovim citokinima ne dovodi do produkcije TH2 citokina, nego dovodi do produkcije IL9, za što
je neophodna aktivacija transkripcionih faktora STAT6 (eng. signal transducer and activator
of transcription 6), IRF4 (eng. interferon response factor 4), i GATA3 (1–4) [499-506]. Pored
IL-9, TH9 produkuju IL-10 i IL-21. IL-9 pokazuje proinflamatorne osobine, i značajan je faktor
u alergijskim inflamatornim procesima i odbrani od ekstraćelijskih parazitarnih infekcija.
Pokazano je takođe da TH17 i TREGs mogu sekretovati IL9. Nedavno je pokazano da
subpopulacija human skin homing memory T cells produkuje IL22, IL26 i IL13, ali ne i IL17 i
IFNγ , zbog čega je i dobila ime TH22 subpopulacija, koja je značajna u etiopatogenezi
različitih autoimunih bolesti. U stečenoj imunskoj reakciji na većinu antigena mogu se
identifikovati humoralni ili celularni tip imunskog odgovora, na osnovu komponenata
imunskog sistema koje učestvuju u tom dogovoru. Humoralni tip imunskog odgovora
posredovan je B-limfocitima, dok u celularnom tipu posreduju T-limfociti. Efektorne T-ćelije
se dalje dele u citotoksične i pomažuće. Citotoksične ćelije ubijaju inficirane ciljne ćelije bilo
oslobađanjem litičnih granula (perforin, granzimi) ili preko indukcije Fas liganda i TNF-alfa,
koji preko vezivanja za svoje receptore injiciraju ćelijsku suicidnu kaskadu, dovodeći do
apoptoze ciljne ćelije. Aktivirajući signal naivne ćelije dobijaju od APC koje produkujući
odgovarajuće citokine određuju koja će subpopulacija limfocita biti aktivirana. Od monocita
koji izađu iz krvnog suda regrutuje se populacija takozvanih prekursorskih dendritskih ćelija iz
kojih nastaju nezrele dendritične ćelije, a iz njih pod uticajem kostimulatora (IL-4, IL-12, GMCSF i bakterijskih toksina nastaju zrele dendritske ćelije tipa 1. One stimulišu TH1
subpopulaciju i ćelijski imunski odgovor. Dendritske ćelije tipa 2 stimulišu TH2 subpopulaciju
i humoralni imunski odgovor. Važan faktor u determinaciji imunskog odgovora je i vrsta APC
259
(makrofagi, B-limfociti, dendritične ćelije i dr), a ove ćelije produkuju i kostimulatore
neophodne u proliferaciji i diferencijaciji T-limfocita.
Poslednjih godina ukazuje se na značaj koncepta mreže u biološkim naukama, pri čemu
mreža predstavlja skup jedinica (citokin, bakterija, antiapoptotski faktor) povezenih jednom
ili više veza preko kojih šalju signale koji određuju i regulišu međusobni uticaj između
jedinica. Konačni efekti su rezultanta snage i trajanja pojedinih signala između jedinica pri
čemu treba imati na umu da se radi o dinamičnim sistemima u kojima se signali i njihova
snaga menjaju u jedinici vremena. U našem ispitivanju imamo najmanje tri isprepletene mreže
mikrobnu, citokinsku i apoptotsku i članovi svaka od njih mogu svojim signalima da utiču
na one druge. Tako naprimer u zavisnosti od karakteristike mikroorganizama dolazi do
aktivacije određenih ćelija i njihovih TLR receptora, aktivacije transkripcionih mehanizama
i oslobađanja određenog spektra citokina koji određuje pokretanja TH1 ili TH2 tip imunskog
odgovora. Ako znamo da jedan isti mikroorganizam može u različitim ćelijama domaćina
odvesti do oslobađanja potpuno različitih citokina, ili da ćelije mogu produkovati različite
izoforme nekog citokina koji uvek indukuju ili inhibiraju druge citokine, onda je jasno koliko
su ovi odnosi komplikovani i u jednostavnim biološkim sistemima. Međutim, novija
istraživanja jasno pokazuju da bakterije produkuju različite molekule koji mogu imati značajan
efekat na kapacitet leukocita i tkivnih ćelija da produkuje određenu mrežu citokina. Tako je
poslednjih godina pažnja istraživača u izučavanju patogeneze infektivnih bolesti preusmerena
sa ćelijskih učesnika u imunskom i inflamatornom odgovoru na medijatore koji orkestriraju taj
odgovor. Citokini su svakako jedna od najvažnijih klasa medijatora inflamatornog odgovora.
Zna se da se oni mogu u prenošenju signala ponašati kao klasični endokrini hormoni ali se
mnogo više pažnje posvećuje njihovim autokrinim, parakrinim, jukstrakrinim, retrokrinim i
intrakrinim efektima. Pažnja usmerena sa ćelija domaćina koje su smatrane jedinim faktorom
u kontroli biologije citokina i na bakterije koje mogu svojim produktima ili direktnom
interakcijom sa ćelijama bitno modifikovati citokinsku mrežu.
Dakle svaka od ometajućih faktora u ovom ispitivanju (CA, BIFIDO, LEPTO, KOKE) može
uticati na koncetracije citokina kao i na broj i vijabilnost PMN, odnosno procenat apoptoze.
Ukoliko sad pored ove mikrobne mreže zamislimo i postojanje još dve druge mreže, citokinske
i apoptotske, onda bi međusobne interakcije jedinica između ove tri mreže bile značajno
komplikovanije od slike koju smo preuzeli iz rada Li i sar. Samo da bi ilustrovali
komplikovanost i isprepletanost signala između pomenutih mreža [79, 507].
260
Slika 3.64: Interakcije mikrobne mereže u vagini
Termin interaktom prvi put je upotrebila grupa francuskih istraživača na čelu sa Žak Bernarom
i ovaj termin se uglavnom odnosi na interakcije među genima, smatrajući da je međusobna
interakcija među jedinicama ovakve mreže mnogo važnije od samog broja gena, jer i razlika u
malom broju gena i proteina čiju produkciju kontrolišu može da dovede do značajnih uticaja na
funkcionisanje jedne ovakve mreže, odnosno u krajnjoj meri na uticaj genotipa na fenotip [90].
Tako naprimer HIV sa svojih 19 proteina pravi sa proteinima čoveka (100 000 proteina) oko 1
443 direktne interakcije, a mikrobiom gastrointestinalnog trakta sa oko 9 miliona jedinstvenih
gena mikroorganizama ostvaruje neprocenjiv broj interakcija sa humanim proteomom, a slično
se može primeniti i na mikrobiom vagine, s tim što je ovaj neprocenjiv broj značajno manji.
Koncept mreže (“network”) i interaktoma svakako su neke od najaktuelnijih tema u savremenoj
biologiji, i svaki istraživač bi morao da ih ima na umu kada govori o rezultatima ovakvih
ispitivanja [508-510].
Naravno da bi stres ili neke hormonske promene mogli značajno da utiču na svaku od tri
pomenute mreže. Tako, mada glukokortikoidi inhibiraju produkciju kortikotropin rilizing
hormona (CRH) u hipotalamusu, genska ekspresija CRH u placenti može biti stimulisana
glukokortikoidima, i tako uspostavljati pozitivnu povratnu spregu pri kraju trudnoće, tako da
povećanje kortizola dovodi do povećanja CRH. Interesantno, iako je kortizol inhibitor genske
ekspresije CRH u odsustvu progesterona, nadmetanje sa jačim inhibitornim efektom
progesterona na CRH gene u kasnoj trudnoći, moglo bi objasniti ovaj paradoksalnu pozitivnu
261
povratnu spregu sa produkcijom CRH u kasnoj trudnoći. Kako adenokortikotropni hormon
stimuliše produkciju dihidroepiandrostendiona u fetalnoj zoni nadbubrega, koji se onda u
placenti metaboliše u estrogen i dovodi do pojačane sekrecije CRH u placenti stvarajući tako
sekundarnu pozitivnu spregu, koja može sinhronizovati fetalnu maturaciju i miometrijalnu
senzitizaciju. PGE2, IL-1 i IL-6 pojačavaju endometrijalnu ekspresiju gena CRH. Ovo takođe
ukazuje na moguće autokrine i parakrine efekte CRH u tim tkivima i interakciju
proinflamatornih citokina u decidui. Ova isprepletenost endokrine regulacije sa parakrinim
interakcijama, delimično objašnjava teškoće pri pokušaju preciznijeg definisanja zbivanja u
porođaju kod primata. Kako je već pokazano da postoji sistemska veza između CRH i
inflamatornih citokina u CNS, logično je pretpostaviti da ona egzistira i na lokalnom,
intrauterinom, nivou. Gestaciona tkiva produkuju i CRH i citokine tako da postoji jasna
mogućnost međusobne regulacije CRH i citokina, kako u tim tkivima tako i u odnosu sa
fetusom. Tako bi rani porast CRH mogao da dovede do povećane produkcije IL-1 ili da dovede
do senzitacije tkiva koja bi onda produkovala IL-1 u odgovoru na slabije inflamatorne
stimuluse. I obrnuto, aktivacija inflamatornih medijatora i pokretanje citokinske kaskade može
dovesti do porasta centralne i lokalne produkcije CRH, objašnjavajući porast serumskog CRH
kod žena sa PL [511, 512]. IL-1stimuliše produkciju CRH, a CRH povratno reguliše produkciju
citokina utičući na imunske efektorske ćelije. Kako je pokazano da je stres majke udružen sa
PL, poremećaji regulacije CRH i produkciji inflamatornih citokina može biti mehanizam koji
objašnjava patofiziologiju ovih zbivanja [513-515]. Na osnovo do sada poznatih podataka nije
moguće utvrditi da li je CRH uzrok ili posledica pojačanog inflamatornog odgovora, moguće
je da oba događaja egzistiraju istovremeno [516-519]. Utvrđivanje tačnog sleda događaja bilo
bi od velikog značaja u rasvetljavanju patofizioloških zbivanja kod PL udruženog sa stresom
majke [520-525].
I sve ovo ne prvi pogled nema značaja za naše ispitivanje, ali ako uvažimo podatke po kojim a
stres može dovesti do nastanka BV i značajno uticati na sastav vaginalne mikroflore jasno je
kolika je isprepletenost pojedinih mehanizama u nastanku PP, i koliko je teško razlučiti uzročno
od posledičnog [526-530].
Tabela 3.19 prikazuje kako bi pacijentkinje u ovom ispitivanju bile razvrstane po grupama
ukoliko bi podelu pravili na osnovu samo mikroskopskih ometajućih faktora, odnosno broja
PMN, CA, KOKA, BIFIDO i LEPTO formi. Kao što smo rekli ono na čemu se suštinski zasniva
nova podela, kao i sve postojeće, jeste odnos laktobacila i BVAB, a u zavisnosti od njihovog
broja dele se u tri podgrupe FULL, MID i NULL. Ono što želimo naglasiti je da pacijentkinje
sa BVF imaju 100-1000 više bakterija u odnosu na pacijentkinje iz grupe NULL, zbog čega je
262
naša nulta hipoteza da bi ovolike razlike u broju morale odraziti na koncentracije citokina.
Takođe, verujemo da bi svaki od ometajućih faktora i njihov kvantitet mogli značajno uticati
na koncentracije citokina. Naravno da bi u ovu tabelu mogli uvesti još jedan faktor iz našeg
ispitivanja koji bi moga značajno uticati na koncentracije ispitivanih citokina a to su vrednosti
pH. Zaključak o mogućem broju faktora koji nisu deo našeg ispitivanja a koji bi mogli uticati
na naše rezultate može se izvući iz diskusije o postojanju bioloških mreža i/ili interaktoma.
Tabela 3.19: Mikroskopski nalaz kod 704 pacijentkinje na osnovu NP-6G, semikvantitativnog broja PMN
i mikroskopske detekcije KOKA, LEPTO i BIFIDO formi
NF
n
NORMAL-MID
n
NORMAL-NULL
n
UKUPNO
NF
NF/CA/PMN
NF/CA/K/PMN
NF/PMN
NF/CA
NF/CA/BIF/K/PMN
NF/CA/K
NF/K/PMN
NF/BIF
NF/CA/BIF/L/K/PMN
NF/CA/BIF/L/PMN
NF/L/PMN
NF/BIF/K
NF/CA/L/K
192
27
25
21
9
5
4
5
2
2
2
2
1
1
NM
NM/CA/K/PMN
NM/CA/PMN
NM/CA
NM/CA/BIF/K/PMN
NM/PMN
NM/K/PMN
NM/BIF/K
NM/CA/BIF/PMN
NM/BIF/K/PMN
NM/L/K
NM/L/K/PMN
NM/BIF
NM/BIF/PMN
77
18
13
9
7
8
5
3
4
2
2
2
2
1
28
10
7
5
3
2
3
2
2
2
1
1
1
1
297
55
45
35
19
15
12
10
8
6
5
5
4
3
NF/CA/L/K/PMN
NF/K
NF/L
1
1
1
UKUPNO
BV-FULL
BVF/K
BVF/CA/K/PMN
BVF/CA/PMN
BVF/K/PMN
BVF/CA/K
BVF/CA/L/PMN
BVF/PMN
BVF
BVF/CA
301
N
34
19
5
2
2
1
1
1
1
NM/CA/BIF
NM/CA/BIF/L
NM/CA/L/K
NM/CA/L/K/PMN
UKUPNO
BV-MID
BVM/K
BVM/CA/K/PMN
BVM/CA/PMN
BVM/CA/K
BVM/CA
BVM/PMN
BVM/K/PMN
BVM/L/PMN
BVM/CA/BIF/K
1
1
1
1
157
N
18
16
6
5
4
3
2
1
1
1
1
1
1
72
N
16
8
3
3
3
2
2
2
2
3
3
3
2
530
UKUPNO
68
43
14
10
9
6
5
4
4
BVM
BVM/BIF
BVM/L/K
1
1
1
NN
NN/CA/K/PMN
NN/CA/K
NN/BIF/K
NN/BIF/L/K
NN/CA/L/K/PMN
NN/CA/PMN
NN/K
NN/L/K
NN/PMN
NN/BIF/K/PMN
NN/BIF/L/K/PMN
NN/CA/BIF/K
NN/CA/BIF/K/PM
N
NN/CA/BIF/PMN
NN/CA/L
NN/L
NN/L/PMN
UKUPNO
BV-NULL
BVN/K
BVN/CA/K/PMN
BVN
BVN/K/PMN
BVN/L
BVN/BIF
BVN/CA/K
BVN/CA/L/K
BVN/CA/L/K/PM
N
BVN/CA/L/PMN
BVN/CA
BVN/CA/BIF
BVN/CA/BIF/K/P
MN
BVN/CA/BIF/PM
N
BVN/CA/L
BVN/CA/PMN
BVN/L/K
UKUPNO
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
49
121
1
1
1
174
704
UKUPNO
66
367
UKUPNO
59
216
K=koke; BIF= BIFIDO; L= LEPTO; PMN= (PMN2+PMN3)
263
Gledajući ovu tabelu ono čega se treba prisetiti jeste da najveći broj do sada objavljenih studija,
a koji se odnosi na lokalne koncentracije citokina pacijentkinje deli u samo u dve (Amsel)
odnosno tru grupe (Nugent). Prihvatanjem takve podele i statističke analize podataka kod te
dve ili tri grupe pacijentkinja, isključuje se ne samo mogućnost uticaja pomenutih ometajućih
(mešajućih, konfaunding) faktora, pri čemu opet podsećamo da ove dve podele suštinski ne
razlikuju kvantifikativni odnos između broja laktobacila i BVAB. Tako pacijentkinja koje smo
na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu ili NP-6G svrstali u grupu sa čistim ili hipocelularnim
(BVN) nalazom, na osnovu Nugentovih kriterijuma mogu biti svrstane u grupu intermedijaran
ili BV. Naprimer, ako na 5 vidnih polja ne nađemo laktobacile ta pacijentkinja će dobiti 4 boda
i po Nugentovim kriterijuma biti svrstana u intermedijarne. Ako na tih istih 5 polja nađemo
preko 6 morfotipova tipa gardnerele pacijentkinja će dobiti još 3 boda i sa 7 bodova biće
postavljena dijagnoza BV. Kao što je poznato da bi neku bakteriju uopšte videli na preparatu
po Gramu ona mora da je prisutna u koncentracijama koje su veće od 104-105 iz čega možemo
zaključiti da se koncentracije bakterija kod hipocelularnih nalaza kreću u ovim granicama ili su
manje, dok su koncentracije kod pacijentkinje sa nalazom BVF kao što smo rekli 100-1000 puta
veće, što je najlakše razumeti ukoliko još jednom pogledamo fotografije pacijentkinja sa
nalazom BVN i BVF u našem ispitivanju.
Zbog toga je u ovom ispitivanju statistička obrada podataka za svaki od ispitivanih
citokina rađena u odnosu na različite dijagnostičke kriterijume. Rezultati dobijeni Kruskal–
Wallisovom analizom varijanse (post hoc analiza Mann–Whitney U test; Tabele 1, 2, 3, 4 i 5,
Prilog 3) prikazani su u Tabeli 3.20 a statistički značajne razlike označene su crvenim slovima
odnosno brojevima.
Ukoliko pogledamo tabelu u kojoj je prikazan sumarni prikaz rezultat za ispitivane
citokine u odnosu na različite podele očigledno je da se izdvajaju tri citokina IL-6 i IL-1β i IL12, i da je za prva dva statistička značajnost (p<0,05) nađena u odnosu na sve podele, dok za
treći statistička značajnost nije nađena samo u podeli po Claeysu. S druge strane samo u NP6G nađena je statistička i INF-γ. Zbog toga ćemo pre tumačenja dobijenih rezultata ukratko
prodiskutovati opšte osobine ovih citokina i rezultate dobijene u dosadašnjim ispitivanjima.
264
Tabela 3.20: Sumarni prikaz Kruskal-Wallis testa
IL12p70
IFNγ
IL17A
χ2
8,060
0,140
1,708 2,523 0,167
0,623
2,528 17,090 3,965 0,517 2,769 16,910 4,106
p
0,018
0,932
0,426 0,283 0,920
0,732
0,283
χ 2 17,210
0,207
4,532 8,862 4,013
4,081
1,540 14,848 7,056 5,068 5,520 15,558 9,034
0,002
0,995
0,339 0,065 0,404
0,395
0,819
χ 2 10,552
2,417
1,888 3,790 3,846
1,946
5,173 19,156 4,142 2,301 2,088 16,011 5,802
0,061
0,789
0,864 0,580 0,572
0,857
0,395
χ 2 18,518
12,890
5,641 3,638 3,721 10,417 5,108 12,093 2,307 2,478 4,192 18,984 8,386
0,002
0,024
0,343 0,603 0,590
IL2
IL-10
IL9
IL22
IL6
IL13
IL4
IL5
IL1β
TNFα
Nugent
0,000
0,138 0,772 0,250
0,000
0,128
Ison/Hay
p
0,005
0,133 0,280 0,238
0,004
0,060
Claeys
p
0,002
0,529 0,806 0,837
0,007
0,326
NP-6G
p
0,064
0,403
0,034
0,805 0,780 0,522
0,002
0,136
3.7.1 IL-1
IL-1 je zajedničko ime za dva posebna proteina IL-1 i IL-1 koji su prvi u nizu velike porodice
citokina nazvanih interleukini. IL-1 produkuju gotovo sve ćelije sa jedrom uključujući sve
članove familije monocita/makrofaga, B-limfocita, NK-ćelija, klona T-limfocita, dendritskih
ćelija, astrocita, fibroblasta, neutrofila, endotelijalnih i ćelija glatkih mišića. IL-1 je veoma
važan citokin koji poseduje nekoliko bioloških osobina koje dovode do ekspresije
proinflamatornih gena. Jedna od najvažnijih osobina IL-1 je njegova sposobnost da pokrene i
podrži ekspresiju COX2 i inducibilne azot oksid sintetaze (iNOS). Ovo ima za posledicu
stvaranje velike količine PGE2 i NO u ćelijama izloženim dejstvu IL-1. Druga važna osobina
IL-1 je da poveća ekspresiju adhezivnih molekula kakav je intracelularni adhezivni molekul –
1 (ICAM-1) koji se nalazi u endotelijalnim ćelijama i na drugim ćelijskim površinama. Ova
osobina IL-1 omogućava infiltraciju inflamatornih i imunokompetentnih ćelija u
ekstravaskularnom prostoru. IL-1 je plejotropni citokin koji egzistira u dve homologe ali
genetski različite izoforme koji posreduju u različitim fiziološkim i patofiziološkim
događajima. Dovodi do pojačane ekspresije IL-2, IL-7, IL-10 i IL-12. U normalnoj trudnoći
nivo IL-1 u amnionskoj tečnosti i gestacionim tkivima raste tokom trudnoće, sa značajnim
povećanjem koncentracije u toku porođaja [531]. Kasnija eksperimentalna istraživanja na
životinjama pokazala su da administracija IL-1 ili IL-1 indukuje PL.
Romero i sar. su davno pretpostavili da IL-1 produkovan od strane domaćina (fetus ili majka)
može dovesti do inicijacije porođaja [532]. Kasnija saznanja potvrdila su ovu pretpostavku jer
je pokazano da stimuliše produkciju PG u amnionu, horionu i miometrijumu, da humana
decidua produkuje IL-1 u odgovoru na bakterijske produkte, nađene su povišene koncentracije
ovog citokina u amnionskoj tečnosti trudnica sa PP i IUI. IL-1 učestvuje u indukciji ekspresije
265
gena za COX-2 i produkciji PG [533]. Pokazan je veliki značaj ovog interleukina u uslovima
PP udruženog sa infekcijom gram negativnim bakterijama [534-536]. . IL-1β dovodi do porasta
PG, tako što dovodi do povećane ekspresije inducibilne forme PGHS-2 [537].
IL-1 posredovani signali rezultiraju aktivacijom transkripcionog faktora NF-B i posledične
povećane produkcije TNF-, IL-6, IL-8, MIP-1, i drugih citokina, važnih za akutni
inflamatorni odgovor. Povećana produkcija i oslobađanje TNF- i IL-1 ponovno aktivira NFB stvarajući tako jednu pozitivnu povratnu spregu koja može dovesti do ekscesivne produkcije
citokina koja igra ključnu ulogu u patogenezi PP. Pored toga, NF-B reguliše transkripciju gena
za COX-2, koja je esencijalna za produkciju PG, i ima veliku ulogu u genskoj regulaciji sinteze
progeszterona. Ipak,. rezultati Hirsch i sar [538]. na modelu miševa sugerišu da lokalna
pojačana ekspresija IL-1 možda i ne igra centralnu ulogu u patofiziološkim zbivanjima PL
udruženog sa infekcijom. Ovakav zaključak protivreči, je u suprotnosti sa velikim brojem
opservacionih studija kod žena koje su našle udruženost između povećane koncentracije
inflamatornih citokina i infekcijom indukovanog porođaja. Druge studije na eksperimentalnim
životinjama dokumentovale su sposobnost citokina da indukuju porođaj, tako infuzija IL-1beta
u amnionsku šupljinu rezus majmuna uzrokuje rapidnu produkciju TNF-alfa i PG, praćenih
uterinim kontrakcijama [539]. PL je indukovan i kod miševa nakon sistemske administracije
IL-1 [540] i kod zečeva kombinacijom IL-1 i TNF-alfa ubačenih u amnionsku šupljinu [541].
.
Zbog toga su Hirsch i sar, zbog preciznijeg određivanja uloge IL-1 kod PL udruženog sa
infekcijom u eksperimentu koristili miševe kod kojih je potpuno odsutan signal za IL-1 ( eng.
knockout) i pokazali da maternalna aktivnost IL-1 nije neophodna za porođaj, bilo na lokalnom
ili sistemskom nivou. Ova neovisnost o IL-1 može biti rezultat redundantnosti u citokinskoj
mreži, ili sa nekim još nepoznatim mehanizmima koji nisu u vezi sa aktivnošću IL-1, a preko
kojih infekcija dovodi do PL. Zbog toga autori veruju da je pojačana produkcija IL-1 jedan
epifenomen koji se prvenstveno javlja zbog prisustva bakterija u uterinoj šupljini. Primarna
uloga IL-1 je da dovodi do povećene aktivacije imunih ćelija i posledičnog uticaja na njihovu
produkciju citokina i imunomodulatornih molekula.
3.7.2 IL-6
IL-6 je jedan od najvažnijih medijatora u odgovoru domaćina na infekciju ili oštećenje tkiva i
produkuje ga veliki broj različitih ćelija: stimulisani monociti, fibroblasti, endotelijalne ćelije,
makrofazi, T-ćelije, B-ćelije, PMN, glatke mišićne ćelije i druge. Fiziološki stimulansi dovode
do sinteze IL-6 su IL-1, bakterijski endotoksini i TNF-α. IL - 6 može sam stimulisati ili
inhibirati svoju sintezu u zavisnosti od tipa ćelija. U epitelijalnim endotelijalnim i fibroblasnim
ćelijama sekreciju IL-6 može indukovati i IL-17. IL-6 igra centralnu ulogu u gotovo svakom
266
akutnom inflamatornom odgovoru bilo da se radi o infekciji ili stranom telu, tako što se upliće
u procese aktivacije komplementa, opsonizacije bakterija, mobilizacije neutrofila, porasta
bazalne temperature i aktivacije T i B limfocita. Na uloga IL-6 u događajima vezanim za PP
udružen sa infekcijom ukazuju različiti podaci kao što su, povećana produkcija PG u amnionu
i decidui i njegova pojačana produkcija u odgovoru na bakterijske produkte i mnogi drugi [542546]. Pacijentkinje sa pozitivnom kulturom imale su kraći interval od amniocenteze do
porođaja od onih kod kojih je kultura bila negativna. Ovaj interval bio je kraći i kod
pacijentkinja sa negativnom kulturom, ali visokim koncentracijama IL-6. Ovakav nalaz
potvrđuje nalaze Romera i sar. [547-549]. i podržava hipotezu da aktivacija inflamatornih
medijatora igra značajnu ulogu u pokretanju i/ili propagaciji inflamatorno-imunološke kaskade
koja dovodi do porođaja. Na ovo ukazuje i podatak da kod pacijentkinja sa PL postoji bolja
korelacija vrednosti citokina u amnionskoj tečnosti (koji predstavljaju odraz odgovora
fetomaternalne jedinice na infekciju) od kulture amnionske tečnost (detektuje se samo prisustvo
nekog mikroorganizma) u predikciji PP. Romero i sar. [549] su u svojoj studiji utvrdili klinički
skor na osnovu sledećih parametara: gestacina starost, preparat po Gramu, koncentracija
glukoze, leukocite esteraza, CRP u serumu majke. Rezultati ove studije pokazali su da vrednosti
IL-6 u AF mnogo bolji prediktori PP od bilo kojeg drugog parametra ili kliničkog skora (samog
ili u kombinaciji). Njihov matematički model ukazuje na mogućnost korišćenja kvantitativnih
vrednosti citokina u preciznijoj predikciji PP, i s obzirom na nalaze o korelaciji citokina u
cervikovaginalnom sekretu i amnionskoj tečnosti [550]. predlažu određivanje citokina u
cervikalnom sekretu. Ovo bi omogućilo da se kod pacijentkinja sa pozitivnim nalazom u
cervikalnom sekretu uradi amniocenteza i kvantitativno odrede vrednosti citokina, te da se na
osnovu toga predvidi verovatan period u kome će doći do porođaja i da se na osnovu toga
preduzmu adekvatni terapijski postupci [551-553]. Wensrom i sar. [554] su našli povišene
koncentracije IL-6 u amnionskoj tečnosti žena koje su se prevremeno porodile 30 dana posle
rane amniocenteze, u odnosu na kontrolnu grupu.. U odsustvu infekcije ovaj citokin može biti
detektovan u malim koncentracijama u amnionskoj tečnosti žena u drugom i trećem trimestru
koje nisu u porođaju [555].. Andrews i sar.[556] našli povećane koncentracije IL-6 u
amnionskoj tečnosti žena kod kojih je iz horioamniona ili amnionske tečnosti izolovan jedan ili
više mikroorganizama, kao i da vrednosti IL-6 ukazuju na kolonizaciju horioamniona
mikroorganizmima čak i kada je kultura amnionske tečnosti negativna. Ovaj nalaz bio je dalji
poticaj za izučavanje vrednosti IL-6 kao markera IUI i kada je nalaz kulture negativan. Yoon
i sar. [557] su našli značajno veće koncentracije IL-6 kod žena sa histopatološki potvrđenim
nalazom horioamnionitisa i ukazali na vrednost određivanja IL-6 kao prediktora
267
horioamnionske infekcije i povećanog neonatalnog rizika. Goepfert i sar [558] su u svojoj
prospektivnoj opservacionoj studiji merili koncentraciju IL-6 i FFN kod 2 929 trudnica bez
simptoma između 22 i 24 n.g. Ovde ćemo napomenuti da najveći broj studija koji se odnose na
koncentracije kako IL-6, a tako i drugih citokina, odnosi na pacijentkinja sa simptomima i
znacima PP, zbog čega nisu uporedivi sa rezultatima našeg ispitivanja jer mislimo da se u
takvim uslovima izvori i uzroci povišenih ili sniženih koncentracija citokina bitno razlikuju u
odnosu na populaciju asimptomatskih pacijentkinja. Naprimer, ukoliko kod trudnice sa znacima
i simptomima PP nađemo povišene koncentracije IL-6 a pri tome pacijentkinja ima BV nikako
ne možemo zaključiti da je BV uzrok povišenih koncentracija IL-6 bez obzira na rezultate
nekih, a i našeg ispitivanja, da pacijentkinje sa BV imaju veće koncentracije IL-6. u ovoj grupi
trudnica veće je došlo do aktivacije fetalnih membrana, kontrakcija miometrijuma i promena
na grliću materice i tako je aktivirana veliki broj drugih ćelija (amnion, decidua, horion,
miometrijum, grlić) koje mogu bitno uticati na koncentracije citokina koje mi izmerimo u grliću
materice i poredimo ih sa mikrobiološkim statusom vaginalne flore. Asimptomatske trudnice
su prema tome bili osnovni razlog za poređenje ove studije i naših rezultata, a osim stoga u ovoj
studiji ispitivani su i vrednost drugih prediktora PP kao što su BV, dužina grlića materice koji
su deo našeg ispitivanja. Posle toga su napravljene dve grupe pacijentkinja (n=125) one koje su
se porodile pre 37 n. g. i posle 37 n.g. dok je u prvoj grupi 49 pacijentkinja imalo PL pre 32 n.
g. Koncentracija IL-6 u cerviksu pacijentkinja između 22-24 n.g. koje su se porodile pre 32 n.
g. (247365 vs 84129 pg/ml; P=.005), kao i kod svih pacijentkinja porođenih pre 35 n. g.
(212339 vs 111186 pg/ml; P=.008) bila je signifikantno veća u odnosu na kontrolnu grupu.
Oni su odredili 90. i 95. percentilu za kontrolne subjekte posle čega je izračunata granična
vrednost za povišenu koncentraciju IL-6. Koncentracija IL-6 305 pg/ml 90. percentile i 538
pg/ml za 95. percenitilu. Povišena koncentracija IL-6  za 90. percentilu 305 pg/ml nađena je
kod 20% pacijentkinja sa PP i kod 9,6% u kontrolnoj grupi ( p=.02), a IL-6 95. percentile 538
pg/ml kod 12% i 4,8% (P=.04). Pacijentkinje sa IL-6 95. percentile imale su 9X veći rizik od
PP pre 32 n. g. i 3X veći rizik od PP pre 35 n. g. Među ženama porođenim pre 35 n. g. sa
povišenom cervikalnom koncentracijom IL-6 u 24 n. g. autori nisu našli značajniju korelaciju
sa drugim faktorima rizika kao što su: BV, BMI 19,8 kg/m2, skraćen grlić, ali su zato našli
značajnu udruženost sa povišenim vrednostima FFN koji se danas smatra najboljim markerom
u predikciji PP. Pretpostavlja se da subklinička infekcija ili amnio-horiona ili decidue, ili obe,
mogu dovesti do poremećaja ekstracelularnog matriksa i pojavljivanja FFN u cerviksu i vagini.
Međutim multivarijantnom analizom za povišene koncentracije IL-6 i granične vrednosti 50. i
268
95. precentile nije nađena statistički značajna korelacija ovog citokina i porođaja pre 35. ili 32.
nedelje gestacije.
3.7.3 IL-12 p70
IL-12p70 je heterodimerni glikoprotein koji se sastoji iz dve subjedinice p40 i p35 čija se
ekspresija reguliše nezavisno. Dokazano je postojanje homodimernih i monodimernih oblika
subjedinice p40 (IL-12p40) koji mogu delovati antagonistički na funkcije IL-12. Kao induktori
produkcije INF-γ IL-12. IL-23 i IL-27 igraju krucijalnu ulogu u regulaciji inflamatornog
odgovora. Tako IL-12 i IL-27 učestvuju u TH1 diferencijaciji, dok je IL-27 značajan za
opstanak i ekspanziju TH17. Fiziološki izvor IL-12, in vivo, primarno su APC, uključujući
aktivirane monocite/makrofage i dendritične ćelije. Unutar nekoliko časova od infekcije počinje
lučenje IL-12, posebno ako su u pitanju infekcija bakterijama i intraćelijskim parazitima.
Pokazano je da IFN-γ ima snažan pojačavajući efekat na sposobnost fagocitnih ćelija da luče
IL-12, verovatno potencirajući produkciju IL-12 unutar inflamiranih tkiva. Bakterije,
bakterijski produkti, zatim intracelularni patogeni kao što su virusi, gljivice dolaze u interakciju
sa različitim receptorima na fagocitnim ćelijama i predstavljaju glavne induktore produkcije
IL-12. Pored ovih stimulatornih mehanizama, produkciju IL-12 kontrolišu i inhibitorni
mehanizmi. IL-10 koji je potentan inhibitor produkcije mnogih proinflamatornih citokina,
takođe inhibira i produkciju IL-12. Eksperimentalno je pokazano da su IL-10 deficijentni
miševi mnogo vulnerabilniji na LPS-izazvnai endotoksični šok. Takođe je pokazano da sam IL12 pojačava produkciju IL-10 u T-ćelijama. Pored IL-10 i TGF-β je snažan inhibitor produkcije
IL-12. IL-4 i IL-13 takođe delimično inhibiraju produkciju IL-12, sugerišući hipotezu po kojoj
Th2 ćelije preko produkcije citokina kao što su IL-10, IL-4 i IL-13 suprimiraju produkciju IL12 i tako sprečavaju uspostavljanje TH1 tipa imunskog odgovora. Nedavno je pokazano
postojanje i trećeg mehanizma indukcije produkcije IL-12 tokom inflamacije, koji je nezavisan
od prisustva aktivne infekcije ili imunskog odgovora. Tokom inflamacije dolazi u ECM do
nakupljanja fragmenata niske molekulske težine koji potiču od glikozaminoglikana hijalurana,
koji su se pokazali kao potentni induktori produkcije IL-12 u makrofagama. Ovi molekuli se
vežu za adhezivni površni molekul CD44 na membrani makrofaga i uzrokuju povećanu
produkciju IL-12. tako i u uslovima aseptičkog inflamatornog stanja, kao i odsustva imunskih
mehanizmima indukovane ekspresije CD40 na T-ćelijama, može biti indukovana produkcija
IL-12, koji onda može dovesti do indukcije produkcije IFN-γ i tako dovesti do aktivacije
makrofaga. Pored ovih stimulatornih mehanizama, produkciju IL-12 kontrolišu i inhibitorni
mehanizmi. IL-10 koji je potentan inhibitor produkcije mnogih proinflamatornih citokina,
takođe inhibira i produkciju IL-12. Eksperimentalno je pokazano da su IL-10 deficijentni
269
miševi mnogo vulnerabilniji na LPS-izazvnai endotoksični šok. Takođe je pokazano da sam IL12 pojačava produkciju IL-10 u T-ćelijama. Pored IL-10 i TGF-β je snažan inhibitor produkcije
IL-12. IL-4 i IL-13 takođe delimično inhibiraju produkciju IL-12, sugerišući hipotezu po kojoj
Th2 ćelije preko produkcije citokina kao što su IL-10, IL-4 i IL-13 suprimiraju produkciju IL12 i tako sprečavaju uspostavljanje TH1 tipa imunskog odgovora. Dakle, interleukin-12 se
produkuje u toku rane faze infekcije i inflamacije i deluje kao proinflamatorni citokin koji
dovodi do produkcije IFN-gama, u T i NK-ćelijama, koji onda aktivira fagocitne ćelije. Ako je
IL-12 i IL-12-indukovani IFN-gama prisutni tokom rane ekspanzije T-ćelija u odgovoru na
antigen, dolazi do favorizacije Th1 imunskog odgovora i inhibicije Th2 imunskog odgovora.
Dakle IL-12 pored proinflamatornih dejstava, predstavlja i potentan imunoregulatorni citokin
koji promoviše Th1 diferencijaciju i pomaže u odbrani od bakterija, intracelularnih parazita,
gljiva i nekih virusa. Inhibirajući TH2 tip imunskog odgovora IL-12 ima supresivne efekte na
alergijske reakcije, dok s duge strane promovišući Th1tip imunskog odgovora on ima značajnu
ulogu u imuno patološkim zbivanjima odgovornim za neke organ specifične autoimunske
bolesti. Virusi koji dovode do trajne ili prolazne imunodepresije, kao što su HIV ili virus malih
boginja, mogu dovesti do smanjenja produkcije IL-12. S obzirom na sposobnost IL-12 da
poveća otpornost na neke infektivne bolesti i da deluje kao adjuvant u vakcinaciji, kao i zbog
njegovog snažnog antitumorskog dejstva, ispituje se mogućnost njegove terapijske upotrebe
kod pacijenata sa HIV-infekcijom, malignim i nekim drugim bolestima. IL-12 takođe pojačava
proliferaciju i citolitičku aktivnost CTL i NK-ćelija i stimuliše oslobađanje IFN-gama u tim
ćelijama. Kao što je prethodno rečeno IFN-gama ima snažne pojačavajuće efekte na produkciju
IL-12, a s druge strane poznato je da je IL-12 moćan induktor produkcije IFN-γ u NK i Tćelijama. Tako, IL-12- indukovani IFN-γ uspostavlja pozitivnu povratnu spregu koja dovodi do
pojačane produkcije IL-12. IL-12 i TNF-α zajedno sa IFN-γ iz TH1 ćelija, stimulišu aktivaciju
CTL i NK-ćelija, kao i monocita/makrofaga, koji predstavljaju najvažnije komponente
celularnog imunskog odgovora. Ovi pozitivni mehanizmi amplifikacije (IL-12 = IFN-γ =IL-12)
predstavljaju potencijalno opasne mehanizme koji mogu dovesti do nekontrolisane produkcije
citokina i šoka. da ne bude tako odgovorni su inhibitorni mehanizmi (IL-10, TGF-β, IL-4, IL13). Ćelijska dejstva IL-12 posredovana su visokospecifičnim receptorima koji se sastoje iz dve
subjedinice nazvane IL-12Rβ1 i IL-12Rβ2. Ekspresija β2 je ograničena i ona verovatno
predstavlja centralni mehanizam kontrole aktivnosti IL-12. Smatra se da je ekspresija β2
subjedinice neophodna za TH1 diferencijaciju i da do njihove ekspresije ne dolazi na T-ćelijama
koje ispoljavaju TH2 citokinsku mrežu. Aktivacija receptorskog kompleksa preko više
fosforilacija dovodi do translokacije STAT do jedra, gde on veže specifične DNA sekvence u
270
promotornom regionu IL-12 inducibilnog gena. Dakle, IL-12 ima višestruke funkcije u
imunskom odgovoru, a jedna od najvažnijih, ako ne i najvažnija, je u povećavanju produkcije
IFN-γ. S druge strane, pokazano je postojanje poztivne povratne sprege između ova dva
citokina. Jedan od glavnih zadataka u imunologiji je da se utvrdi uloga koju ima IFN-γ na
produkciju IL-12, kao i da li prodikcija IFN-γ prethodi produkciji IL-12 ili je obrnuto. Većina
istraživanja je pokazala da je IFN-γ potreban za produkciju IL-12 u monocitima ili
makrofagama. Noviji podaci ukazuju da do indukcije IL-12 može doći nezavisno od IFN-γ,
odnosno da IFN-γ nije neophodan za produkciju IL-12, ali je sigurno da IFN-γ dovodi do
povećane produkcije IL-12 i to preko različitih mehanizmima: 1) direktno indukuje
transkripciju IL-12p35 u perifernim mononuklearima krvi i priprema monocite za LPSindukovanu transkripciju gena za IL-12 p35 i p40. 2) IFN-γ povećava ekspresiju CD40 na
monocitima koji najverovatnije pojačavaju odgovor monocita na stimulaciju ligandom CD40.
3) IFN-γ smanjuje efekte IL-10 koji je snažan inhibitor produkcije IL-12. Smatra se da je IL12 najmoćniji stimulator NK-ćelija i u njima indukuje transkripciju IFN-γ koji pokazuje snažna
sinergistička dejstva sa IL-2. IL-12 pojačava citotoksičnu aktivnost NK-ćelija i istovremeno je
faktor rasta za te ćelije. Ova aktivnost IL-12 može biti blokirana antitelima specifičnim za TNFα. U Th1 subpopulaciji limfocitima IL-12 indukuje sintezu IFN-γ, IL-2 i TNF-α. Preko IFN-γ i
TNF-α IL-12 utiče na bolju ekspresiju MHC antigena na imunokompetentnim i ciljnim
ćelijama, što dovodi do bolje interćelijske komunikacije imunokompetentnih ćelija, kao i do
efikasnijeg prepoznavanja ciljnih ćelija. TNF-α je umešan u dejstva IL-12 na NK ćelije, jer
aktivnost IL-12 može biti blokirana antitelima na TNF-α. IL-12 i TNF-α su kostimulatori u
produkciji IFN-γ. Produkcija IL-12, TNF-α i IFN-γ inhibira IL-10. U TH2 ćelijama IL-12
smanjuje sintezu IL-4 , IL-5 i IL-10. S obzirom da IL-12 pored APC luče i B-limfociti, koji su
prvenstveno pod kontrolom TH2 ćelija, svaka akceleracija TH2 imunskog odgovora vodi u
stimulaciju B-limfocita i povećanje produkcije IL-12, koji onda favorizuje TH1 tip imunskog
odgovora. Dakle, IL-12 bi mogao biti transformator koji akceleraciju TH2 tipa imunskog
odgovora pretvara u akceleraciju TH1 imunskog odgovora. Treba reći da B-limfociti sekretuju
IL-12 samo u situacijama kada imaju ulogu APC, odnosno samo onda kada posle endocitoze
antigena prezentuju njegove epitope u kontekstu MHC antigena klase II. Ovim fenomenom
mogli bi se objasniti pobačaji posredovani imunskim mehanizmima, a koji su inicirani
aktivacijom B-ćelija, posle kojih su zabeležene značajno veče serumske koncentracije IL-12
nego u normalnim trudnoćama. Novija ispitivanja pokazuju da je IL-4 dominatan citokin u
odnosu na IL-12 i da se i da se imunski odgovor u uslovima istovremenog pojavljivanja
značajnih koncentracija ova dva citokina ipak odvija u pravcu TH2 tipa imunskog odgovora, te
271
da je IL-12 sekretovan iz B-ćelija, u uslovima akceleracije Th2 tipa imunskog odgovora, zbog
istovremenog izlučivanja IL-4 ipak u nemogućnosti da preokrene smer imunske reakcije ka Th1
tipu imunskog odgovora. IL-12 nema nikakvog uticaja na proliferaciju TH0 i TH2 ćelija, dok
ima snažni proliferativni i aktivacioni uticaj na TH1 ćelije.
3.7.4 KONCENTACIJE CITOKINA PO GRUPAMA NA OSNOVU RAZLIČITIH
DIJAGNOSTIČKIH KRITERIJUMA
NUGENTOVI KRITERIJUMI
Na osnovu Nugentovih kriterijuma statistička značajnost između različitih grupa
pacijentkinja nađena je za tri od 13 citokina, IL-12, IL-6 i IL-1β. Koncentracije IL-12 bile su
najniže kod pacijentkinja sa BV (43,4±198,5) i značajno su se razlikovale kod pacijentkinja sa
normalnim (63,8±448,9) i intermedijarnim (68,9±520) nalazom, intermedijarnim nalazom
(68,9±520) i BV (43,4±198,5), ali nije nađena statistički značajna razlika u koncentracijama
IL-12 između pacijentkinja sa normalnom nalazom i BV. Koncetracije IL-6 značajno su se
razlikovale kod pacijentkinja sa normalnim nalazom (224,8±4003,5) u odnosu na pacijentkinje
sa intermedijarnim nalazom (1631,4±16324,6) i BV (629,6±6873,8). Statistički značajne
razlike za IL-1β nađene su samo između pacijentkinja sa normalnom nalazom (1087,1±1304,8)
i BV (1682,4±1666,1).
ISON/HAY
U podeli po Ison/Hayu takođe je nađena statistička značajnost za tri ista citokina kao i
podele po Nugentu što na indirektan način potvrđuje rezultate koje smo dobili poređenjem ove
dve metode o njihovoj međusobnoj podudarnosti (hi kvadrat i Kappa indeks). Ipak treba
primetiti da uvođenjem dve nove grupe, čist nalaz i koke, postojanje statističke značajnosti
između pojedinih grupa se menja. Za IL-12 nađeni su isti rezultati, odnosno statistička
značajnost između pacijentkinja sa normalnom nalazom (64,0±458,7) i onih sa intermedijarnim
(111,4±642,3) i BV (51,8±216,7), ali takva značajnost nađena je i za dve nove grupe
pacijentkinja. Tako su pacijentkinje iz grupe čist nalaz (1,66±4,74) i grupe koke (13,0±68,9)
imale statistički značajno različite koncentracije IL-12 u odnosu na pacijentkinje sa normalnom
nalazom i BV. Ako pogledamo srednje koncentracije između pacijentkinja sa normalnim,
intermedijarnim i BV videćemo da se one za IL-12 ne razlikuju značajnije, odnosno da su u obe
podele pacijentkinje sa intermedijarnim nalazom imale najveće koncentracije ovog citokina, po
Nugentu (67,9) a Ison/Hayu (111), dok su pacijentkinje sa BV imale najniže srednje vrednosti
43,4 (Nugent) i 51,7 (Ison/Hay). Podelom po Nugentu nisu nađene statistički razlike u odnosu
na apoptozu, dok su u podeli po Ison/Hay pacijentkinje iz grupe čist nalaz (19,7±15,3) imale
272
značajno veći procenat apoptoze u odnosu na pacijentkinje sa normalnom (12,2±9,7),
intermedijarnim nalazom (10,9±7,5) ili kokama (10,6±11,4), ali ne i pacijentkinjama sa BV
(13,5±8,4). Generalno pacijentkinje sa čistim nalazom u grupi po Ison/Hayu odlikuju se
hipocelularnošću bakterijskih formi i PMN tako da bi ovi nalazi i pojačana apoptoza PMN
govorili u prilog odsustva infekcije ili inflamacije, odnosno da je pacijentkinja zdrava.
Međutim, kao što smo rekli hipocelularni nalaz na neki način znači da je broj bakterija manji
od 104 - 105 te da na osnovu mikroskopskog nalaza ne možemo utvrditi kakav je odnos
laktobacila i BVAB Ako znamo da laktobacili imaju poapoptogeni efekat onda bi povećan
procenat apoptoze mogao da nas navede da zaključimo da u ovakvoj zajednici predominiraju
laktobacili ali da to zbog njihovog malog broja ne možemo utvrditi mikroskopskim pregledom.
Međutim sasvim je moguća i potpuno suprotna pretpostavka po kojoj u ovoj mikroskopski
nevidljivoj zajednici predominiraju BVAB koji dovode do povećane produkcije MKKL za koje
je takođe pokazano da imaju antiinflamatorne i proapoptogene efekte. Ovaj primer najbolje
ilustruje težinu tumačenja različitih inflamatornih medijatora kao prediktora zbivanja
preveremenog porođaja.
CLEAYS
I podelom po Claeysu nađena je statistička značajnost u odnosu na stepen apoptoze, i to
između sledećih grupa: normalan (11,6±9,2) i BV (15,4±12,6), normalan (11,6±9,2) i koke
(29,6±15,7), intermedijaran (11,6±7,3) i koke (29,6±15,7), BV (15,4±12,6) i koke (29,6±15,7),
grupe leukoreja (7,8±3,5) i koke (29,6±15,7), kao i između koke (29,6±15,7) i pacijentkinja
koje su imale nalaz Sličan normalnom (12,9±11,9). dakle pacijentkinje koje u ovoj podeli
karakteriše ekstremno veliki broj PMN imale su najniži stepen apoptoze što je u skladu sa
činjenicom da u uslovima zapaljenje ili inflamacije (povećan broj PMN) je produžena
vijabilnost PMN odnosno dolazi do odlaganja apoptoze. Ovom podelom nađene su i statistički
značajne razlike u koncentracijama IL-6 i IL-1β. Pacijentkinje sa normalnim nalazom
(256,6±4314,3) imale su značajno manje koncentracije ovog citokina u odnosu na pacijentkinje
sa BV (654,0±7002,5), a takva značajnost nađena je i između pacijentkinja sa BV
(654,0±7002,5) i leukorejom (19,8±45,3). Dakle pacijentkinje sa velikim brojem PMN imale
su izrazito niske srednje koncentracije ovog citokina. Koncentracija IL-1β su se razlikovale u
grupama normalan (1087,9±1316,0) i BV (1625,9±1679,4) kao i kod pacijentkinja sa
intermedijarnim (1187,2±1211,5) i BV (1625,9±1679,4).
AMSEL
Da je studija rađena samo na osnovu Amselovih kriterijuma onda bi statistička
značajnost (t-test) postojala samo za IL-1β i zaključili bi da je to jedini od ispitivanih citokina
273
koji je ima povećane koncentracije kod pacijentkinja sa BV, potvrđujući tako nalaze većine
dosadašnjih studija.[559-564].
NP-6G
Analizom podataka na osnovu NP-6G nađena je statistička značajnost za IL-6, IL-12, IL1β i IFN-γ. Statistički značajna razlika koncentracija IL-12 nađena je između grupa:

NF/NM (54,6±384,8/28,5±127,9);

NF/NN (54,6±384,8/169,3±968,6);

NM/BVM (28,5±127,9/88,5±297,6);

NN/BVN (169,3±968,6/14,4±67,3);

NN/BVM (169,3±968,6/88,5±297,6).
I ovde ćemo ukazati na činjenicu da ovi i prethodno pomenuti rezultati, dakle koncentracije
citokina u grupama normalni, intermedijarni i BV (Nugent, Ison/Hay, Claeys), odnosno
grupama normalne i BV (NP-6G predstavljaju koncentracije citokina koje suštinski zavise od
odnosa laktobacila i BVAB. Dakle nijedan od ovde prikazanih rezultata ne uvažava mogući
uticaj nekog od pomenutih ometajućih faktora. Kao što smo već rekli NP-6G za razliku od svih
ostalih razlikuje pacijentkinje na osnovu broja bakterijskih morfotipova na preparatu po Gramu
podatak koji nam je svakako interesantan jeste onaj koji ukazuje da su koncentracije IL-12p70
bile najviše i najniže u grupi pacijentkinja sa hipocelularnim nalazom, odnosno u grupama NN
i BVN. Ovi rezultati jasno ukazuju da broj bakterija nije od odlučujućeg značaja za
koncentracije citokina u grliću materice trudnica između 24-28 nedelje gestacije. Pri tome
naravno ne možemo isključiti de je odnos između pojedinih bakterijskih vrsta taj koji značajno
utiče na koncentracije citokina jer je poznato da neki mikroorganizmi dovode do pojačane
produkcije nekog citokina dok drugi imaju suprotan efekat. Dakle posmatrajući samo mikrobnu
mrežu koncentracije nekog citokina bile bi krajnja rezltatnata stimulativnih ili inhibitornih
mehanizama velikog broja mikroorganizama, a kao što smo rekli prikazani rezultati ne
uvažavaju ulogu nijednog od pomenutih mešajućih faktora:

NF/NM (54,6±384,8/28,5±127,9);

NF/NN (54,6±384,8/169,3±968,6);
Ili ako pogledamo samo grupu sa normalnim nalazom (NF+NM+NN) onda vidimo da su
pacijentkinje sa nalazom NF imale značajno veće koncentracije IL-12 u odnosu na nalaz NM,
što bi nas moglo navesti da zaključimo da je veći broj laktobacila u ovoj grupi razlog ove
274
značajnosti. Međutim već sledeći nalaz koji ukazuje na značajno veće (najveće) koncentracije
ovog citokina kod pacijentkinja iz grupe NN, ukazuje da broj laktobacila svakako nije
odlučujući faktor za koncentracije IL-12. Ipak mislimo da je kroz diskusiju o laktobacilima i
njihovom mogućem uticaju na koncentracije različitih citokina najlakše shvatiti koliko je teški,
ili bolje rečeno sa koliko opreza i (samo) kritičnosti treba tumačiti dobijene rezultate. U studiji
Nikolaitchouk i sar.[565] kod pacijentkinja bez BV pokazano je da je prisustvo L. iners u
negativnoj korelaciji sa IL-1β i pozitivnoj korelaciji sa antiinflamatornim molekulom,
sekretornim inhibitorom proteaza leukocita (SLPI; secretory leukocyte protease inhibitor), dok
je drugi soj laktobacila L. gasseri u pozitivnoj korelaciji sa IL-1β. Druga studija Orfanelija i
sar. [566] pokazala je da pacijentkinje kod kojih predominira L.crispatus imaju niže
koncentracije IL-1β, a veće koncentracije SLPI. U Japanskoj populaciji trudnica kod kojih su
laktobacili detektovani kulturom pokazano je da su žene sa izolovanim laktobacilima imale
najmanje koncentracije IL-8, bez obzira da li su ili nisu izolovane druge anaerobne bakterije
[567]. Kod 30 asimptomatskih žena kod kojih su koncentracije L. inersa merene Q-PCR
dobijene su niske koncentracije IL-8 pri čemu podsećamo da L. iners ne raste u kulturi u kojoj
uspevaju drugi laktobacili [568]. Suprotno, studija na populaciji adolescenata kod kojih su
laktobacili izolovani kulturom, nisu pokazale nikakve razlike u koncentracijama citokina u
odnosu na prisustvo laktobacila [569]. Ukratko, različiti sojevi laktobacila mogu različito da
utiču na koncentracije pojedinih citokina. U ovom ispitivanju sve trudnice kod kojih su na
preparatu po Gramu predominirale Gram pozitivne štapićaste forme (laktobacili) svrstane su u
grupu zdravih, iako su se ove forme prilično razlikovale po svojim morfološkim, odnosno
mikroskopskim karakteristikama. Tako su neke vrlo tanke i slabo se boje, dugačke, druge su
deblje i jače se boje, neke su savijene i kratke  dakle brojni oblici različitog mikroskopskog
izgleda koje smo tumačili kao laktobacile. U Metodologiji smo napomenuli da se u
mikrobiološkom Bergeyevom priručniku laktobacili definišu kao bakterije dužine od 1,5 -10
μm, ali da smo u ovom radu i forme do 20 μm smatrali laktobacilima. Ukazali smo i na činjenicu
da se rod bifidobakterija na preparatu po Gramu nekada veoma teško razlikuje od laktobacila.
Dakle, različite Gram pozitivne štapićaste ili slične štapićastim formama smo tumačili kao
laktobacile. U skladu s tim, najnoviji rezultati molekularnobioloških studija potvrđuju i ukazuju
na još veću fenotipsku raznovrsnost laktobacila. Tako su L. iners , L. crispatus, L. gasseri, L.
jensenii najčešći laktobacili detektovani u vagini, dok se L. acidophilus, L. brevis, L. plantarum,
L. johnsonii, L. fermentum, L. salivarius, L. rhamnosus, L. reuteri, L. paracasei i L. delbrueckii
nalaze ređe, a sve, naravno, zavisi i od korišćenih molekularnobioloških metoda i ispitivane
populacije. [471, 570, 571]. Imajući u vidu bogatstvo roda laktobacila moguće je da
275
mikroskopske forme na fotografijama pripadaju nekom od ovih sojeva laktobacila ali je i
moguće da se radi i o drugim bakterijama. Cilj nam je da ukažemo da različiti sojevi laktobacila
mogu imati različit uticaj na koncentracije pojedinih citokina, i da se te koncentracije citokina
mogu značajno razlikovati u “istoj” populaciji žena koje smo mi na osnovu nekih od
dijagnostičkih kriterijuma (Amsel, Nugent, Ison/Hay, Claeys, NP-6G) svrstali u “zdrave”. Broj
laktobacila predstavljaju važan činilac koji može uticati na krajnje koncentracije nekog
citokina, ali nikako odlučujući kao što smo pokazali na primeru koncentracija IL-12.
Još bolji primer si koncentracije IL-6 u različitim grupama pacijentkinja na osnovu NP6G. Statistički značajna razlika nađena je između grupa:
•
NF/BVF (316,1±4846,2/49,3±99,8);
•
NM/BVF (31,00±80,5/49,3±99,8);
•
NN/BVF (1221,00±9831,3//49,3±99,8).
Trudnice sa nalazom BVF imale su značajno različite koncentracije IL-6 u odnosu na sve tri
grupe pacijentkinja. Ukoliko pogledamo Tabelu ove rezultate jasno je da ih ne možemo
objasniti ni različitim odnosom a ni brojem između laktobacila i BVAB. Tako su pacijentkinje
sa BVF, odnosno pacijentkinje sa najvećim brojem NŠF (BVAB) na mikroskopskom preparatu
imale skoro identične srednje koncentracije ( 49,3 pg/ml) IL-6, kao i pacijentkinje koje su
svrstane u grupu BVN (50,8 pg/ml) i kod kojih je broj BVAB preko 1000X manji u odnosu na
BVF, što je najlakše razumeti ako još jednom pogledamo fotografije pacijentkinja sa BVF i
BVN. S druge strane pacijentkinje iz grupe BVM, kod kojih je broj BVAB između ova dva
nalaza imale su neuporedivo više koncentracije IL-6 ( 3057.1 pg/ml), dakle oko 60X više u
odnosu na ove dve grupe. Jedini zaključak koji možemo doneti iz ovih podataka bio bi da broj
BVAB nikako nije faktor od koga zavise koncentracije IL-6 u grliću materice. Interesantno je
da su Lockwood i sar [572] i Rizza i sar. [573] pre skoro 20 godina objavili ispitivanja u
kojima su pokazali da nisu našli značajniju korelaciju između koncentracija citokina u
cervikovaginalnom sekretu i prisustva različitih mikrobiloških agenasa i stanja vaginalne flore.
Ovi nalazi osporavani su od najvećeg broja autora, a takvo je bilo i naše mišljenje, koji su
smatrali da je broj pacijentkinja uključen u ove dve studije bio mali da bi dozvoljavao takve
zaključke. Međutim, rezultati našeg ispitivanja i NP-6G nedvosmisleno ukazuju da
koncentracije citokina ne zavise od broja bakterija, a da raspodela pacijentkinja može značajno
uticati na dobijene rezultate. Ovde se svakako treba prisetiti i rezultat koje smo dobili na osnovu
retrospektivno modifikovane podele u 6 grupa, a koju smo detaljno komentarisali u diskusiji o
broju PMN. Na osnovu dobijenih rezultata mogli bi smo zaključiti da kod pacijentkinja kod
kojih na mikroskopskom preparatu vidimo 1000X veći broj bakterija ili 1000X veći broj PMN
276
koncentracije citokina u grliću materice ne samo što ne moraju značajno da se razlikuju nego
mogu biti skoro jednake. Dakle neki drugi faktori su uzrok razlika u koncentracijama IL-6.
Koji? naravno, prvi razlog koji smo imali na umu kada smo dobili ovakve rezultate bio je onaj
koji se odnosio na metodologiju ispitivanja. Ipak, ovde se nećemo detaljnije baviti
metodološkim faktorima kao mogućim uzrocima jer je dobro poznato da oni od uzimanja
uzorka, preko transporta i čuvanja pa do korišćenja određenih testova mnogu značajno uticati
na dobijene rezultate. Postupak u kome smo mi dakronski štapić kod trudnica držali u grliću
materice 1 minut je jedan od najčešćih, i verujemo da nije značajnije uticao na ovakve razlike.
Naravno, neko bi mogao da nam zameri i ukaže da se radi o cervikalnim, a ne vaginalnim
koncentracijama citokina, ali je poznato da je uzorkovanje iz vagine još problematičnije od
uzimanja uzorka iz grlića. Tako ispirak iz vagine ne bi dolazio u obzir jer bi tako uključili i
citokine poreklom iz grliča, a aspirirani uzorak i razređenja mogle bi da budu razlog velikih
razlika u rezultatima. Ukoliko bi uzimali uzorak iz vagine brisom ili saturacijom, onda bi s
obzirom na činjenicu da vaginalni mikrobiom proučava vaginalnu floru iz tri dela vagine
(forniks, srednji deo i introitus) i to mogao biti metodološki problem. dakle svakako
uvažavajući činjenicu da su metodološki problemi značajan problem svake studije koja se bavi
određivanjem koncentracija citokina (posebno njihove uporedivosti) ipak mislimo da
metodologija nije mogla u takvoj meri uticati na dobijene rezultate. Drugo, iako koncentracije
citokina koje smo dobili u ovom ispitivanju suštinski odražavaju samo broj i odnos ŠF/NŠF i
ne odražavaju mogući uticaj nijednog od ometajućih faktora uključenih u naše ispitivanje (CA,
KOKE, BIFIDO, LEPTO), mislili smo da bi to mogao biti razlog ovakvim rezultatima.
Međutim ukoliko pođemo od pretpostavke da laktobacili i BVAB predstavljaju i u
kvantitativnom i u kvalitativnom smislu najveći deo vaginalnog mikrobioma. Onda je teško
poverovati da broj ili prisustvo CA, KOKA, BIFIDO ili LEPTO formi može značajnije uticati
na koncentracije citokina. Ovome idu u prilog i rezultati koji se odnose na nepostojanje razlike
u koncentacijama citokina i broja PMN (koje smo takođe posmatrali kao mogući ometajući
faktor). činjenica da se poslednjih godina sve više usmerava pažnja na značaj ćelija domaćina
u formiranju citokinske mreže ovo bi mogao biti jedan od razloga koji objašnjava dobijene
rezultate. Poznato je da su cervikalne i epitelne ćelije vagine važan izvor citokina, a svakako da
u našem ispitivanju ne možemo isključiti kao mogući izvor citokina celu fetomaternalnu
jedinicu, i na neki način pretpostaviti da oni odlučujuće utiču na koncentracije citokina koje
detektujemo u grliću materice. ali u ovakvom modelu to bi značilo da kapacitet bakterijske flore
na neki način ne prelazi granice detektibilnosti nekog citokina, i da one nemaju gotovo nikakav
ili imaju veoma mali uticaj na krajnje koncentracije citokina, sa čime se naravno ne slažemo.
277
Ono što nam se nametnulo kao moguće rešenje jesu rezultati koje smo dobili za apoptozu PMN
i verovatno prisustvo i uticaj MKKL, koji su kao što smo rekli izrazito povećani kod
pacijentkinja sa BV. Mogli bi smo pretpostaviti da su kod pacijentkinja sa BVF koncentracije
MKKL (ili nekih drugih metaboličkih produkata bakterija) značajno veće u odnosu na
pacijentkinje sa BVM i da njihov antiiflamacijski efekat predstavlja objašnjenje za ovakve
razlike u koncentracijama IL-6. Na pitanje a kako su koncentracije IL-6 gotovo iste i kod
pacijentkinja sa BVN i kod pacijentkinja sa BVF mogli bi smo odgovoriti pojednostavljenim
matematičkim modelom: Pacijentkinje sa BVF imaju 1 000 000 BVAB, ali zbog toga one
produkuju 1 000 000 antiinflamatornih supstanci (npr. MKKL) i krajnja rezultanta je 1 što je
koncentracija npr. IL-6, dok pacijentkinje sa BVN imaju 1 000 BVAB i one produkuju 1 000
MKKL pa je i ovde krajnja rezultanta odnosno koncentracije IL-6 jednaka 1, što bi onda
odgovaralo rezultatima koje smo dobili u ovom ispitivanju. Ovaj pojednostavljen matematički
model s obzirom na mogući broj konfauding faktora opet nas vodi do biološke mreže i
interaktoma, odnosno zaključka da izmerene koncentracije nekog citokina predstavljaju krajnju
rezultantu velikog broja indukujućih ili inhibitornih mehanizama i isprepletanih i međusobno
zavisnih odnosa između najmanje tri biološke mreže u našem ispitivanju, mikrobne, citokinske
i apoptotske. Dakle pokušaj svake simplifikacije koncepta biološke mreže često može da
dovede do pogrešnih, ili bolje reći kontradiktornih rezultata, a ova simplifikacija je nažalost
objektivna neminovnost svake in vitro studije. zato ćemo na jednom primeru pokušati da
pokažemo kako drugi pokušavaju da povežu citokine i zapaljenjske procese u vagini.
Autofagija je proces u kome ćelijski makromolekuli i organele (ostarele mitohondrije)
ili unutarćelijski mikroorganizmi bivaju sekvestrirani u formaciji zvanoj autofagozom. Zatim
dolazi do fuzije autofagozoma sa lizozomom i nastanka autolizozoma, unutar koga se
proteinske makromolekularne komponente pomoću lizozomalnih enzima razgrađuju u peptide
i aminokisline i vraćaju u citoplazmu, gde se koriste za ishranu i esencijalne metaboličke
procese[574, 575]. Pored uloge u eliminaciji unutarćelijskih mikroorganizama, autofagija je
veoma važna komponenta urođenog i stečenog imunskog sistema. Jayaram i sar.[576] u svom
radu ukazuju na značaj autofagije u različitim vaginalnim infekcijama. U diskusiji autori
navode da je INF-γ potentan induktor autofagije, obrazlažući to podacima koji su dobijeni na
kulturi ćelija sa hepatocelularnim karcinomom [577]. Takođe autori nas upućuju na studiju
Miettinena i sar. [578] koji su pokazali da različiti sojevi laktobacila indukuju produkciju INFγ u kulturi monocita periferne ćelijske krvi. Na osnovu ovoga oni pretpostavljaju da bi
pacijentkinje sa BV (nedostatak laktobacila), ustvari mogle lučiti manje koncentracije INF-γ
što bi onda dovelo do izostanka indukcije autofagije, a što u eksperimentima kod miševa dovodi
278
do PP [579]. Diskutujući dalje, autori ukazuju na činjenicu da BV povećava prijemčivost za
seksualno prenosive bolesti (C. trachomatis, HIV), a da je za to verovatno delimično odgovorna
i pomenuta sprega: nedostatak laktobacila-manje koncentracije INF-γ izostanak indukcije
autofagije. Nažalost, ovim zaključcima nedostaju formalni, neposredni dokazi. Kakve su bile
koncentracije INF-γ u našem ispitivanju? Pacijentkinje iz grupe BVN su imale značajno veće
koncentracije od svih drugih grupa na osnovu NP-6G; u podeli NP-3G pacijentkinje (slično kao
primer sa IL-6, vidi supra) sa normalnim nalazom imale veće koncentracije od onih sa BV, a
najveće bi bile u intermedijarnoj grupi, dok bi NP-2G pacijentkinje sa BV opet imale veće
koncentracije INF-γ od onih sa normalnim nalazom. Ovi nalazi nisu u skladu sa iznetom
hipotezom autora da je nedostatak laktobacila razlog nižih koncentracija INF-γ. Naše rezultate
i hipoteze pomenutih autora navodimo kao primer da je u literaturi, kada je reč o citokinima (a
i drugim inflamatornim medijatorima), uvek moguće naći rezultate koji su prilično
kontradiktorni za jedan isti citokin, a naročito ako poredimo rezulate in vivo i one rađene u in
vitro uslovima. Tako je verovatno da laktobacili u uslovima koji su opisani u ovom radu [578]
dovode do pojačane produkcije INF-γ, ali je takođe sigurno da u ovakvim uslovima nedostaje
mnogo drugih faktora mikrosredine vagine koji ne mogu da se premeste u laboratoriju. Dakle,
ukoliko se zadržimo na bakterijskoj flori jasno je da ovakvom eksperimentu “nedostaje” veliki
broj bakterija koje ne mogu da prežive uslove izvan svog prirodnog staništa. Sve ove bakterije
mogle bi da imaju uticaj i na laktobacile i koncentracije INF-γ.
Još je zapletenije u patološkim stanjima vaginalne mikroflore, barem toliko koliko je
povećana raznovrsnost i broj bakterijskih vrsta. Ukupna koncentracija bakterija je u većini
slučajeva BV 100–1000 puta veća nego kod zdravih. Drugim rečima, postoje i kvalitativna i
kvantitativna promena mikroflore [580]. Preko 200 različitih bakterijskih vrsta identifikovano
je u vagini i ako pretpostavimo da bar deo ima specifičnu biološku uloge i klinički značaj onda
je jasno koliko je važno da se u budućim ispitivanjima definiše učestalost, kvantitet i značaj
pojedinih mikroorganizama [581]. Dosadašnja ispitivanja nisu uspela da definišu osnovni
mikrobiom vagine, a prema pretpostavkama, on neće biti ni definisan jer takva zajednica u
vagini i ne postoji. Verovatnije je da će i budući nalazi potvrditi današnje, po kojima je vaginalni
mikrobiom karakterističan za svake ženu, da se kod nekih više, a kod drugih manje menja, i da
će buduće lečenje podrazumevati individualizovani pristup. Na primer, novim molekularno
biološkim oruđima je G.vaginalis detektovana kod preko 90% žena, što potvrđuje da njeno
prisustvo u određenoj koncentraciji ne dovodi do negativnih uticaja na zdravlje žene, a možda
je prisustvo ovog mikroorganizma u manjem broju poželjno i tako sprečava naseljavanje nekih
drugih opasnijih patogena. Još jedna potvrda značaja kvantifikacije “stanovnika” ekološke niše.
279
Ono što nam je danas jasno jeste činjenica da se biološka uloga pojedinih mikroorganizama
menja u zavisnosti od kvalitativnih i kvantitativnih promena u celoj mikrobiološkoj zajednici.
Rezultati molekularnih studija ukazuju da BV predstavlja polimikrobni sindrom koji se može
razlikovati kako u kvantitativnom tako i u kvalitativnom smislu. Ovo je bio jedan od razloga
zbog kojih smo svoje trudnice sa patološkom vaginalnom florom, odnosno BV, razvrstali u tri
kategorije, a na osnovu semikvantitativne procene broja bakterijskih formi na mikroskopskom
preparatu.
Trudnice sa BV imale su veće koncentracije INF-γ nego pacijentkinje sa normalnim
nalazom u slučaju podele u 3 grupe. U svom prethodnom istraživanju smo ustanovili, iako nije
bilo statističke značajnosti, izražen trend u porastu lokalnih koncentracija INF-γ sa
"pomeranjem" mikroskopskog nalaza od normalnog ka patološkom [582]. Takođe, u nedavnom
ispitivanju nađene su značajno veće koncentracije proinflamatornih citokina (IL-1β, IFN-γ,
GM-CSF i TNF-α) kod pacijentkinja kod kojih je izolovana G. vaginalis i pigmentovane i
nepigmentovane Gram negativne bakterije koje po autorima verovatno odgovaraju Prevotella
spp. [583]. Kako u studiju nisu bile uključene pacijentkinje sa BV pretpostavili bi da
pacijentkinje sa BV imaju još više koncentracije IFN-γ jer su G. vaginalis i Prevotella spp. na
hiljade puta brojnija kod pacijentkinja sa BV. Međutim zahvaljujući rezultatima ovog
ispitivanja i NP-6G znamo da ove pacijentkinje ne samo da ne moraju da imaju povećane
koncentracije IFN-γ, nego da je takođe moguće da one budi iste ili čak i značajno niže, bez
obzira na hiljade puta veći broj bakterija. Aboul Enien i sar. [584] zaključuju da je BV udružena
sa povećanim koncentracijama IFN-γ i TNF-α, što može biti od značaja kod pacijentkinja sa
nepoznatim uzrokom steriliteta. Ukratko, nalazi dobijeni u vezi s koncentracijom citokina u
vaginalnom sekretu su toliko raznoliki, ne samo po vrednostima, već i metodologiji, da je
nemoguće doneti konačni sud. Imajući u vidu ove rezultate i koncept biološke mreže onda ne
čudi što u ovom ispitivanju nismo našli statističku značajnost između inflamatornih markera
kao što su mikroskopski nalaz (infekcija), broj, vijabilnost i apoptoza PMN (inflamacija) ili
koncentracije proinflamatornih citokina. S obzirom na činjenicu da inflamacija/infekcija
predstavlja najvažniji faktor u etiopatogenetskim zbivanjima vezanim kako za terminski tako i
za PP ovakvi rezultati su u svakom slučaju neočekivani, i na prvi pogled razočaravajući za
istraživača. Generalno, veći je broj studija koje ukazuju na povezanost različitih inflamatornih
markera i PP, ali nije mali ni broj onih koje nisu našle takvu povezanost. S obzirom da se ove
studije značajno metodološki razlikuje najbolji utisak o vrednosti inflamatornih markera
svakako dolazi iz metaanalitičkih studija. Veći broj ispitivanja, a samim tim i metaanalitičkih
studija odnosi se na populaciju pacijentkinja sa simptomima i znacima PP koje, kao što smo
280
već objasnili, iz mnogo razloga nisu uporedive sa rezultatima koje smo mi dobili u ovom
ispitivanju. Conde-Agudeloi sar. [586] su u svoj metaanalitičkoj studiji analizirali vrednost
različitih biomarkera u predviđanju PP kod asimptomatskih žena. U analizu su uključene 72
opservacione studije, sa 89.786 žena, i analizirano je 30 biomarkera. Zaključak autora je da
nijedan od ovih biomarkera ne ispunjava kriterijume da bi bio upotrebljiv u kliničkoj praksi kao
prediktor PP. Podatak da se nijedan od analiziranih biomarkera nije izdvojio svojom vrednošću
ukazuje da da se radi o kompleksnim i međusobno zavisnim etiopatogenetskim zbivanjima na
koja može da utiče veliki broj faktora [586-590], što potvrđuju i rezultati našeg ispitivanja.
Poslednjih decenija je ispitivano preko 100 različitih biomarkera i jedini koji je se izdvojio
svojom vrednošću i konstantnošću je test kojim određujemo koncentracije fetalnog fibronektina
(FFN) u cervikovaginalnom sekretu [591-596]. Fetalni fibronektin (FFN) je glikoprotein koji
produkuje horion membrane i u najvećim koncentracijama nalazi se u prostoru između decidue
bazalis i fetalnih membrane gde kao adhezivni molekul ima ulogu “tkivnog lepka” koji
omogućava da fetalne membrane i decidua majke ostanu “slepljene”. Međutim, ipak treba reći
da ovaj test ima veliku vrednost u kratkoročnom predviđanju (7-10 dana) PP kod žena sa
znacima i simptomima PP, kao i visoku negativnu prediktivnu vrednost kod asimptomatskih
pacijentkinja, takođe za period od 7-14 dana. Ipak, ovaj test ima malu vrednost u predviđanju
PP kod asimptomatskih pacijentkinja, što bi opet bila najveća vrednost idealnog
biomarkera[490-498]. Po našem mišljenju ovako dobri rezultati su u najvećoj meri posledica
činjenice da FFN ne predstavlja marker infekcije i/ili inflamacije nego pre svega marker
uterinih kontrakcija i promen na grliću kojima uzročni faktor u najvećem broju slučajeva jesu
infekcija i/ili inflamacija, ali one nemaju direktan uticaj na koncentracije FFN. Ovakav stav
potvrđuju i rezultati mnogobrojnih studija koje nisu nas povezanost koncentracija FFN sa
različitim poremećajima vaginalne flore, ka ni da je lečenje u takvim slučajevima imalo ikakvog
uticaja na detekciju i koncentracije FFN [597-601]. U skladu sa našom prethodnom diskusijom
mogli bi smo reći da je broj mogućih ometajućih faktora, ili broj jedinica u zamišljenoj
biološkoj mreži fetalnog fibronektina mnogo manji u odnosu na mikrobnu ili citokinska, ili još
važnije, da jedinice iz ove dve mreže nemaju gotovo nikakav direktan ili indirektan uticaj na
koncentracije FFN. Kao jedan od mogućih faktora koji može uticati na povećane koncentracije
FFN najnovije studije navode seksualni odnos (unutar 48h) što se objašnjava prisustvom
izomernog obilka ovog glikoproteina i u spermi partnera, pri čemu ne pominju mehanički faktor
ili prostaglandine sperme koji možda mogu dovesti do kidanja u horiodecidualnom spoju i
povećanih koncentracija citokina [602-604].
281
Dakle za razliku od markera u našem ispitivanju i tri vrlo komplikovane i međusobno
isprepletene biološke mreže (mikrobna, citokinska, apoptotska), FFN suštinski zavisi od
neuporedivo manjeg broja faktora i zbog toga imaju značajno veću prediktivnu vrednost. I drugi
faktori kao što su dinamičnost vaginalne flore, genetski i epigenetski takođe imaju mnogo manji
potencijalni uticaj na koncentracije FFN nego na markere koji su deo ovog ispitivanja.
Činjenice, da ovaj test ima vrednost u kratkoročnom predviđanju PP, kao i nisku pozitivnu
prediktivnu vrednost, ustvari govore da je ovaj test marker finalnih ili bolje rečeno posledičnih
zbivanja, dok mi pokušavamo da definišemo početne ili uzročne markere. Ako se prisetimo da
je PP suštinski sindrom, ili bolje rečeno da je njegova etiologija multifaktorijalna, onda je jasno
zašto u prethodnih 30 godina nismo uspeli da u kliničku praksu uvedemo ni jedan od markera
infekcije i/ili zapaljenja, i zbog čega su rezultati dosadašnjih studija prilično kontradiktorni.
Ova diskusija o FFN može se primeniti i na merenje dužine grlića materice, koji je zajedno sa
ovim testom najbolji prediktor PP, jer se i u ovom slučaju radi o događaju (skraćen grlić) koji
je posledičan, finalni, a ne uzročni. Dakle ukoliko zamislimo jednu preciznu vagu koja tokom
trudnoće svakako ne miruje nego pravi otklone na jednu (aktivacija fetalnih membrana,
promene na grliću, kontrakcije miometrijuma=PP) ili drugu stranu (sva tri mehanizma u stanju
mirovanja= nastavak trudnoće), koji imaju graničnu liniju, i ukoliko se ona pređe process dobija
ireverzibilan karakter i može se završiti PP. Tako bi markeri koje smo mi ispitivali (bakterijska
flora, broj i vijabilnost PMN, koncentracije citokina) beli sitni tegovi na tasu koji sami
pojedinačno ne mogu da se približe graničnoj liniji, a koji bi zajedno mogli da dovedu i do
pojave fetalnog fibronektina ili skraćenja grlića materice koji imaju značajno veću težinu sa
kojom čitav tas dovode veoma blizu granične linije čime se značajno povećava rizik za PP.
Dalje oni
mnogo manje zavise od metodologije ispitivanja jer uzorkovanje fetalnog
fibronektina i merenje dužine grlića predstavljaju precizno definisane metodološke procedure,
a što je još značajnije dobro su i definisane njihove granične vrednosti (cut-off). Ako to
poredimo sa našom metodologijom i našim potencijalnim prediktorima onda je lako uočiti da
u našem ispitivanju ni za jedan od njih (isključujući dužinu grlića) nemamo granične vrednosti.
Tako nemamo jasnu granicu između normalne i patološke vaginalne flore, normalnog ili
patološkog broja PMN, kao ni granične vrednosti koncentracija ni za jedan od ispitivanih
citokina, što su već sasvim dovoljni razlozi za nisku prediktivnu vrednost ovih markera, čak
ukoliko i potpuno zaboravimo na metodološke problem koje prate parametre ispitivane u ovom
radu. Zato je po našem mišljenju prvi preduslov da bi u budućnosti uopšte mogli porediti ovakve
studije uspostavljanje jedinstvenih dijagnostičkih kriterijuma, i tek tada bi mogli očekivati i
bolje rezultate. Naravno, svesni smo da se do takvih konsenzusa teško dolazi, a to je verovatno
282
jedan od razloga što su Nugentovi i Amselovi kriterijumi preko dve decenije zlatni standard u
dijagnozi BV, mada su u međuvremenu pojedini autori predlagali i bolje podele (Ison/Hay,
Claeys, Donders) o čemu smo takođe diskutovali. Rezultati koje smo dobili u ovom ispitivanju
ukazuju da je došlo vreme da se ozbiljno preispita vrednost oba “zlatna standarda” i kliničkog
(Amsela) i istraživačkog (Nugent). Zbog toga nam se čine veoma važnim rezultati našeg
ispitivanja prikazani u Tabeli 3.12. Dakle da smo NP-6G transformisali u NP-3G kako je
opisano u Metodologiji, a što je uporedivo sa Nugentovom podelom (“istraživački zlatni
standard”), onda bi pacijentkinje sa BV imala najveće koncentracije IL-6, one sa
intermedijarnom grupom manje, a najmanje koncentracije ovog citokina bile bi kod
pacijentkinja sa normalnim nalazom. Ovakvi rezultati bili bi u skladu sa najvećim brojem do
sada objavljenih studija koje su pokazale da pacijentkinje sa BV imaju značajno veće
koncentracije IL-6 u odnosu one sa normalnim, dok su podaci o intermedijarnoj grupi
kontradiktorni. Ova kontradiktornost poslužila bi nam za objašnjenje koncentracija IL-6 u ovom
ispitivanju dobijene na osnovu podele po Nugentu, a po kojoj su pacijentkinje sa
intermedijarnim nalazom imale najveće koncentracije IL-6, slede one sa BV, a najmanje su kod
onih sa normalnim nalazom. Naravno u tumačenju razlika ovih citokina podsetili bi da je u NP3G “intermedijarana” grupa formirana spajanjem pacijentkinja nalazom NN+BVN. S druge
strane da je ovo ispitivanje rađeno na osnovu Amselovih dijagnostičkih kriterijuma (”klinički
zlatni standard”) onda bi smo imali samo dve grupe pacijentkinja normalne i BV kao što je i
slučaj kad NP-6G transformišemo NP-2G, normalne i BV. U tom slučaju na osnovu Amselovih
kriterijuma (NP-2G) ne bi našli statističku značajnost za koncentracije IL-6 između ove dve
grupe pacijentkinja, iako bi srednje koncentracije IL-6 bile više kod pacijentkinja sa BV. Sada
treba da pogledamo i rezultate koje su dobijene za koncentracije ovog citokina u podelama po
Ison/Hayu i Claeysu koje takođe imaju grupe normalna, intermedijarne i BV, ali još dve
odnosno tri nove grupe. Tako u podeli po Ison/Hayu imamo 78 pacijentkinja koje su “oduzete”
Nugentu i to 35 pacijentkinja sa “čistim” nalazom (odgovara hipocelularnom nalazu NP-6G) i
43 pacijentkinje kod kojih je pregledom mikroskopskog preparata po Gramu na uvećanju x1000
viđena predominacija koka. Nalaz koji potpuno odstupa od prethodnih jeste da su pacijentkinje
sa BV u ovakvoj podeli imali najniže koncentracije IL-6 (45,4 pg/ml), dok su u grupi koke ove
koncentracije bile veoma visoke 3 889, 0 pg/ml, iz čega indirektno možemo zaključiti da je
najveći broj ovih pacijentkinja bio u Nugentovoj intermedijarnoj grupi. Kako podela po Cleaysu
nema grupu čist nalaz, onda je 35 pacijentkinja iz ove grupe i 39 iz grupe koke po Ison/Hayu,
svrstano u dve nove grupe, jedna sa ekstremno velikim brojem PMN (leukoreja) i druga sa
nalazom sličan normalnom (načelno BIFIDO u NP-6G). Ako sada pogledamo te rezultate
283
interesantno je da su pacijentkinje sa “najvećim” brojem PMN imale najniže koncentracije IL6, iako su PMN značajan izvor IL-6. Ovakav nalaz mogli bi smo dovesti u vezu sa rezultatima
nekih istraživanja koja su pokazala da IL-6 ima značajnu ulogu kako u inicijalnoj regrutaciji
PMN tako i u rezoluciji infekcije u kojoj apoptoza PMN igra veoma važnu ulogu. Tako su
Fielding i sar. [605] i svom eksperimentalnom modelu peritonitisa kod miševa pokazali da IL6 značajno ograničava regrutaciju PMN i oslobađanja citokina, tako da bi niske koncentracije
IL-6 u našem ispitivanju mogle dovesti u vezu sa ovim rezultatima [605]..S druge strane Biffi i
sar. [606] su pokazali da IL-6 odlaže apoptozu PMN, što bi onda bilo u suprotnosti sa
rezultatima koje smo mi dobili.
Tabela 3.21: Srednje vrednosti koncentracije IL-6 kroz Nugent, Ison/Hay, Claeys, Amsel
i NP-6G kriterijume
IL-6
NP-6G
n
srednja vrednost
standardna devijacija
275
316,06
4846,18
NOR FULL
141
31,00
80,47
NOR MID
67
1221,00
9831,23
NOR NULL
45
50,84
99,16
BV NULL
55
3057,15
22447,96
BV MID
60
49,31
99,81
BV FULL
IL-6
Clayes
n
srednja vrednost
standardna devijacija
347
256,60
4314,30
Normalan
85
1988,76
18057,20
Intermed
132
654,05
7002,53
BV
4
12,28
16,45
Koke
44
19,82
45,38
Leukoreje
32
36,10
105,23
Sličan normalnom
IL-6
Ison/Hay
n
srednja vrednost
standardna devijacija
35
39,09
70,58
Čist nalaz
383
235,94
4106,60
Normalan
69
1193,63
9686,95
Intermedia
114
45,39
91,74
BV
43
3889,02
25389,65
Koke
IL-6
Nugent
n
srednja vrednost
standardna devijacija
403
224,75
4003,45
Normalan
104
1631,37
16324,59
Intermed
137
629,62
6873,74
BV
Tabela 3.22: Različite koncentracije IL-6 po grupama a na osnovu tri različite podele (NP-6G; NP-3G;
NP-2G)
NP-6G
IL-6 pg/ml
NP-3G
IL-6 (pg/ml)
NP-2G
IL-6 (pg/ml)
284
NOR FULL
316,1
NOR MID
31,0
NOR NULL
1221,0
BV NULL
50,8
BV MID
3057,1
BV FULL
49,3
Normalan
173,5
Intermed
635,9
BV
1553,3
Normalan
522,6
BV
1052,4
Ko što smo rekli na osnovu NP-6G statistički značajna razlike nađene su između različitih grupa
za još dva citokina:
IL-1β:

NF/BVN (1061,7±1376,2//1397,4±1460,6);

NF/ BVM (1061,7±1376,2/1546,8±1590,2);

NF/BVF (1061,7±1376,2/1775,9±1800,5);

NM/BVF (1169,6±1244,5/1775,9±1800,5) i,
IFN-γ:

NF/BVN (3719,0±16605,7/9980,8±26590,6);

NM/BVN (1104,3±9196,5/9980,8±26590,6);

NN/BVN (1271,9±7416,2//9980,8±26590,6);

BVM/BVN (507,0±3666,7/9980,8±26590,6);

BVF/BVN (34,6±155,7/9980,8±26590,6).
Ove rezultate nećemo detaljnije komentarisati jer bi bili veoma slični onima koji se odnose na
koncentracije IL-12 i IL-6.
Statistička analiza prethodno diskutovanih podataka kao što smo rekli rađena je Kruskal
Wallisovim testom kao najboljim za ovu vrstu podataka, ali neki od statističara koje smo
konsultovali imali su drugačije mišljenje i smatrali su da korišćenje ANOVE i Tamhanovog
post hoc testa ne bi dalo ništa lošije rezultate. Ne ulazeći u domen statistike na grafikonu br
su prikazani rezultati koje bi dobili da smo koristili drugu statističku metodu. Tako bi u
Nugentovoj podeli dobili statističku značajnost za IL-2, IL-10, IL-13 i IL-1β Grafikon broj .
Ovo je dobar primer koliko i izbor statističkog postupka može bitno uticati na dobijene
rezultate.
U ovom ispitivanju statističkom obradom podataka (t-test, univarijantna nominalna regresiona
analiza i multivarijantna logistička regresiona analiza) nismo našli povezanost koncentracija ni
jednog od 13 ispitivanih citokina sa terminom porođaja. PP.
285
Istim statističkim postupkom nađena je značajnost za samo jednu (BIFIDO) od svih grupa
pacijentkinja koje su formirane na osnovu različitih dijagnostičkih kriterijuma (Nugent,
Ison/Hay, Claeys, NP-6G, NP-3G, NP-2G, NP-6G/CA, NP-6G/LEPTO), a t-testom nije nađena
statistička značajnost ni kod podele na osnovu Amselovih kriterijuma. [607-615].
Ako zaboravimo faktore kao što su dinamičnost vaginalne flore, imunologiju, genetiku
i epigenetiku, mislimo da su rezultati ovog ispitivanja i navedeni primeri jasno pokazali kako
primena različitih dijagnostičkih kriterijuma može bitno uticati na rezultate i zaključke
ispitivanja. Dakle prvi preduslov da bi u budućnosti uopšte mogli porediti ovakve studije jeste
uspostavljanje jedinstvenih dijagnostičkih kriterijuma, i tek tada bi mogli očekivati i bolje
rezultate. Naravno, svesni smo da se do takvih konsenzusa teško dolazi, a to je verovatno jedan
od razloga što su Nugentovi i Amselovi kriterijumi preko dve decenije zlatni standard u
dijagnozi BV, mada su u međuvremenu pojedini autori predlagali i bolje podele (Ison/Hay,
Claeys, Donders) o čemu smo takođe diskutovali. Rezultati koje smo dobili u ovom ispitivanju
ukazuju da je došlo vreme da se ozbiljno preispita vrednost oba “zlatna standarda” i kliničkog
(Amsela) i istraživačkog (Nugent). Imajući u vidu navedene činjenice koje ukazuju na veliki
broj faktora koji mogu uticati na etiopatogenetska zbivanja kao i karakteristike pojedinih
markera, slažemo se sa onima koji misle da je malo verovatno da će u budućnosti biti pronađen
jedan marker za predviđanje PP, i da je realnije očekivati da će možda neki set markera koji
kombinuju klinički nalaz, ultrazvučni pregled, genetske i epigenetske analize i zapaljenjske
biomarkere moći da izdvoji iz populacije asimptomatskih trudnica one koje imaju visok rizik
za PP [614].
286
Primenom analize ROC krive testirana je specifičnost i senzitivnost pojedinih parametara
(videti legendu slike 1 grafikon) u odnosu na nalaz mikroskopskog nalaza vaginalnog sekreta
normalan (NF, NM i NN) ili patološki (BVF, BVM i BVN).
Grafikon 3.45: ROC kriva za QPMN-B, IL-6, IL-1 i pH
Na prvom grafikonu prikazani su rezultati koji se odnose na prvih 217 pacijentkinja kod kojih
je određivana vijabilnost PMN, dok su na drugom grafikonu prikazani rezultati koji su dobijeni
analizom rezultata ukupnog broja trudnica uključenih u ispitivanje (732). Na oba grafikona
jasno se vidi da su najbolji rezultati dobijeni za vrednosti pH (diskutovano prethodno), dok su
ostali parametri pokazali značajno slabije rezultate.
Tabela 3.23: ROC kriva - tabelarni prikaz parametara koji su dali statističku značajnost p<0.05
Test
Površina
ispod krive
Standardna
greška
Nivo
značajnosti
(p)
IL-6
IL-1β
0,560
0,595
0,028
0,027
0,028
0,001
95% Granica Pouzdanosti
CI
Minimum
Maximum
0,506
0,615
0,542
0,647
Zato se i mehanizam normalnog i PP udruženog sa infekcijom, uvek moraju posmatrati kao
kompleksan sistem, sačinjen od velikog broja jedinica koje su međusobno povezane
mnogobrojnim i kompleksnim vezama, tako da je često veoma teško utvrditi šta je uzrok, a šta
posledica određenih zbivanja. U trudnoći se stvari dodatno komplikuju postojanjem dva
287
subjekta, majka i fetus, i međusobnim interakcijama njihovih sistema, a epigenetika nas
upozorava da ako se baka trudnice hranila loše ili pušila dok je nosila majku trudnice da bi i to
moglo bitno uticati na tok i ishod trudnoće kod unuke. Kako mi u našem ispitivanju promene u
kvantitativnom i kvalitativnom sastavu mikrobioma vagine smatramo primarnim, uzročnim
faktorom koji odlučujuće utiče na sve ostale ispitivane parametre i koji su tako posledica
promena u vaginalnom mikrobiomu (broj, vijabilnost i apoptoza vaginalnih PMN,
koncentracije citokina) najveći trud uložen je u pokušaje da na osnovu kliničkih i
mikroskopskih parametara pokušamo preciznije povući granicu između „normalnog“ i
„patološkog“ u mikroekološkoj zajednici kava je vaginalna. Tako ove promene u broju i vrsti
različitih mikroorganizama (mikrobska mreža) mogu na direktan ili indirektan način dovesti do
promena u druge dve (citokinska i apoptotska mreža), a u zavisnosti od ovih mnogobrojnih i
međusobno zavisnih lokalnih i/ili sistemskih signala doći će do stvaranjem određene mreže
citokina koja onda može dovesti do povoljnih ili nepovoljnih zbivanja u trudnoći. Prisustvo
proinflamatornih i antinflamatornih citokina dokazano je u različitim periodima trudnoće i na
osnovu dosadašnjih ispitivanja verovatno je da su određena MC karakteristične za određene
periode trudnoće. Takođe, veliki broj studija je pokazao da kod trudnica sa infekcijom dolazi
do značajnih promena u koncentracijama citokina kao i njihovih međusobnih uticaja. [159163]. Trudnoća je fiziološko stanje u kome dolazi do promene Th1/Th2 imunskog odgovora
tako što dolazi do pojačane produkcije Th2 citokina i sledstvene predominacije Th2 imunskog
odgovora. I kod terminskog i kod prevremenog porođaja dolazi do aktivacije inflamatorne
kaskade u fetalnim mebranama, decidui i cerviksu, a citokini imaju veoma važnu ulogu. [118,
119]. Proinflamatorni citokini IL-1β, TNF- i IL-6 učestvuju i incijaciji urođenog i propagaciji
stečenog imunskog odgovora. Na osnovu podataka kojima danas raspolažemo, mogli bi smo
reći da IL-1, TNF-, IL-6 i IL-8 igraju najvažniju ulogu u etiopatogenetskim zbivanjima
vezanim za PP udružen sa infekcijom [154-157].
Kako još postoje mnoge nepoznanice i dileme u etiologiji i patogenezi PL, i kako nijedna od
postojećih teorija ne može objasniti precizan tok događaja za pretpostaviti je da bar jedan deo
PP ima svoju osnovu u genetskoj predispoziciji pojedinca. Ovakav pristup mogao bi objasniti
zašto se kod nekih pacijentkinja sa BV dolazi do PP, a kod drugih ne. Ipak, malo je verovatno
da PP nastaje kao rezultat poremećaja jednog gena. Takođe postoji mogućnost da su ovi
poremećaji na genima ustvari epifenomeni, to jest da do njihovog poremećaja ili poremećaja u
translaciji njihovih proteina dolazi tek pošto se neki drugi faktor (npr. infekcija) umešao u
kaskadu događaja koji vode do PP. Romero i sar. ukazali su da je PL najbolje posmatrati kao
sindrom u kome prevremenom porođaju prethode ili infekcija ili ishemija na nivou
288
fetomaternalne jedinice. Ovi poremećaji onda dovode do pojačane produkcije citokina i drugih
medijatora inflamacije, koji onda dovode do stimulacije sinteze PG, povećanja kontraktilnosti
miometrijuma i PP. Interesantna je teorija po kojoj postoji genetska predispozicija za pojačan
imunski odgovor (engl. hyperressponsiveness) na infekciju, koji onda dovodi pojačane
produkcije proinflamatornih citokina. U prilog genetskoj predispoziciji za PP govori i činjenica
da trudnice sa prethodnim PP imaju značajno veći rizik za ponovni PP, a pokazano je da postoji
rasna predispozicija za PP. Takođe je jasno da je biosinteza ovih proinflamatornih citokina pod
preciznom genskom kontrolom. Geni koji kodiraju IL-1β, IL-6, IL-12p70, INF-γ i IL-10 su
klonirani i sekvencirani, a što je još važnije sada je nedvosmisleno pokazano da postoje
polimorfizmi za ove gene koji značajno mogu uticati na njihovu transkripcionu aktivnost.
Nosioci takvog genskog polimorfizma, bilo da su homozigoti ili heterozigoti, pokazuju
povećanu sklonost za određenu bolest, a tako i za PP. redispozicija domaćina kao imunskog
hiperrespondera može dovesti do porođaja [616, 617]. Međutim, klasična genetika sama ne
može objasniti raznolikost fenotipova unutar populacije, kao ni činjenicu da uprkos identičnih
DNA sekvenci monozigotni blizanci mogu imati različit fenotip, naprimer rizik za PP [618].
Pokazalo se da definisanje strukture gena i genetska sklonost za nastanak određene bolesti
predstavljaju samo vrh ledenog brega. Danas je potpuno jasno da su mehanizmi koji regulišu
aktivnost gena (fiziologija gena) mnogo važniji od same genske strukture (anatomije gena).
Epigenetske promene se definišu kao mitotski i mejotski nasledne i stabilne promene ekspresije
gena, potencijalno reverzibilne, ali bez promene nukleotidne sekvence. Glavni epigenetski
mehanizmi odgovorni za funkciju gena su: 1) metilacija molekula DNA; 2) modifikacija histona
i 3) uticaj regulatornih nekodirajućih RNA na ekspresiju gena (4). Ova tri najvažnija
epigenetska mehanizma međusobno su funkcionalno isprepleteni gradeći kompleksnu
epigenetsku mrežu koja reguliše mnogobrojne ćelijske procese, tako što aktiviše ili deaktiviše
genetsku informaciju. Dakle jasno je da identifikacija i bolje razumevanje svih epigenetskih
modifikacija predstavljaju sledeći veliki korak za bolje razumevanje ljudske biologije a tako i
fenomena PP [619-624].
Zbog toga smatramo da bi naša semikvantitativna podela grupe pacijentkinja na tri
kategorije (NORMAL FULL, MID, NULL) mogla da bude od koristi kako u studijama koje
ispituju koncentracije različitih zapaljenjskih medijatora u vagini tako i u onima u kojima se
kvantifikuju (QPCR) pojedini sojevi laktobacila. Pošto kod jedne pacijentkinje prevlađuje
najčešće jedna ili dve vrste bakterija, sasvim smislenom nam se čini ideja “biopsije“ preparata
po Gramu”, kvantitativnog PCR i mikroskopskog pregleda preparat po Gramu, u pokušaju da
289
izdiferenciramo još neki od sojeva laktobacila kao što su to uradili Verhelst i sar. za L. crispatus,
L. gasseri i L. iners[213, 216, 456, 471]. Madan i sar. [625] su ispitivali koncentracije 10
citokina (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ, IFN-α2, IL-1RA, MIP-1α, MIP-1β i RANTES) kod
adolescentkinja i odraslih i ni za jedan od ispitivanih citokina nisu našli značajnije razlike u
njihovim koncentracijama. U istom ispitivanju, kod samo 40% adolescentkinja su našli L.
jensenii, koje su bile oko 4 puta ređe nego kod odraslih pacijentkinja. Ovaj nedostatak L.
jensenii uz značajne koncentracije BVAB (Megasphaera, BVAB1–3) autori tumače kao
moguću veću učestalost asimptomatske BV u populaciji adolescentnih pacijentkinja. Ako
prihvatimo ovakav zaključak autora, onda bi asimptomatska BV kod adolescentkinja trebalo da
da povišene koncentracije proinflamatornih citokina ali, kao što smo rekli, te razlike nisu
nađene. Sve ovo govori o velikom broju faktora koji mogu uticati na koncentracije zapaljenjskih
medijatora.
Mogli bismo da zaključimo da laktobacili generalno smanjuju koncentracije
proinflamatornih, a povećavaju koncentracije antiinflamatornih medijatora i tako smanjuju
rizik od PP. Neki sojevi laktobacila (L.gasseri) imaju proinflamatorne efekte i ukoliko su oni
pretežna laktobacilarna flora, to bi moglo povećati rizik za nastanak PP. Možda laktobacili i
nemaju značajnijeg uticaja na koncentracije citokina. Moguće da mikroskopski pregled (ili
Nugentov zbir 0-3, normalan nalaz) bez obzira na predominaciju laktobacilarne flore (L. iners)
ne može da isključi rizik od PP, s obzirom na pokušaje da se na osnovu mikroskopskog pregled
preparata po Gramu razlikuju pojedini sojevi laktobacila.
Stanje potpune ravnoteže i mirovanja pro-zapaljenjskih i anti-zapaljenjskih činilaca ne
postoji jer u svakom trenutku prevagnu jedni ili drugi, a ova odstupanja imaju granice unutar
kojih ne dolazi do štetnih zbivanja za trudnoću. Kada prevagnu proinflamatorni medijatori
dolazi do PP, u suprotnom, do posterminskog porođaja. Ovakav stav potvrđuju mnogi
eksperimentalni podaci koji pokazuju da primena proinflamatornih medijatora dovodi do PP, a
da se primenom antiinflamatornih medijatora (TGF-β, IL-10) ovi mehanizmi mogu zaustaviti.
Jedan isti citokin mogu da proizvode različiti tipovi ćelija ili različiti tipovi ćelija mogu
produkovati različite izoforme istog citokina. Ali citokini verovatno nikada ne deluju izolovano,
nego uz indukciju i/ili inhibiciju drugih citokina, stvarajući tako mrežu citokina koja će dovesti
do određenog ćelijskog odgovora. Novija istraživanja jasno pokazuju da i bakterije, pored naših
ćelija, produkuju različite molekule koji mogu imati značajan efekat na kapacitet leukocita i
tkivnih ćelija da produkuje određenu mrežu citokina. Mreža citokina zajedno sa mikrobnom
mrežom i dinamične promene u oba ova sistema su verovatni najvažniji razlozi zbog kojih
290
citokini neće imati značajniju ulogu u predikciji PP, na šta ukazuju i rezultati drugih ispitivanja
i metaanalitičkih studija.
3.8
BIFIDO FORME I PREVREMENI POROĐAJ
U ovom poglavlju zbirno ćemo prikazati rezultate koji se odnose na vrednost različitih
poremećaja vaginalne flore, broja i vijabilnosti PMN, koncentracija ispitivanih citokina i dužine
grlića materice u predviđanju PP, odnosno u proceni rizika za PP.

Primenom 2 testa ispitivano je postojanje asocijacije između različitih nalaza
mikroskopskog sekreta i broja PMN određivanog semikvantitativnim metodima. Takva
asocijacija nađena je samo za grupu pacijentkinja kod kojih smo mikroskopskim
nalazom detektovali BIFIDO forme (χ2=20,989; df=2; p<0.005).

U ispitivanju odnosa između termina porođaja i procenta apoptoze, semikvantitativnog
broja PMN, koncentracija ispitivanih citokina i dužine grlića materice korišćena je i
univarijantna nominalna regresiona analiza (t-test, Leveneov test), a statistička
značajnost nađena je samo u odnosu na dužinu grlića materice (p<0,001).

Logističkom multivarijantnom analizom utvrđivan je značaj svakog od ispitivanih
parametara u predviđanju PP i pokazano da samo mikroskopski nalaz preparata na
Gramu na kome smo detektovali BIFIDO forme i dužina grlića materice mogu da se
koriste u predviđanju PP. Pacijentkinje kod kojih su detektovane BIFIDO forme imale
su 9,8 puta veći relativni rizik (RR=9,8; 95% CI 2,7-34,6) za preterminski porođaj u
odnosu na pacijentkinje sa normalnim nalazom ili BV. Pacijentkinje sa kraćim grlićem
materice takođe su imale su 1,2 puta povećan relativni rizik (RR=1,2; 95% CI 0,7-0,9),
dakle značajno manji u odnosu na BIFIDO.

Na osnovu NP-6G kod 12 trudnica sa nalazom NF i 19 sa nalazom NM nađene su
BIFIDO forme. Kod trudnica iz grupe NN i BVN BIFIDO su detektovane kod 12,
odnosno 5 pacijentkinja, u grupi BVM kod 2 pacijentkinje, dok kod trudnica sa BVF
nismo detektovali BIFIDO forme. Interesantno je da je 86% (43/50) pacijentkinja sa
BIFIDO
formama
bilo
u
grupi
sa
normalnim
mikroskopskim
nalazom
(NF+NM+NN=12+19+12).

Rezultati KOH testa: Od 42 pacijentkinje sa BIFIDO formama kod 80% (34/42) test je
bio negativan.

Rezultati pH testa: Kod 17 pacijentkinja pH je bio veći od 4,5, a kod 33 pacijentkinje
normalan. Srednja vrednost pH kod pacijentkinja BIFIDO formama bila je pH= 4,63
291
kod pacijentkinja sa BV pH=5,19 dok su pacijentkinje sa normalnim nalazom imale
srednju vrednost pH= 4,29 i ove razlike između svake od ove tri grupe bile su statistički
značajne (p˂0,01).

Od 50 trudnica sa BIFIDO formama kod 27 je mikroskopski detektovan CA, i to kod
17 CA NULL, kod 6 CA MID i kod 4 CA FULL. Preko 50% pacijentkinja imalo je i
mikroskopski detektovanu CA.

U grupi BIFIDO KOKE su mikroskopski detektovane kod 64% (32/50), a LEPTO
forme kod 16% (8/50) pacijentkinja.

Vijabilnost PMN bila je značajno produžena , ali su zato srednje vrednosti procenta
apoptoze kod trudnica sa BIFIDO formama (7,3%) bile niže u odnosu na one sa
normalnim nalazom (12,7%) i BV (15,7%). Ova razlika je bila statistički značajna u
odnosu na trudnice sa normalnim nalazom i BV (p˂0,001), dok statistička značajnost
nije nađena kod pacijentkinja sa BV i normalnim nalazom (p>0,001).

Srednje koncentracije IL-10 bile su niže kod pacijentkinja sa BV i BIFIDO formama i
ta razlika je bila statistički značajna za trudnice sa BIFIDO formama i BV u odnosu na
grupu sa normalnim nalazom (p<0,005), što nije nađeno kod trudnica sa BV i BIFIDO
formama (p>0,005).
Podatak da smo kod 86% pacijentkinja kod kojih smo detektovali BIFIDO forme mikroskopski
postavili dijagnozu normalan nalaz i da kod pacijentkinja sa BVF nismo detektovali ove forme
smatramo veoma zanimljivim. I studije koje su koristili kulturu i novije molekularnobiološke
studije pokazale su da različiti sojevi Bifidobacteria mogu da se nađu u vagini, ali njihova uloga
i značaj ni do danas nije precizno definisana [411, 457, 626-630]. Tako su Rosenstein i
sar.[631] su još 1996. god. našli (kultura) da je Bifidobacterium spp. prisutan kod oko 12%
zdravih žena, kod 41% pacijentkinja označenih u studiji kao revertant i pacijentkinje koje su na
prvom pregledu imale BV ili intermedijarnu floru, a kod kojih je posle 3-4 nedelje došlo do
spontane rezolucije poremećaja vaginalne flore i nalaz je definisan kao normalan), kod 58%
pacijentkinja sa intermedijarnim nalazom i 94% pacijentkinja sa BV. Ovaj linearan porast
koagulaza negativnog stafilokoka i bifidobakterija sa pomeranjem nalaza od normalnog ka BV
naveo je autore da postave hipotezu po kojoj bi ove bakterije doveli do početnih promena u
vaginalnoj flori, koji bi onda stvori uslove za rast i razvoj drugih anaerobnih mikroorganizama
(BVAB), odnosno nastanak BV. Rezultati molekularnobioloških studija koji se odnose na
detekciju bifidobakterija u vaginalnom mikrobiomu uglavnom zavise od molekularnih oruđa
korištenim u tim studijama. Tako su molekularno biološke studije u kojima se detekcija
292
mikroorganizama zasnivam na detekciji 16S rRNK gena detektovale Bifidobacterium spp. u
vaginalnom mikrobiomu[632-635]. Burton i sar. [526] zaključuju da su nađeni sojevi
bifidobakterija uglavnom fekalnog porekla i da se veoma retko nalaze u vagini. Hyman i sar.
[635] su kod dve od 20 (10 %) žena našli bifidobakterije kao predominantnu bakterijsku vrstu,
a često se Bifidobacteria i ne prikazuju kao članovi vaginalnog mikrobima [180, 441, 632].
Chaban i sar. [636] smatraju da jedan od razloga najverovatnije leži u činjenici da su studije
koje su ispitivale prisustvo Bifidobacteria u intestinalnom traktu kulturom detektovali značajno
veći brij sojeva bifidobakterija nego što je to postignuto korišćenjem 16S rRNK gena kojim se
uspelo detektovati svega nekoliko sojeva. Kao drugu otežavajuću okolnost u identifikaciji
Bifidobacteria isti autori ukazuju na činjenicu da su G. vaginalis(kao jedan od najčešće
detektovanih mikroorganizama mikrobima vagine) i Bifidobacteria srodni mikroorganizmi koji
taksonomski pripadaju istoj familiji. Zbog toga su Chaban i sar.[636] u svojoj studiji objavljenoj
jula 2014. god. koristeći drugu metodologiju (cpn60-based universal PCR protocol) došli do
rezultata koji su pokazali da Bifidobacteria verovatno predstavljaju češće i važnije članove
vaginalnog mikrobioma nego što se to do sada predpostavljalo. Tako je u njihovom ispitivanju
korišćenjem ovakve metodologije kod 5 od 27 asimptomatskih žena kao dominante vaginalne
mikroorganizme imalo Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ili Alloscardovia
omnicolens. Kako se Bifidobacteria generalno smatraju korisnim članom intestinalnog
mikrobioma, i kako su detektovani kod asimptomatskih, i kako autori navode zdravih žena, iz
ovoga bi mogli zaključiti da se verovatno radi i o korisnim članovima vaginalnog mikrobioma,
iako autori mudro izbegavaju takav zaključak i ukazuju da uloga ovih mikroorganizama u
vaginalnom mikrobiomu nije razjašnjena. Ipak, oni smatraju mogućim i razumljivim da
Bifidobacteria kao mikroorganizmi koji produkuju mlečnu kiselinu imaju ulogu sličnu
laktobacilima u mikrobiomu vagine, pri čemu ukazuju na značaj koji Bifidobacteria imaju za
novorođenčad i njihovo zdravlje, te da prisustvo Bifidobacteria u vagini zdravih žena
omogućava naseljavanje gastrointestinalnog trakta novorođenčeta tokom vaginalnog porođaja.
Ovde ćemo još pomenuti studiju Swidinskog i sar. [637] kod 10 pacijentkinja sa BV kod kojih
je ispitivano prisustvo G. vaginalis i različitih vrsta Bifidobacterium u perianalnoj regiji i vagini
pokazala je prisustvo G. vaginalis na oba mesta odakle su uzimani uzorci, dok su različite vrste
bifidobakterija (Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacteriumlongum, Bifidobacterium
breves, Bifidobacterium bifidum i Bifidobacterium catenulatum) detektovane kod gotovo svih
(izuzev jedne) pacijentkinja u uzorku iz perianalne regije, ali ni kod jedne pacijentkinje u uzorku
iz vagine. Na osnovu tih nalaza autori zaključuju da BV ne nastaje jednostavnim prelaskom
(per continuitatem) iz perianalne regije u vaginu, i da samo određene vrste bakterija (G.
293
vaginalis) opstaju u obe ekološke niše. Ako sad rezultate ovih studija i trenutna znanja o
Bifidobacteriama u vaginalnom mikrobiomu poredimo međusobno i sa rezultatima koje smo
mi dobili mogli bi doći do sledećih zaključaka, ili bolje rečeno hipoteza:
Prvo, ispitivanje Rosenstein i sar. koje ukazuje da bi bifidobakterije mogle da učestvuju u
etiopatogenzi poremećaja vaginalne flore i nastanka BV ostaje na neki način usamljena. Naime
rezultati našeg ispitivanja su potpuno suprotni rezultatima ovog ispitivanja jer se u našem
ispitivanju detekcija bifidobakterija mikroskopskim pregledom preparata po Gramu smanjuje
od normalnog ka patološkom mikroskopskom nalazu, dok se u ispitivanju Rosenstein i sar.
izolacija bifidobakterija kulturom povećava kod mikroskopskog nalaza koji ide od normalnog
ka patološkom. Štaviše, u našem ispitivanju sa porastom broja BVAB od BVN prema BVF
smanjuje se prisustvo BIFIDO formi, tako da su naši rezultati u potpunosti saglasni sa
rezultatima studije Swidinskog i sar. [637] koji ni kod jedne od 10 pacijentkinja sa BV nisu
detektovali Bifidobacteria. Naša hipoteza je da sa velikim porastom broja BVAB dolazi do
kvantitativnih i kvalitativnih promena vaginalne mikroflore, što onda dovodi do promene
uslova (pH, kiseonik, mlečna kiselina, ishrana, metabolizam i sl.) u vaginalnoj sredini koji
onemogućavaju rast i razvoj Bifidobacteria.
Drugo, većina drugih studija ukazuje da su Bifidobacteria najverovatnije deo normalne
vaginalne flore, jer su u najvećem broju studija detektovani kod zdravih asimptomatskih žena
[180, 469, 632-636]. Da nismo dobili podatak da prisustvo ovih formi predstavlja 10X veći
rizik od PP, verovatno bi i mi zaključili da se BIFIDO forme češće nalaze kod pacijentkinja sa
normalnom bakterijskom florom, da su retke kod pacijentkinja sa BV, i da najverovatnije
predstavljaju deo normalne bakterijske flore. Ovde ćemo ukazati na još jednu po našem
mišljenju veoma bitnu činjenicu, a koja se odnosi na detekciju Bifidobacteria, ili bolje rečeno i
svih drugih bakterija u različitim molekularno-biološkim studijama. Naprimer, čitajući rad Liu
i sar.[638] nailazimo na podatak da su kontrolnoj, zdravoj grupi nađene dve pacijentkinja u
čijem mikrobiomu su kod jedne bile predominantne Bifidobacteria, a kod druge Streptococcus.
Kao potvrdu da se ovakvi nalazi sreću kod zdravih asimptomatskih žena autori navode radove
Gajera [469] i Srinivasan [219]. Dakle i ovaj rad bi govorio u prilog tome da su Bifidobacteria
deo normalne vaginalne flore. Međutim ono što uvek moramo imati na umu jeste činjenica da
se u najvećem broju ovih studija pacijentkinje svrstavaju u zdrave na osnovu Nugentovih i
Amselovih kriterijuma ili se zdravo poistovećuje sa asimptomatskim. Veliki deo prethodne
diskusije govori o nesavršenosti postojećih dijagnostičkih kriterijuma (Nugent, Amsel) u
razlikovanju normalne od patološke vaginalne flore, a poistovećivanje asimptomatskog sa
zdravim u medicini nije moguće. Naime, ako je oko polovine pacijentkinja sa BV
294
asimptomatsko, logično je da i neki drugi poremećaji vaginalne flore mogu takođe imati
asimptomatski tok, a najbolji primer je infekcija HPV koja protiče potpuno asimptomatski, a
može imati teške posledice po zdravlje žene. Kao što smo rekli Nugentovi kriterijumi razlikuju
samo tri bakterijska morfotipa i logično je pretpostaviti da su u najvećem broju dosadašnjih
ispitivanja Bifidobacteria i/ili Corynebacteria kao izrazito Gram pozitivna štapićaste forme bili
protumačeni kao laktobacili. Ukazali smo i na razloge zbog čega u najvećem broju dosadašnjih
molekularnobioloških studija nije detektovano prisustvo Bifidobacteria, i zašto je tek studija
Chaban i sar. [636] ukazala na njihov mogući značaj. Najlakše je shvatiti o čemu govorimo
ukoliko pogledamo naredne Slike 3.65 – 3.76. Tako ako pogledamo Sliku 3.65 jasno je da ove
forme mogu lako da se protumače kao laktobacili jer su izrazito Gram pozitivne i štapićaste
(kako smo ih i mi tumačili u prvim gledanjima pod mikroskopom). Međutim pažljivijom
analizom i finim pomeranjem mikrometra može se uočiti da su krajevi ovih formi batičasti da
se verovatno radi o Bifidobacteriama ili Corynebacterima, a ukoliko ih pogledamo na uvećanju
većem od X1000 onda je to i uverljivije (Slike 3.66-3.68). Zbog toga verujemo da je pomenuta
pacijentkinja iz studije Liu i sar [638]. kod koje je molekularnobiološkim analizama
detektovana predominacija Bifidobacteria, a koja je na osnovu Nugentovih i Amselovih
kriterijuma, koji su korišteni u toj studiji, i odsustva simptoma bila pogrešno svrstana u grupu
zdravih, i da se radi o pacijentkinji koja je imala sličan mikroskopski nalaz kao onaj prikazan
na Slikama 3.65 – 3.76 i koju bi mi u našem ispitivanju svrstali u BIFIDO grupu. U
Metodologiji i prethodnoj diskusiji detaljno smo opisali morfološke karakteristike
Bifidobacteria i Corynebacteria i ukazali koliko ih je teško razlikovati , ne samo međusobno,
nego i od laktobacila. Takođe, ove mikroskopske forme se na uvećanju x400 i prilikom pregleda
NPVS ne mogu razlikovati od laktobacila.
295
Slika 3.65: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Gram pozitivne štapićaste forme koje liče na laktobacile
Slika 3.66: Preparat po Gramu uvećanje X1000+: Gram pozitivne štapićaste forme sa batičastim
krajevima koji verovatno predstavljaju Bifidobacteria ili Corynebacteria, a ne laktobacile čiji su krajevi
ravni
296
Slika 3.67: Preparat po Gramu uvećanje X1000+: Gram pozitivne štapićaste sa batičastim krajevima koje
nisu laktobacili Actinomyces?.....?
Slika 3.68: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Bifidobacteria? Corynebacteria?
297
Ovo potvrđuju rezultati našeg ispitivanja u kojima smo na osnovu modifikovanih Amselovih
kriterijuma 40 od 50 trudnica (koje smo naknadnim pregledom preparata po Gramu svrstali u
BIFIDO grupu) proglasili zdravim, a da smo se pridržavali originalnih kriterijuma po Amselu
(vidi Metodologiju) sigurno bi i veći broj pacijentkinja imao normalan nalaz.
Na osnovu prethodno iznesenih podataka i rezultata našeg ispitivanja pretpostavljamo da se
u ovakvim slučajevima radi o poremećaju vaginalne flore u kome dolazi do predominacije
Bifidobacteria i Corynebacteria koje dovode do pojačanog inflamatornog odgovora i
predstavljaju rizik za PP. Takođe, mogli bi smo reći da su ove bakterije tokom evolucije stekli
sposobnost mimikrije. Ako mimikriju definišemo kao evolucionu sposobnost prilagođavanja
radi preživljavanja, onda je ona u ovom slučaju odlično razvijena. U konkretnom slučaju
govorimo o “mikroekološkoj mimikriji” s obzirom na njihovu sličnost sa laktobacilima i
činjenicu da su prisutni kod pacijentkinja čiji je nalaz bliži normalnom nego patološkom,
negativan test sa 10% KOH (80%) i verovatno odsustvo simptoma. Jedini podatak koji smo
dobili u našem ispitivanju, a koji bi mogao ukazati na poremećaj vaginalne flore, odnosno na
nesavršenost mimikrije su srednje vrednosti pH, 4,6, a ovaj podatak je značajniji ako znamo da
ove bakterije nisu nađene ni kod jedne pacijentkinje sa BVF (najveće vrednosti pH) i kod malog
broja pacijentkinja sa BVM, da su u 80% slučajeva bili u grupi sa normalnim nalazom (najniže
vrednosti pH), što indirektno navodi na zaključak da ove bakterije na neki način “pomeraju”
pH prema alkalnoj sredini. Ako pri tome dodamo da je često uz BIFIDO forme detektovana i
CA kojoj suštinski odgovara kiseli vaginalni pH, onda ovaj podatak ima još veću vrednost. U
literaturi nismo našli podatke koji se odnose na korelaciju ova dva parametra, ali smo našli
podatak da je optimalan pH za rast bifidobakterija između 6,5 i 7,0 i da nije zabeležen rast u
sredinama sa vrednostima pH manjim od 4,5 ili većim od 8,5. Kako u našem ispitivanju nismo
našli BIFIDO forme kod pacijentkinja sa BVF mogli bismo pretpostaviti da su u ovakvim
slučajevima neki drugi faktori (ishrana, kiseonik, druge vrste bakterija i sl.) važniji od pH
sredine za rast BIFIDO formi. Rezultati koji se odnose na vijabilnost PMN ukazuju na prisustvo
zapaljenja, a niske koncentracije IL-10 na mogućnost snažnijeg inflamatornog odgovora, što bi
moglo da bude od velikog značaja u etiopatogenezi PP kod ove grupe trudnica.
BIFIDO forme su bakterije koje se zbog svoje sličnosti sa laktobacilima najčešće previde
mikroskopskim pregledom i najveći broj pacijentkinja zbog toga ne dobija nikakvu terapiju i
biva proglašen zdravim. Iako su vrednosti pH često preko 4,5, najčešće negativna proba sa 10%
KOH, uz “normalnu” mikroskopsku sliku ne omogućava da ni na osnovu Amselovih
kriterijuma posumnjamo da je došlo do značajnijeg (BV) poremećaja vaginalne flore.
Verovatno da ove bakterije na neki način dovode do smanjene produkcije IL-10 što dovodi do
298
pojačanog i produženog zapaljenjskog odgovora koji može da dovede do povećanog lučenja
proinflamatornih citokina, sinteze prostaglandina, promena na grliću, aktivacije fetalnih
membrana i miometrijuma i sledstvenog PP. Do odgovora na pitanje o eventualnoj terapiji
sigurno nećemo doći ni brzo ni lako, zbog čega mislimo da u ovakvim slučajevima (povišen
pH i normalan mikroskopski nalaz) acidifikacija vagine i primena prebiotika imaju svoje mesto.
U literaturi smo našli samo jednu studiju koja je pokazala da pacijentkinje sa nalazom ovakvih
mikroskopskih formi (“sličnih normalnom”) imaju povećan rizik od PP. Radi se o već
pominjanoj prospektivnoj kohortnoj studiji Verstraelen i sar. [415] u kojoj su autori procenjivali
vrednost nove klasifikacije u predviđanju PP. Kod 221trudnice uziman je uzorak za preparat po
Gramu u prvom i drugom trimestru trudnoće, a kategorizacija pacijentkinja rađena na osnovu
kriterijuma po Claeysu(vidi Metodologiju). Semikvantitativno je određivan i broj PMN. U
konačnoj analizi normalan nalaz preparat po Gramu imale su pacijentkinje sa nalazom Ia, Ib i
Iab, dok se patološkim nalazom smatrane pacijentkinje iz grupe I-like (u našem ispitivanju
BIFIDO grupa), I-PMN (u našem radu leukoreja), i grupe II i III koje odgovaraju
intermedijarnom nalazu i BV po Ison/Hayu, a koje su autori u ovom radu posmatrali kao jednu
grupu i nazvali je BV-like. Rezultati su bili sledeći: oko 64% (154/221) žena imalo je normalnu
vaginalnu floru, oko 20% (46/221) BV-like (intermedijaran+BV) oko 7% (17/221) I-PMN
(leukoreja) i oko 9% (21/221) I-like (BIFIDO). Pre 37. n.g. porodile su se 23 (10,4%)
pacijentkinje. Pacijentkinje sa normalnom florom imale su 4x manji rizik od PP, dok su
pacijentkinje sa patološkim nalazom imale 5x veći rizik da se porode pre vremena. Među njima,
relativni rizik za PP bio je najveći kod trudnica u grupu I-like (RR=7,0), sledile su trudnice iz
grupe I-PMN (RR=6,8), a najmanji relativni rizik je bio kod pacijentkinja u grupi BV-like
(RR=2,7). U odnosu na konvencionalne metode (Nugent i Amsel), senzitivnost vaginalnog
brisa za PP porasla je sa 25% na 70%. Dakle, za razliku od studije Verstraelen i sar.[415]mi u
našem ispitivanju nismo našli da su pacijentkinje sa povećanim brojem PMN,
„konvencionalnim“ poremećajem vaginalne flore (BV, intermedijaran) ili poremećajima
vaginalne flore na osnovu nove podele (BVF,BVM, BVN) i/ili prisustvom ometajućih faktora
(CA, KOKE, LEPTO) imaju povećan rizik za PP. U našem ispitivanju samo su pacijentkinje iz
BIFIDO grupe imale 10X veći rizik od PP.
Na osnovu iznesenih podataka jasno je da su neophodna dalja ispitivanja i bliža saradnja
kliničara, mikrobiologa i molekularnog biologa kako bi se preciznije definisala uloga i značaj
ovih bakterija (Bifidobacteria, Corynebacteria) u reproduktivnom zdravlju žene. Iako se u
našem ispitivanju radi o pacijentkinjama koje su dolazile na unapred zakazivan pregled zbog
čega ih smatramo uslovno asimptomatskom populacijom, u ovom trenutku nemamo preciznijih
299
podataka o simptomima i kliničkoj slici ove grupe pacijentkinja, tako da bi buduća studija
podrazumevala detaljnu anamnezu, klinički pregled i test sa 10% KOH i određivanje
vaginalnog pH. Mikroskopski pregled NPVS verovatno ne bi bio od većeg značaja, iako posle
ovih naših saznanja i iskustava, mislimo da se i na NPVS može naslutiti postojanje “neobičnih”
štapićastih formi, koje bi mogle ukazivati na prisustvo ovih bakterijskih morfotipova.
Mikroskopski pregled preparata po Gramu podrazumevao bi detaljniju analizu svih Gram
pozitivnih štapićastih formi koji liče na laktobacile, pri čemu je naravno jasno da sam
mikroskopski pregled nije dovoljan da za određenu “mikroskopsku formu” tvrdimo da je
određena bakterija. Molekularnobiološka metodologija podrazumevala bi primenu oruđa koja
mogu ne samo kvalitativno identifikovati prisustvo Bifidobacteria, odnosno njihovih različitih
sojeva, nego i njihovu kvantifikaciju (Q-PCR). Ako sad pogledamo nalaz pacijentkinje
prikazan na prethodne 4 slike ali na uvećanju x200 još je jasnije da se radi o predominaciji
Gram pozitivnih štapićastih formi koji nisu laktobacila, i da bi verovatno uzimanje uzorka sa
ovakvog preparata po Gramu i analiza adekvatnim molekularnobiološkim oruđima mogla da
nam pomogne u odgovoru na pitanje da li su Gram pozitivne štapićaste forme Bifidobacteria,
Corynebacteria, Actinomyces ili neke druge još nekultivisane bakterije? Mislimo da bi ovakva
metodologija koja podrazumeva blisku saradnju kliničara, mikrobiologa i molekularnog
biologa u budućnosti mogla dati precizniji odgovor o ulozi i značaju ovih bakterija ili
bakterijskih zajednica na reproduktivno zdravlje žena.
300
Slika 3.69 Preparat po Gramu uvećanje X1000: Bifidobacteria? Corynebacteria? Actinomyces?.....?
Slika 3.70 Preparat po Gramu uvećanje X1000: Bifidobacteria? Corynebacteria? Actinomyces?.....?
301
Slika 3.72: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Lactobacillus? Bifidobacteria? Corynebacteria?
Actinomyces?.....?
Slika 3.71: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Corynebacteria? Lactobacillus? Bifidobacteria?
Actinomyces?.....?
302
Slika 3.74: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Bifidobacteria? Corynebacteria? Lactobacillus?
Actinomyces?.....?
Slika 3.73: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Corynebacteria? Lactobacillus? Bifidobacteria? BVAB1?
Actinomyces?.....?
303
Slika 3.76: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Lactobacillus? Bifidobacteria?Corynebacteria? BVAB1?
Actinomyces?.....?
Slika 3.75: Preparat po Gramu uvećanje X1000: Lactobacillus? Bifidobacteria? Corynebacteria? BVAB1?
Actinomyces?.....?
304
U Tabeli 3.24 se nalaze podaci koji pokazuju rezultate mikroskopskog pregleda brisa
vaginalnog sekreta kod 21 trudnice koja se porodila pre 37. n.g. I ovu tabelu treba posmatrati
kao “sliku” koja pokazuje koliko se mikroskopski nalazi mogu razlikovati u zavisnosti od
dijagnostičkih kriterijuma, kao i u odnosu na prisustvo različitih ometajućih faktora kao što su
CA, BIFIDO, LEPTO, KOKE I PMN ili razlika u vrednostima vaginalnog pH, odnosno
pozitivnog ili negativnog KOH testa.
Tabela 3.24:Rezultati mikroskopskog pregleda brisa vaginalnog sekreta kod 21 trudnice koja se porodila
pre 37. n.g.
AMSEL
KOH
pH
NP6G
NP2G/CA
NP2G/BIF
NP6G/LEPTO
NP6G/KOKE
PMN
X200
LEUKO
BV
POZ
5,5
NOR
NOR
POZ
4,4
BVN
CAF
BIFIDO
NM
NOR
BIFIDO
BVN
BVN
PMN3
NM
KOKE
NOR
NOR
NOR
NEG
4,0
NF
NOR
PMN1
NOR
NF
NF
NOR
NOR
LEUK
NOR
NEG
4,7
NF
PMN1
CAN
BIFIDO
NF
KOKE
PMN3
5
NOR
NOR
NOR
BV
NEG
5,3
NN
CAF
BIFIDO
NN
NN
PMN3
6
NOR
NOR
7
NOR
NOR
NOR
NOR
NEG
LEUK
NOR
NEG
4,0
NF
NOR
NOR
NF
NF
PMN1
4,4
NF
CAN
BIFIDO
NF
KOKE
8
BV
BV
BV
BV
PMN2
POZ
5,3
BVF
BV
BV
BVF
KOKE
9
INT
INT
INT
PMN3
BV
POZ
5,5
NN
CAN
NOR
LEPTO
KOKE
PMN2
10
11
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
NEG
4,0
NF
NOR
NOR
NF
NF
PMN1
NOR
NOR
NEG
4,0
NF
NOR
NOR
NF
NF
12
NOR
PMN0
NOR
LEUKO
NOR
NEG
4,4
NF
CAF
BIFIDO
LEPTO
NF
13
PMN2
NOR
NOR
NOR
NOR
NEG
4,0
NM
NOR
NOR
NM
NM
14
PMN0
NOR
NOR
I-LIKE
NOR
NEG
4,0
NF
NOR
NOR
NF
KOKE
PMN3
Nugent
Ison
Claeys
1
INT
KOKE
2
NOR
NOR
3
NOR
4
15
BV
BV
BV
BV
POZ
5,0
BVF
BV
BV
BVF
KOKE
PMN0
16
INT
INT
INT
NOR
POZ
4,0
BVN
BV
BV
BVN
BVN
PMN1
17
NOR
NOR
NOR
BV
POZ
4,7
BVN
CAM
BV
LEPTO
BVN
PMN1
18
INT
ČIST
INT
NOR
NOR
5,0
NN
CAN
NOR
NN
KOKE
PMN1
NOR
NOR
6,0
BVN
CAN
BIFIDO
BVN
KOKE
PMN2
NEG
4,0
NF
NOR
NOR
NF
NF
PMN1
CAF
BV
BVF
KOKE
PMN3
19
INT
INT
LEUKO
20
NOR
NOR
NOR
21
BV
BV
BV
BV
POZ
6,0 BVF
LEUKO=leukoreja; CAF=CA-FULL; CAM=CA-MID;CAN=CA-NULL;
Iz tabele se vidi ono na šta ukazujemo u najvećem delu naše diskusije, a to je kompleksnost i
različitost vaginalne flore, odnosno neophodnost da u budućim ispitivanjima veća pažnja bude
usmerena na stanja vaginalne flore koje nisu samo BV, CA i TV kao najčešće vaginalne
infekcije, nego su neke druge bakterijske (Bifidobacteria, Corynebacteria, Coccae,
Leptotrichia) i nebakterijske forme (PMN) koje kao članovi (jedinice) mikrobne mreže mogu
značajno da utiču na članove (jedinice) druge dve biološke mreže citokinske i apoptotske, i vice
versa. Iako je statistička obrada podataka pokazala da pacijentkinje kod kojih smo detektovali
BIFIDO forme imale oko 10 puta veći rizik od PP, gledajući u ovu tabelu i uočavajući koliko
se ovih sedam pacijentkinja razlikuje međusobno po drugim parametrima, ne možemo da se ne
305
zapitamo da li se radi o pojedinačnim uzročnicima (Corynebacteria ili Bifidobacteria) ili o
bakterijskoj zajednici koja u krajnjoj meri dovodi do neželjenog ishoda trudnoće.
3.9
CERVIKOMETRIJA I PREVREMENI POROĐAJ
Dosadašnja istraživanja su pokazala da je dužina grlića ima normalnu distribuciju i da se
značajnije ne menja do trećeg trimestra trudnoće, odnosno da promene u dužini grlića nisu od
kliničkog značaja i da su manje od 0,5 mm nedeljno [639-643]. Takođe je potvrđeno da je
merenje dužine grlića merena transvaginalnom sonografijom (TVS) upotrebljiv u predviđanju
PP, i da je skraćen grlić povezana sa povećanim rizikom za PP [644-647]. Ipak, možemo reći
da ni danas ne postoji konsenzus ni precizna definicija „kratkog grlića“ u trudnoći, što bi bilo
od velikog značaja s obzirom da novija istraživanja pokazuju da bi medicinska intervencija u
takvim slučajevima mogla da smanji učestalost PP [648-650]. Tako je pokazano da terapija
progesteronom [651-653] aplikacija serklaža [654, 655] primena antibiotika [656] ili
indometacina [657] može smanjiti broj PP. I za kratak grlić, kao i za PP, mogli bi smo reći da
predstavlja sindrom koji može biti prouzrokovan različitim etiološkim faktorima, sličnim onim
o kojima smo govorili i kod PP. Uprkos velikom broju istraživanja i danas postoje različita
mišljenja o tome kada treba da počnemo sa merenjem dužine grlića materice, koliko često i u
kojim vremenskim razmacima trba to da radimo i da li cervikometrija treba da bude obavezna
kod svih trudnica (metoda). Cervikometrija se u našem Centru radi unazad desetak godina kao
sastavni deo skoro svakog ultrazvučnog pregleda u trudnoći, a obavezan je u periodu od 22.32. n.g. S obzirom da su mnogo veće studije koje su bile primarno dizajnirane već potvrdile da
merenje dužine grlića materice , uz FFN, predstavlja najvredniji marker u predviđanju PP, naš
primarni cilj nije bio da ispitamo njenu vrednost u predikciji PP, kao ni vrednost i efikasnost
različitih terapijskih pristupa kod pacijentkinja sa kraćim grlićem. Naš primarni cilj bio je da
ispitamo da li je i u kakvoj je vezi dužina grlića materice sa stanjem vaginalne flore, brojem,
vijabilnošću i apoptozom vaginalnih PMN i koncentracijama ispitivanih citokina.
Od 618 trudnica za koje nam je bio poznat termin porođaja 597 (96,6%) se porodilo u
terminu, dok se 3,4% (n=21) porodilo pre 37 n.g. Od 21 trudnice koja su se porodile pre termina
njih 13 (61,9%) porodilo se posle 34 n.g., 6 (28,5%) se porodilo između 31 i 34 n.g, a po jedna
je u grupi ranih i izuzetno ranih PP (Tabela 3.25). Takođe treba uočiti da je 11 pacijentkinja
poređeno posle 35 n.g. i da značajan broj studija koje se odnose na PP kao granicu uzima 35
n.g., jer je posle ovog perioda perinatalni morbiditet i mortalitet značajno manji
.
306
Tabela 3.25: Raspodela trudnica u odnosu na period trudnoće u kome je došlo do PP
R.B.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Umereno
Rani PP
Izuzetno rani PP
Rani PP
pre 27. n.g
28-30,6. n.g
(31-33,6. n.g)
26,0 n.g.
PT 29,3
PT 32,4
PT 32,5
PT 32,6
PT 33,2
PT 33,2
PT 34,1
Kasni PP
(34-36,6 n.g.)
PT 34,0
PT 34,2
PT 35,0
PT 35,2
PT 35,3
PT 35,3
PT 35,4
PT 36,0
PT 36,1
PT 36,1
PT 36,2
PT 36,2
PT 36,2
Srednja dužina grlića materice kod 597 pacijentkinja koje su imale terminski porođaj
iznosila je 40,8 ±6,5 mm, a kod pacijentkinja sa PP 30,8 ±9,0. T-test je pokazao da je ova razlika
statistički visoko značajna (p<0,001). Od ukupno 618 pacijentkinja uključenih u naše
ispitivanje kod 568 (91,9%) dužina grlića je bila preko 30 mm, dok je 8,1% (n=50) imalo dužinu
manju od 30 mm. Od 597 trudnica sa terminskim porođajem kod 556 (93,1%,) dužina grlića je
bila preko 30 mm, dok je 41 (6,9%) imala dužinu grlića manju od 30 mm. U grupi sa PP 57,1%
(n=12) izmerena je dužina preko 30 mm, dok je 42,9% (n=9). Nikolaides i sar. [658] našli su
da je srednja dužina grlića materice u drugom trimestru trudnoće je između 35 i 38 mm, a dužina
grlića od 25 mm odgovara 10 percentili. U našem ispitivanju mediana je 39 mm, a 5. percentila
28 mm. Najveći broj dosadašnjih studija koje se odnose na pacijentkinja sa malim rizikom za
PP ukazuje da je dužina grlića manja od 25 mm u periodu između 18 i 24 nedelje gestacije
udružena sa PP pre 35 nedelje (oko 5%), u odnosu na opštu populaciju gde je taj procenat oko
2,4%. većina studija takođe je pokazala da je cervikometrija bolji prediktor ranih PP (<32 n.g.),
a kao što smo rekli u našem ispitivanju preko 60% pacijentkinja se porodilo posle 35 n.g.
Primenom Hi kvadrat testa (χ2) pokazana je da postoji povezanost između dužine grlića
materice i termina porođaja (χ2=35.336; df=1; p<0,001; Tabela 3.26). Takva značajnost nađena
je i kada su pacijentkinje podeljene u dve grupe a kao granična vrednost uzeta dužina grlića od
25 mm (χ2=27.591; df=1; p<0,001; Tabela 3.27). Istim statističkim postupkom za graničnu
vrednost od 36 mm pokazano je postojanje asocijacije između dužine grlića i termina porođaja
(χ2=23.49; p<0,001; Tabela 3.28).
307
Tabela 3.26: Prikaz dobijenih rezultata za dužinu grlića materice 30mm i termina porođaja
TERMIN
TERMINSKI
PRETERMINSKI
∑
n
%
n
%
n
%
DUŽINA GRLIĆA
≥30 mm
<30 mm
556
41
93,1
6,9
12
9
57,1
42,9
568
50
91,9
8,1
2
χ =35.34; df=1; p<0,001
∑
597
100,0
21
100,0
618
100,0
Tabela 3.27: Prikaz dobijenih rezultata za dužinu grlića materice 25 mm i termina porođaja
TERMIN
TERMINSKI
PRETERMINSKI
∑
n
%
n
%
n
%
DUŽINA GRLIĆA 25 mm
≥25 mm
<25 mm
581
16
97,3
2,7
16
5
76,2
23,8
597
21
96,6
3,4
2
χ =27.59; df=1; p<0,001
∑
597
100,0
21
100,0
618
100,0
Tabela 3.28: Prikaz dobijenih rezultata za dužinu grlića materice 36 mm i termina porođaja
DUŽINA GRLIĆA
TERMIN
TERMINSKI
PRETERMINSKI
∑
n
%
n
%
n
%
≥36 mm
452
75,7
6
28,6
458
74,1
2
χ =23.49; df=1; p<0,001
<36 mm
145
24,3
15
71,4
160
25,9
∑
597
100,0
21
100,0
618
100,0
Od 597 trudnica sa terminskim porođajem kod 581 (97,3%,) dužina grlića je bila preko 25 mm,
a manje od 25 mm izmereno je kod 16 (2,7%) trudnica. Ali pri ovoj graničnoj vrednosti 76,2%
(n=16) trudnica sa PP imalo je grlić preko 25 mm, a kraći od te vrednosti 23,8% (n=5). Dakle
od 618 pacijentkinja kod 597 (96,6%) grlić je bio duži od 25 mm, a grlić kraći od 25 mm
izmeren je kod 3,4 % (n=21) pacijentkinja.
Primenom t–testa, (Leveneov test) utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika
između dužine grlića materice u odnosu na broj PMN određen pregledom preparata po Gramu
308
na uvećanju x200 (p<0,05), dok takva značajnost nije nađena za druge dve semikvantitativne
metode na uvećanjima x400 i x1000. Nijedna od dve kvantitativne metode određivanja broja
PMN nije pokazala povezanost između broja PMN i dužine grlića materice. Ovi podaci su od
značaja ukoliko ih sagledamo u svetlu činjenice da dužina grlića materice merena
transvaginalnom sonografijom, uz fetalni fibronektin, danas predstavlja najvredniji prediktor
PP. Tako bi povećan broj PMN na mikroskopskom uvećanju x200 mogao biti indikacija za
ultrazvučni pregled vaginalnom sondom, odnosno cervikometriju. Broj i vijabilnost vaginalnih
PMN nisu pokazali statistički značajnu povezanost sa dužinom grlića materice.
Ako sad detaljnije analiziramo podatke kod 21 pacijentkinja sa grlićem ≤ 25 mm doći
ćemo do nekih zaključaka koji izmiču statistici a koji su po našem mišljenju za razumevanje
dobijenih rezultata. Tako, ako znamo da se 16 pacijentkinja sa grlićem ≤ 25 porodilo u terminu,
mogli bi smo doći do zaključka da se u našem ispitivanju većina trudnica sa grlićem ≤ 25
porodila u terminu (16/21). Međutim ukoliko znamo da su sve ove trudnice dobijale terapiju
progesteronom a da je kod pet trudnica stavljen serklaž onda je jasno da ne možemo znati koliko
bi se ovih trudnica porodilo pre vremena a koliko u terminu da nisu lečene. U Tabelama 3.29 i
3.30 su prikazane dužine grlića za svaku od ovih pacijentkinja kao i ishod trudnoće. Ono što
smatramo veoma važnim i želimo istaći jeste činjenica da su sve ove pacijentkinje došle na
pregled i da nisu imale nikakve simptome. Dakle ni jedna od 5 pacijentkinja sa grlićem ≤ 15
mm nije navodila nikakve tegobe. Mada smo u tim slučajevima insistirali na preciznim
anamnestičkim podacima unazad nekoliko dana ili nedelja većina pacijentkinja je negirale bilo
kakve tegobe koje bi ukazivale na mogući PP. Svakako su najupečatljivije dve trudnice kod
kojih je grlić bio 10 ili 14 mm, i kod kojih su kliničkim pregledom viđeni plodovi ovojci, a koje
pri tome nisu imale nikakve simptome, ni tog ni prethodnih dana. Kao što se vidi u tabeli grlić
≤15 mm imalo je 5 pacijentkinja od kojih su se 3 porodile pre termina uprkos aplikaciji cerklaža
i medikamentnoj terapiji, dok su se primenom istih procedura 2 trudnice porodile u terminu.
Iako neki autori u literaturi navode kao graničnu vrednost od 15 mm za rizik od PP, naši rezultati
ukazuju da je u takvim slučajevima verovatnoća da će se trudnica poroditi pre termina veća,
bez obzira na primenjenu terapiju Ako sad analiziramo grupu pacijentkinja sa grlićem >15 mm
a ≤25 mm vidimo da tu imamo 14 pacijentkinja koje su se porodile u terminu, dok su se 2
pacijentkinje porodile pre termina. Kao što smo rekli najveći broj autora danas uzima kao
graničnu vrednost 25 mm i smatra da u takvim slučajevima treba započeti terapiju
progesteronskim preparatima, a po nekima aplikovati serklaž. Sve pacijentkinje sa grlićem
kraćim ≤ 20 mm upućivane su u tercijarnu ginekološku ustanovu radi eventualne aplikacije
309
serklaža, primene tokolitičke i/ili progesteronske terapije, a u zavisnosti od mikroskopskih i
mikrobioloških analiza uključivana je i antibiotska i/ili antimikotična terapija. Nakon otpusta
sve pacijentkinje su nastavljale sa terapijom progesteronom do 34- 35 n.g., i češće su
kontrolisane. Samo dve od 16 pacijentkinja porodile su se pre termina, i obe su imale kasni PP.
Mislimo da ovi rezultati potvrđuju značaj cervikometrije pri svakom ultrazvučnom pregledu
trudnice, bez obzira da li ima ili nema simptome koji ukazuju na PP, i da se takvim pristupom
može izdvojiti rizična grupa, a pravovremenom i adekvatnom terapijom značajno smanjiti
učestalost PP.
Tabela 3.29: Raspodela pacijentkinja na osnovu dužine grlića (10 – 30 mm) u odnosu na termin porođaja
Dužina grlića (mm)
10 11 14 15 17 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
TP
1
0
1
0
1
2
1
1
1
2
6
3
3
5
6
8
PP
0
1
1
1
0
0
0
0
0
2
0
0
0
1
0
3
Tabela 3.30: Raspodela pacijentkinja na osnovu dužine grlića (31 – 45 mm) u odnosu na termin porođaja
Dužina grlića (mm)
36 37 38 39
31
32
33
34
35
TP
8
8
15
16
25
32
18
38
PP
1
0
2
1
0
2
1
1
40
41
42
45
26
37
38
28
30
2
0
1
0
1
Većina istraživača slaže se da je PP malo verovatan ukoliko je dužina grlića ≥ 30 mm [659662]. Sa ovakvim stavom saglasni smo i mi bez obzira što smo analizom ROC krive najbolje
rezultate dobili za graničnu vrednost 36,5 mm. Međutim ono po čemu se naša studija razlikuje
od drugih ovakvo tipa jeste naš stav da u ovom ispitivanju svim pacijentkinjama sa grlićem >25
mm a ≤ 30 mm uvedemo progesteronsku terapiju 200 mg vaginalno u jednoj dozi uveče, kasno
pre spavanja. Dakle ova grupa pacijentkinja nije hospitalizovana, ali je kontrolna cervikometrija
rađena prve dve nedelje na 7 dana, a potom na 2-3 nedelje do termina. Ako sad pogledamo
rezultate prikazane u tabeli videćemo da smo u ovoj grupi imali 29/618 (4,7%) pacijentkinja,
kojima smo možda po trenutnim medicinskim postulatima neopravdano davali terapiju
progesteronom. Međutim ako pogledamo rezultate videćemo da se 25 (86,2%) ovih
pacijentkinja porodilo u terminu, a 4 (13,8%) pre termina. Naravno kako nismo imali kontrolnu
ili placebo grupu ovi rezultati nam ne daju za pravo da donosimo statističke zaključke, ali mi
310
mislimo da je i u ovim slučajevima terapija progesteronom značajno uticala na manji broj PP u
ovoj grupi pacijentkinja.
Od 21 trudnice koja su se porodile pre vremena 5 je imalo grlić kraći od 25 mm, četiri
duži od 25 ali ≤ 30 mm, 6 u grupi >30 mm a ≤36, a preostalih 6 je dužina grlića bila preko 36
mm (Tabele 3.29 i 3.30).
Grafikon 3.46: ROC kriva za dužinu grlića 36 mm
Tabela 3.31: ROC kriva - tabelarni prikaz parametara koji su dali statističku značajnost
Test
Dužina grlića 36
mm
95% granica
Površina
Nivo
Standardna
pouzdanosti
CI
ispod
značajnosti
greška
Minimum
Maksimum
krive
(p)
0,829
0,040
0,000
0,750
0,909
311
DUŽINA GRLIĆA
Sensitivity
Specificity
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
9,0
10,5
12,5
14,5
16,0
18,5
20,5
21,5
22,5
23,5
24,5
25,5
26,5
27,5
28,5
29,5
30,5
31,5
32,5
33,5
34,5
35,5
36,5
37,5
38,5
39,5
40,5
41,5
42,5
43,5
44,5
45,5
46,5
47,5
48,5
49,5
51,0
0,0
Grafikon 3.47: Odnos senzitivnosti i specifičnosti za dužinu grlića
Tabela 3.32: Tabelarni prikaz distribucije specifičnost i senzitivnost u odnosu na dužinu grlića
Dužina grlića
Senzitivnost
Specifičnost
.........
..........
.........
32,5
0,48
0,90
33,5
0,57
0,88
34,5
0,62
0,85
35,5
0,62
0,81
36,5
0,71
0,76
37,5
0,76
0,73
38,5
0,81
0,66
39,5
0,90
0,62
40,5
0,90
0,56
41,5
0,95
0,49
.........
..........
.........
Iz grafikona jasno se vidi da postoji obrnuta korelacija između rizika za PP i dužine
grlića materice, a ovakvi rezultati nađeni su u velikom broju studija [663-669]. Davies i sar.
[670] kod 964 našli su senzitivnost od 57% i specifičnost od 82% za graničnu vrednost od 30
312
mm između 24 i 28 nedelje gestacije. Pozitivna prediktivna vrednost bila je svega 4,5% za PP
<35 n.g. zato što je i u ovoj studiji broja pacijentkinja sa PP bio mali (n=46). Iz Tabele 3.26 se
vidi da je specifičnost 93,1% odnosno da je 6,1% rezultata lažno pozitivno, dakle pacijentkinje
su imale grlić kraći od 30 mm ali su se ipak porodile u terminu. S druge strane senzitivnost
42,9% znači da je 57,1% lažno negativnih jer su imale grlić preko 30 mm a porodile su se pre
termina. Pozitivna prediktivna vrednost (PPV) iznosila je 18% dok je negativna prediktivna
vrednost (NPV) 97,9%. U našem ispitivanju za graničnu vrednost od 25 mm senzitivnost je
iznosila 23,8%, a specifičnost 97,3% (Tabela 3.27). Dakle smanjivanjem dužine grlića materice
smanjuje se senzitivnost i povećava specifičnost cervikometrije, a sa porastom dužine grlića
materice dešava se obrnuto što se najbolje vidi na Grafikonu 3.47.Velika studija Iamsa i sar.
[647] kada je poredila žene koje su imale dužinu grlića iznad 75. percentile sa onima koje su
imale kraći grlić u 24 n.g našla je da pacijentkinje sa grlićem kraćim od 30 mm (25. percentila)
imaju 4x veći relativni rizik (RR), 6X za grlić < 26 mm (10. percentila), 9X za grlić ispod < 22
mm (5. percentila) i 14X veći RR ako je dužina grlića manja od 13 mm (1. percentila).
Tabela 3.33: Percentile za dužinu grlića u odnosu na termin porođaja
∑
Srednja vrednost
Mediana
Standardna devijacija
Minimum
Maksimum
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Percentile
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Terminski
Preterminski
Ukupno
597
40,82
41,00
6,53
10,00
50,00
29,00
33,00
35,00
36,00
37,00
38,00
39,00
40,00
41,00
41,00
42,00
43,00
44,00
45,00
46,00
47,00
48,00
49,00
50,00
50,00
21
30,86
33,00
9,03
11,00
45,00
11,30
14,20
17,70
24,00
26,00
29,20
30,00
30,00
30,90
33,00
33,10
34,40
36,00
36,40
37,50
38,60
39,00
40,60
44,60
45,00
679
40,41
41,00
6,84
10,00
50,00
28,00
32,00
34,00
35,00
36,00
38,00
38,00
39,00
40,00
41,00
42,00
43,00
44,00
45,00
45,00
46,00
48,00
49,00
50,00
50,00
313
Ipak i u ovoj studiji PPV je bila između 6-44% a senzitivnost 47%, dakle veoma slabi u
populaciji pacijentkinja sa malim rizikom za PP. I u našoj studiji su dobijeni slabi rezultati za
PPV i senzitivnost, i ovo je glavni razlog zbog koga neki smatraju da uvođenje skrininga u
populaciji asimptomatskih pacijentkinja, odnosno pacijentkinja sa malim rizikom za PP, nije
opravdano. Percentile dobijene u našem ispitivanju za tri grupe trudnica prikazane su u Tabeli
3.33.Još jednom naglašavamo činjenicu da je naša populacija trudnica asimptomatska, a
dobijeni rezultati potvrđuju vrednost cervikometrije u otkrivanju trudnica sa visokim rizikom
za PP kod kojih se lečenjem značajno može produžiti trajanje trudnoće i smanjiti učestalost PP
Verujemo da ju ovakav pristup u našem ispitivanju u značajnoj meri doprineo da učestalost PP
bude 3,4%, a ne očekivanih 6-9% koliko se kreće u različitim regionima Srbije. Zato se
zalažemo da cervikometrija u periodu od 20-28 nedelje trudnoće bude obavezna, i verujemo da
bi takav klinički protokol doprineo smanjenju broja PP u našoj zemlji.
Nijedan od mikroskopskih nalaza koji se odnose na različite poremećaje vaginalne flore
nije pokazao statističku značajnost u odnosu na dužinu grlića materice, što nije nađeno ni u
većini drugih istraživanja. Tako u svom radu Manusco i sar. [671] su analizirali rezultate kod
949 pacijentkinja, koristeći jednostavni lineranu regresioni model našli su da je Nugentov skor
u obrnutoj korelaciji sa dužinom grlića materice (linearni regresioni koeficijent= -0.33, p =
0.003), a pacijentkinje sa Nugentovim zbirom > 7 ( BV) imali su značajno kraći grlić u odnosu
na one sa nižim Nugentovim zbirom (28.0 mm vs. 29.9 mm, p = 0.04). Ipak, korišćenjem
kovarijanti prilagođenog modela nisu našli statističku značajnost u odnosu na Nugentov zbir (p
= 0.259) dužina grlića materice bila je slična kod pacijentkinja sa BV i onih sa intermedijarnim
i normalnim nalazom (29.8 mm vs. 30.2 mm). Drugim statističkim postupkom (ANOVA,
Tamhane post hoc test) mi u našem ispitivanju nismo našli statistički značajne razlike između
ove tri grupe pacijentkinja na osnovu podele po Nugentu, mada se i u našem ispitivanju
pacijentkinje sa normalnim nalazom imale najveću srednju dužinu grlića 40,7 mm, one sa
intermedijarnim nalazom 40.2 mm, a pacijentkinje sa BV 39.7 mm. Isti statističkim postupkom
nismo našli statistički značajne razlike između dužine grlića materice i podela po Amselu, Ison
Hayu, Claeysu, NP-6G, NP-2G, NP-2G, kao ni na osnovu podela koje su napravljene
izdvajanjem različitih ometajućih faktora CA, KOKE, BIFIDO i LEPTO forme. Ipak nalaz koji
se izdvaja i koji je u ovakvoj statističkoj analizi na granici statističke značajnosti (p=0,054). je
onaj koji se odnosi na dužinu grlića materice kod pacijentkinja sa BIFIDO grupom. Tako su
pacijentkinje iz BIFIDO grupe imale srednju dužinu grlića 37,8 mm, pacijentkinje sa BV 39,9
mm, a pacijentkinje sa normalnim nalazom 40,8 mm. Primenom ANOVA i post hoc Tamhane
314
testa (Tabele 3.34 i 3.35) nije nađena statistička značajnost između pacijentkinja sa normalnim
nalazom i BV (p=0,423) ili pacijentkinja sa BV i BIFIDO grupe (p=0,293), dok je između
pacijentkinja sa normalnim nalazom i BIFIDO grupom bila na granici statističke značajnosti
(p=0,054). Ovo smatramo veoma interesantnim nalazima s obzirom da je samo ova grupa
(BIFIDO) pacijentkinja pokazala najveći relativan rizik (RR=9,7) za PP. Zato smatramo da je
ovaj nalaz još jedna potvrda mogućeg značaja ovih bakterijskih formi u predviđanju rizika za
PP, odnosno da bi u budućnosti kombinacija mikroskopskog nalaza i merenja dužine grlića
mogla dati bolje rezultate u predikciji PP. Dakle za razliku od zaključka autora koji ukazuju da
BV nije nezavisan prediktor za kraći grlić materice, ukazujući da nedostatak povezanosti na
neki način objašnjava zašto dosadašnja ispitivanja nisu našla povezanost između
asimptomatske BV i PP, odnosno neuspešnog lečenja. Mi bi smo mogli zaključiti da ne samo
BV, nego i drugi poremećaji vaginalne flore prema različitim podelama i grupama pacijentkinja
u našem ispitivanju nisu značajnije povezani sa dužinom grlića materice. Primenom ROC
analize krive takođe nije nađena statistička značajnost (površina ispod krive 0.47) između
dužine grlića materice i normalnog ili patološkog nalaza mikroskopskog nalaza preparat
bojenog po Gramu na osnovu NP-6G. Kao ni autori pomenute studije nismo našli statističku
značajnost između vrednosti pH i dužine grlića materice, a u našem ispitivanju ni rezultati KOH
testa nisu bili povezani sa dužinom grlića materice (t-test).
Tabela 3.34: Dužina grlića u odnosu na NP-2G/BIFIDO (ANOVA)
95% Interval poverenja
Srednja
Standardna
Standardna
vrednost
devijacija
greška
Donja granica
Gornja granica
Dužina NOR 467
40,83
6,49
0,30
40,24
41,42
grlića
n
BV
163
39,95
7,15
0,56
38,85
41,06
BIF
48
37,77
8,46
1,22
35,31
40,23
Total 678
40,40
6,85
0,26
39,89
40,92
.
Tabela 3.35: Dužina grlića u odnosu na NP-2G/BIFIDO (Tamhane post hoc)
Dužina
grlića
NOR
BV
BV
BIF
NOR
BIF
Razlika
srednjih
vrednosti
0,88
3,06
-0,88
2,18
Standardna
greška
p
0,64
1,26
0,63
1,34
0,423
0,054
0,423
0,293
95% Interval poverenja
Donja granica
Gornja granica
-0,65
-0,04
-2,41
-1,11
2,41
6,16
0,65
5,47
315
BIF
NOR
BV
-3,06
-2,18
1,26
1,34
0,054
0,293
-6,16
-5,47
0,04
1,11
Rezultat koji smo već pominjali u diskusiji o PMN smatramo značajnim jer smo različitim
statističkim metodama pokazali povezanost između dužine grlića materice i broja PMN, a
najbolje rezultate dala je semikvantitativna metoda na uvećanju x200. Tako je primenom
ANOVE i post hoc Tamhane testa u podeli PMN na 4 grupe pokazano da postoji statistička
značajnost na mikroskopskim uvećanjima x 200 i 1000 ali ne i na uvećanju x400. Treba se još
jednom se podsetiti koliko se razlikuje broj pacijentkinja sa normalnim i patološkim brojem
PMN u zavisnosti od mikroskopskog uvećanja. Ukratko, na osnovu semikvantitativne procene
broja PMN na uvećanju x200 188 pacijentkinja imalo nalaz PMN0, dok je na osnovu pregleda
na uvećanju x1000 u ovoj grupi bilo 60 pacijentkinja više, dok je u grupi PMN3 bilo 60
pacijentkinja manje. Kao što smo detaljno objasnili tačno 100 pacijentkinja sa patološkim
nalazom PMN na uvećanju x200, imalo je normalan broj PMN na uvećanju x1000. Zato je
statističkom analizom (ANOVA) rezultata dobijenih na uvećanju x200 nađena statistički
značajna razlika u odnosu na dužinu grlića materice između grupe PMN0 i PMN3, dakle one
sa najmanjim i navećim brojem PMN (p=0,006), dok je istim statističkim postupkom takva
razlika nađena između PMN0 i PMN1 (p=0,05), dakle između dve grupe sa normalnim brojem
PMN, a objašnjenje leži u prethodno pomenutim činjenicama i različitoj raspodeli pacijentkinja
na osnovu dva različita mikroskopska uvećanja. Ovi rezultati indirektno potvrđuju veću
vrednost NMMP na uvećanju x 200 u semikvantitativnoj proceni broja PMN na
mikroskopskom preparatu bojenom po Gramu. To istovremeno objašnjava zašto je primenom
t-testa pokazana statistička značajnost između broja PMN i dužine grlića materice (p<0,05) ali
samo na mikroskopskom uvećanu x200, dok takva značajnost nije utvrđena za druge
semikvantitativne i kvantitativne metode u kojima je određivana njihov broj ili vijabilnost.
Srednja dužina grlića materice kod pacijentkinja koje su se porodile posle 37 n.g bila je 40,8
±6,5 mm, a kod pacijentkinja koje su se porodile pre 37 n.g. iznosila je 30,8 ±9,0 mm.
Nije nađena korelacija između dužine grlića materice i koncentracija ni jednog od 13 ispitivanih
citokina.
Dosadašnja ispitivanja su pokazala da bi primena preparata progesterona kod pacijentkinja sa
kraćim grlićem materice mogla da smanji ne samo učestalost PP, nego da smanji perinatalni
morbiditet i mortalitet u takvoj populaciji trudnica. Ipak moramo reći da danas ne postoji
konsenzus o primeni progesterona kada su u pitanju granične vrednosti dužine grlića, vrste
progesteronskih preparata, njihovi oblici ili doze kao ni o trajanju terapije. Iste dileme i veća
316
neslaganja postoje i kada je u pitanju aplikacija serklaža kod ovih pacijentkinja. Izdvojićemo
dve značajnije kliničke studije čiji rezultati ukazuju da cervikometrijom možemo izdvojiti
grupu trudnica sa povećanim rizikom za PP i primenom progesteronskih preparata smanjiti
njegovu učestalost, odnosno produžiti trajanje trudnoće, i tako smanjiti ukupni perinatalni
morbiditet i mortalitet. Prva je studija Fonsece i sar. [651] koja je pokazala da vaginalna
primena progesterona smanjuje rizik od PP za oko 44% kod pacijentkinja sa kraćim grlićem
materice. U ovoj randomizovanoj dvostruko slepoj studiji pacijentkinje sa grlićem ≤15 mm
između 20- 25 n. g. dobijale su 200 mg progesterona vaginalno ili palcebo od 24- 34 nedelje
trudnoće. Učestalost PP pre 34 n.g. bila je značajno niža kod pacijentkinja koje su dobijale
progesteron u odnosu na placebo grupu (19.2% (24/125) i 34.4% (43/125); P = 0.007). Druga
studija koja je pokazala korist od vaginalne primene progesterona je studija De Franco i sar.
[652] koji su ispitivali efekat primene vaginalnog progesterona za dve granične vrednosti
dužine grlića materice ≤30 mm i <28 mm. Kod pacijentkinja koje su dobijale progesteron u
odnosu na pacijentkinje iz placebo grupe, (granična vrednost ≤ 30 mm), primećen je trend
kasnijeg porođaja (p = 0.057). Ipak, nije nađena razlika u učestalosti PP ≤32 n.g. Za drugu
graničnu vrednost <28 mm pacijentkinje koje su dobijale vaginalni progesteron imale su manju
učestalost PP ≤32 n. g., iako ovo nije primećeno za PP pre 35. ili 37. nedelje trudnoće. Tako
su ove dve studije i uticale na našu odluku da u ovom ispitivanju sve pacijentkinje sa dužinom
grlića ≤30 mm dobiju terapiju sa 200 mg progesterona vaginalno jednom dnevno.
Na osnovu rezultata našeg ispitivanja, kao i na osnovu podataka iz literature mogli bi
smo zaključiti da cervikometrija predstavlja relativno jednostavnu i bezbednu proceduru koju
pacijentkinje dobro prihvataju i podnose i da se kao takva može koristiti u predikciji PP. Ipak,
rezultati našeg ispitivanja su pokazali da od 21 pacijentkinje sa PP, 9 je imalo grlić ≤30 mm,
dok je kod 12 pacijentkinja grlić bio > 30 mm. Od ovih 12 pacijentkinja kod 6 je izmeren grlić
≤36 mm, dok je kod preostalih 6 izmerena dužina grlića materice bila veća od 36 mm. Ovi
rezultati jasno ukazuju da se cervikometrijom ipak može izdvojiti samo određen deo populacije
koji ima povećan rizik za PP, i da bi kombinovana primena nekih drugih testova, kao što je
naprimer fetalni fibronektin, mogla značajno da doprinose boljim rezultatima o čemu smo već
diskutovali. Ovo je naravno potpuno razumljivo ukoliko znamo da PP ima multifaktorijalnu
etiologiju, tako da ni u budućnosti primena samo jednog biološkog markera neće dati bolje
rezultate. Ovakav stav je u potpunosti saglasan sa rezultatima velike metaanalitičke studije u
kojoj su Conde-Agudelo i sar. [585] zaključili da nijedan od do sada opisanih biomarkera ne
ispunjava kriterijume za primenu u kliničkoj praksi, kao i da bi primena više markera dala bolje
rezultate. Ovde ćemo samo napomenuti da se merenjem dužine grlića materice kod značajnog
317
broja žena mogu izbeći nepotrebne hospitalizacije ili medicinske intervencije. Značajan broj
žena javlja se ginekologu zbog tegoba koje ukazuju na PP, kao što su neodređeni bolovi u
donjem delu stomaka, bolovi u leđima i slično. Kod značajnog broja pacijentkinja veliki broj
kliničara i bez merenja grlića materice ili samo na osnovu anamnestičkih podataka i kliničkog
pregleda donosi odluku o uvođenju progesterona u terapiju. Takođe, nije mali broj žena koje
zbog tegoba u prvom trimestru trudnoće (bolovi, krvarenja) ovu terapiju dobijaju tokom čitave
trudnoće, jer lekar koji ukine terapiju progesteronom „preuzima odgovornost“ za eventualni
PP, bez obzira što je recimo dužina grlića u tom trenutku bila 45 mm. Iz našeg kliničkog
iskustva mogli bi smo reći da većina lekara smatra terapiju progesteronom potpuno bezbednom
i da se on u velikom broju slučajeva nekritično uvodi u terapiju, a takođe je jasno da i njegova
primena može pomoći samo određenoj subpopulaciji trudnica. Treba se prisetiti da je pre 1020 godina najveći broj trudnica sa ovakvim tegobama dobijao terapiju oralnim tokoliticima, sve
dok prospektivne randomizovane studije nisu pokazale da njihova primena u trudnoći ima veću
štetu nego korist i donesena odluka da se prekine sa njihovom upotrebom. Kakav će biti naš
stav o primeni progesteronskih preparata u trudnoći za 10 godina ne znamo, kao što ni sada ne
možemo biti sigurni da je primena progesterona u trudnoći stvarno toliko bezopasna i za majku
i dete. Takođe ćemo ukazati na podatak na koji nismo naišli u literaturi i o kome se veoma malo
govori, a za koji mislimo da je veoma važan kada govorimo o različitim prediktorima PP, a koji
se odnosi na njegovu prihvatljivost od pacijenta. Na osnovu kliničkog iskustva i razgovora sa
pacijentima, najveći broj pacijentkinja mnogo lakše prihvata pregled vaginalnom sondom nego
pregled pod spekuluma, bimanuelni ginekološki pregled ili uzimanje uzorka krvi što je
neophodno da bi smo dobili uzorak za 99% postojećih prediktora PP. Zbog toga mislimo da u
tom pogledu cervikometrija ima veliku prednost u odnosu na sve druge biomarkere, odnosno
da u tom pogledu ima najveću vrednost kao moguća skrining metoda.
Dakle ukoliko bi smo na kraju sumirali naše rezultate koji se odnose na cervikometriju zaključili
bi smo da pacijentkinje sa dužinom grlića preko 36 mm imaju vrlo mali rizik za PP, one sa
dužinom grlića između 30 i 36 mm su u malom riziku, dok one sa dužinom grlića 30 mm i
manje imaju visok rizik za PP, koji progresivno raste sa skraćivanjem grlića materice. Opet
naglašavamo da nijedna od naših trudnica sa PP (n=21) nije imala nikakve simptome i da su
došle na zakazan pregled radi uzimanja uzoraka, što samo potvrđuje vrednost transvaginalne
sonografije i naš stav da svaki ultrazvučni pregled posle 20 n.g. kao integralni deo mora imati
i merenje grlića materice transvaginalnom sonografijom. Međutim, kao što smo rekli ovakvim
postupkom otkrivamo samo deo trudnica sa visokim rizikom za PP.
318
Zato ćemo ovde ukratko pokušati da ukažemo na faktore koji su u našem ispitivanju
pokazali da bi mogli da se koriste u predikciji PP. U populaciji asimptomatskih trudnica između
24-28 n.g. u grupi sa povećanim rizikom bile bi one kod kojih smo detektovali jedan ili više
sledećih riziko faktora:
1. Detekcija BIFIDO formi mikroskopskim pregledom preparata po Gramu
2. Skraćen grlić materice (≤30 mm) izmeren transvaginalnom sonografijom
3. Povećan broj PMN na mikroskopskom uvećanju x200
4. Smanjen procenat apoptoze
5. vrednosti pH >4,5
6. BV
Pre analize rezultata prikazanih u Tabeli 3.36 ukazaćemo na neke po našem mišljenju važne
činjenice za razumevanje i tumačenja ovih rezultata.
Tabela 3.36: Faktori rizika za PP dobijeni u ovom ispitivanju kod trudnica sa PP
BIFIDO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
BIFIDO
BIFIDO
NOR
BIFIDO
BIFIDO
NOR
BIFIDO
BV
NOR
NOR
NOR
BIFIDO
NOR
NOR
BV
BV
BV
NOR
BIFIDO
NOR
BV
Dužina
grlića
30
36
33
11
24
37
30
31
24
39
39
28
38
14
45
34
15
41
33
36
30
PMN
X200
PMN3
PMN1
PMN1
PMN3
PMN3
PMN1
PMN2
PMN3
PMN2
PMN1
PMN0
PMN2
PMN0
PMN3
PMN0
PMN1
PMN1
PMN1
PMN2
PMN1
PMN3
pH
KOH
AMSEL
NP-6G
5,5
4,4
4,0
4,7
5,3
4,0
4,4
5,3
5,5
4,0
4,0
4,4
4,0
4,0
5,0
4,0
4,7
5,0
6,0
4,0
6,0
POZ
POZ
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POZ
POZ
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POZ
POZ
POZ
NEG
NEG
NEG
POZ
BV
NOR
NOR
NOR
BV
NOR
NOR
BV
BV
NOR
NOR
NOR
NOR
NOR
BV
NOR
BV
NOR
NOR
NOR
BV
BVN
NM
NF
NF
NN
NF
NF
BVF
NN
NF
NF
NF
NM
NF
BVF
BVN
BVN
NN
BVN
NF
BVF
Prvo, treba se prisetiti da je dijagnoza stanja vaginalne flore tokom ispitivanja vršena na
osnovu mikroskopskog pregleda NPVS, određivanje vaginalnog pH, probe sa 10% KOH i
pregleda NPVS sa 10%KOH. Procena stanja vaginalne flore rađena je na osnovu modifikovanih
kriterijuma po Amselu. Na osnovu ovih nalaza pacijentkinje su dobijale odgovarajuću terapiju:
pacijentkinje sa BV i prisutnim clue cells lečene metronidazolom 2x500 mg 7 dana uz
istovremenu lokalnu primenu prebiotika i/ili acidifikant, dok su pacijentkinje bez clue cells i
319
hipocelularnim nalazom bez obzira na pozitivna ili negativna dva testa (pH i KOH) takođe
dobijale prebiotik sa acidifikantom. Pacijentkinje kod kojih su na NPVS sa 10% KOH
detektovane spore ili hife gljivica tretirane su antimikotičkom terapijom. Pacijentkinje sa
povećanim brojem PMN kod kojih nismo detektovali gljivice a kod kojih smo mikroskopski
našli predominaciju SBF ili podjednak broj laktobacila i sitnih bakterijskih formi dobijale su
terapiju Eritromicin 500 mg 4x1 7 dana jer smo smatrali da se kod ovih pacijentkinja radi o
aerobnom vaginitisu (AV). Kao što smo rekli ovaj istraživački projekat nije bio primarno
dizajniran da proceni efikasnost različitih terapijskih pristupa (progesteron, antibiotici,
prebiotici, acidifikanti, antimikotici) zbog šega smo u pogledu lečenja poštovali važeće principe
i protokole dobre kliničke prakse kao i naša klinička iskustva o čemu smo već detaljno
diskutovali. Dakle, iako statističkom analizom rezultata u našem ispitivanju nije nađen povećan
rizik od PP kod pacijentkinja sa BV ili drugim poremećajima vaginalne flore na osnovu NPVS,
kao ni kod pacijentkinja kod kojih su na NPVS detektovane spore i hife kvasnica ili povećan
broj PMN, treba imati u vidu činjenicu da je najveći broj takvih, pacijentkinja lečen jednom ili
više pomenutih terapijskih opcija. Dakle, mi u ovom trenutku ne možemo precizno odgovoriti
na pitanje koliko je terapija bilo progesteronom bilo antibioticima ili drugim oblicima terapije
uticala na dobijene rezultate, povezanost pojedinih parametara sa rizikom za PP, kao ni na
krajnu učestalost PP u ovom ispitivanju. Takođe, ne možemo odgovoriti ni na pitanje u kolikoj
je meri primena progesterona kod svih pacijentkinja sa grlićem ≤30mm ili aplikacija serklaža
uticala na tok i ishod trudnoće. Ipak, činjenica da je učestalost PP u našem ispitivanju bila
dvostruko do trostruko manja od očekivane, mislimo da su pomenuti terapijski protokoli
odlučujuće uticali na nisku učestalost PP u našem ispitivanju.
U prilog ovome govori i činjenica da pacijentkinje iz grupe BIFIDO, koje su na osnovu
statističke analize imale najveći rizik za PP, nisu ni bile prepoznate pregledom NPVS nego su
BIFIDO forme tumačene kao laktobacili a ove pacijentkinje smatrane zdravim, zbog čega u
najvećem broju slučajeva nisu ni dobijale nikakvu terapiju. Da li i kako treba lečiti pacijentkinje
iz grupe BIFIDO ostaje da se utvrdi u budućim istraživanjima. Ukoliko pogledamo Tabelu 3.36
primetićemo da i kada ukrstimo sve ove faktore koji su u našem ispitivanju pokazale da bi u
većoj ili manjoj meri uticati na povećan rizik za PP, ipak nam ostaju tri pacijentkinje (14,3%)
koje su se porodile pre termina, a nisu imali nijedan od faktora rizika prepoznatih u ovom
ispitivanju. Ovi nalazi potvrđuje da PP može biti pokrenut različitim etiološkim faktorima i
ukazuju na potrebu za korišćenjem različitih testova da bi pravovremeno prepoznali trudnice
sa povećanim rizikom za PP i adekvatnim lečenjem smanjili njegovu učestalost koja se u
zadnjih nekoliko decenija nije značajnije menjala.
320
4 ZAKLJUČCI
1. Uporedna statistička analiza rezultata dobijenih na osnovu NP-6G pokazala je dobru
asocijaciju (χ2) i slaganje (κ indeks) u odnosu na postojeće dijagnostičke kriterijume
(Nugent, Amsel , Ison/Hay i Claeys). i tako potvrdila svoju vrednost i upotrebljivost u
kliničkoj praksi. Ipak, ovako dobri rezultati su posledica visoke podudarnosti kod
hipercelularnih i srednje celularnih nalaza (NF, NM, BVF, BVM) 80-95%, dok je ova
podudarnost značajno manja (30%) u grupama sa hipocelularnim nalazom (NN+BVN).
2. Novi metod mikroskopskog pregleda (NMMP) preparata bojenog po Gramu na
uvećanju x200 u odnosu na postojeće metode na mikroskopskim uvećanjima x400
(Amsel) i x1000 (Nugent, Ison/Hay i Claeys) omogućava da se u kraćem vremenu
pregleda značajno veća površina preparata i time preciznije utvrdi kvantitativni i
kvalitativni biodiverzitet vaginalne mikroflore i tako i bolje proceni rizik od PP.
3. Semikvantitativna metoda procene broja vaginalnih PMN na uvećanju x200 u poređenju
sa standardnim metodama na uvećanjima x400 i x1000 pokazala je mnogo bolje
rezultate u odnosu na druge ispitivane parametre: a) broj PMN određivan kvantitativnim
metodama, b) vijabilnost i apoptozu vaginalnih PMN i c) dužinu grlića materice. Time
je potvrđena i naša druga hipoteza da pregled veće površine preparata daje bolju procenu
broja PMN, zbog čega mislimo da bi ova metodologija u budućnosti mogla da postane
»zlatni standard« u proceni broja vaginalnih PMN.
4. Trudnice sa većim brojem PMN imale su manji procenat apoptoze što je u skladu sa
poznatim činjenicama da u uslovima infekcije/zapaljenja dolazi ne samo do povećanja
broja PMN nego i produženja njihovog životnog veka. Najbolji rezultati dobijeni su u
odnosu na procenu broja PMN na uvećanju x200.
5. Pacijentkinje sa BV imale su veći procenat apoptoze vaginalnih PMN dok je kod
pacijentkinje sa BIFIDO formama taj procenat bio značajno niži. Tako bi procenat
apoptoze vaginalnih PMN, ali kod pacijentkinja bez BV, mogao da bude bolji prediktor
stepena inflamacije (ne i infekcije) što bi moglo da bude od značaja u predviđanju PP
za koji smo rekli da je prvenstveno zapaljenjski događaj
6. Pacijentkinje sa BV imale su povećane koncentracije IL-1β i IL-6, a niže koncentracije
IL-12p70. Podjednake koncentracije citokina nađene su kod pacijentkinja sa bitno
različitom celularnošću (npr. BVF i BVN) što ukazuje da broj bakterija nije faktor koji
značajnije utiče na koncentracije citokina u grliću materice
321
7. Nije nađena povezanost između broja, vijabilnosti i procenta apoptoze PMN u odnosu
na koncentracije ispitivanih citokina. Ovo zajedno sa prethodnim zaključkom ukazuje
da su koncentracije nekog citokina krajnji rezultat velikog broja međusobno zavisnih
signala koji potiču od velikog broja jedinica iz najmanje tri biološke mreže mikrobne,
citokinske i apoptotske.
8. Nije nađena povezanost između vijabilnosti i apoptoze vaginalnih PMN sa incidencijom
ili povećanim rizikom za PP. Ipak, pacijentkinje sa najvećim rizikom za PP (BIFIDO
grupa) u našem ispitivanju imale su značajno niži procenat apoptoze, dok takva
povezanost nije nađena u drugim grupama pacijentkinja na osnovu postojećih
dijagnostičkih kriterijuma.
9. Samo je broj PMN određivan semikvantitativno na uvećanju x200 statistički značajno
povezan sa dužinom grlića materice  trudnice sa većim brojem PMN imale su kraći
grlić materice. Povećan broj PMN određen na ovaj način mogao bi da bude indikacija
za cervikometriju.
10. Nije nađena povezanost između koncentracija ispitivanih citokina i dužine grlića
materice.
11. Vrednosti vaginalnog pH>4,5 sa gotovo apsolutnom verovatnoćom (isključujući
infekciju kvasnicama) ukazuju na poremećaj vaginalne flore i u nekim slučajevima ima
veću vrednost od mikroskopskog pregleda kao što je to slučaj kod pacijentkinja sa
hipocelularnim nalazom ili kod nalaza koji liče na normalan (BIFIDO grupa).
12. Kultura vaginalnog i/ili cervikalnog brisa predstavlja skup i neupotrebljiv nalaz u
svakodnevnoj kliničkoj praksi, i da dva jednostavna, brza i jeftina testa (pH i KOH) daju
mnogo bolje rezultate
13. Pacijentkinje sa kraćim grlićem materice izmerenim transvaginalnim ultrazvukom
imaju povećan rizik za PP.
14. Dijagnoza poremećaja vaginalne flore i grupe pacijentkinja formirane na osnovu
kliničkog zlatnog standarda (kriterijumi po Amselu) ili istraživačkog zlatnog standarda
(kriterijumi po Nugentu) nisu pokazala povećan rizik za PP, a takav rizik nije nađen ni
na osnovu podele na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i Claeysu
15. Samo je NMMP detektovala grupu pacijentkinja sa BIFIDO formama koja je imala 9,7
puta veći relativni rizik od PP u odnosu na pacijentkinje sa normalnim nalazom i BV.
U ovoj grupi pacijentkinja nađena je povećan broj vaginalnih PMN. pH>4,5, značajno
manja apoptoza i značajno niže koncentracija IL-10, dok je dužina grlića bila na granici
statističke značajnosti (p=0,054). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na izrazito pojačan
322
zapaljenski odgovor kod ovih trudnica i objašnjavaju najveći rizik od PP, koji je
prvenstveno inflamatorni događaj.
16. NMMP kao jednostavna, jeftina i brza procedura omogućava precizniju procenu broja
vaginalnih PMN i kvantitativnog i kvalitativnog biodiverziteta vaginalnog mikrobioma,
a tako i bolje prepoznavanje pacijentkinja sa rizikom za PP. Zajedno sa još dva skrinig
testa (pH i KOH) i merenjem dužine grlića materice transvaginalnom sonografijom
možemo iz populacije asimptomatskih trudnica izdvojiti najveći broj onih sa povećanim
rizikom za PP. Pravovremeno prepoznavanje i lečenje ovih pacijentkinja moglo bi da
dovede do značajnog smanjenja broja PP kao što je to pokazano u ovom ispitivanju. .
323
LITERATURA
1. Norwitz ER, Robinson JN, Challis JRG. 1999 The control of labor. N Engl J Med. 341:660666. .
2. l Berkowitz GS, Papiernik E. Epidemiology of preterm birth. Epidemiol Rev 1993; 15: 41443.
3. Yang H, Kramer MS, Platt RW et al. How does ultrasound scan estimation of gestational age
lead to higher rates of preterm birth? Am J Obstet Gynecol 2002; 186:433-7. .
4. Shah NR and Bracken MB. A systematic review and meta-analysis of prospective studies on
the association between maternal cigarette smoking and preterm delivery.Am J Obstet
Gynecol 2000;182:465-72.
5. Mercer BM, Goldenberg RL, Moawad AH, et al. The Preterm Prediction Study: Effect of
gestational age and cause of preterm birth on subsequent obstetric outcome. Am J Obstet
Gynecol 1999;181:1216-21.
6. Mercer BM, Goldenberg RL, Meis PJ, et al. The preterm prediction study: Prediction of
preterm premature rupture of membranes through clinical findings and ancillary testing. Am J
Obstet Gynecol 2000;183:738-45.
7. Andolsek KM and Kelton GM. Risk assessment. Prim Car Clin Offi Pract 2000; 27(1):71-103.
8. Weismuller DG: Preterm labor. Am Fam Physician 1999 ; 59:593-602.
9. Meis PJ, Goldenberg RL: The preterm prediction study: Risk factors for indicated preterm
births. Am J Obstet Gynecol 1998; 178:562-567.
10. Iams JD, Goldenberg RL, Mercer BM et al. The Preterm Prediction Study: Can low-risk
womwn destined for sponthaneus preterm birth be identified? Am J Obstet Gynecol
2001;184:652-5.
11. Mercer BM, Goldenberg RL, Das A, Moawad AH, Iams JD, Meis PJ, et al. The preterm
prediction study: a clinical risk assessment system. Am J Obstet Gynecol 1996;174:1885-95.
FUL
12. Goldenberg RL, Rouse DJ. The prevention of premature birth. N Engl J Med 1998;339:313-20
13. Challis JRG, Matthews SG, Gibb W and Lye SJ. Endocrine and paracrine regulation of birth
at term and preterm. Endoc Rew 2000; 21(5): 514-50.
14. Bryce J , Boschi-Pinto C , Shibuya K , Black RE. WHO estimates of the causes of death in
children. Lancet 2005 ; 365: 1147 –52.
15. Richardson DK , Gray JE , Gortmaker SL , et al . Declining severity adjusted mortality:
evidence of improving neonatal intensive care. Pediatrics 1998 ; 102:893 –9.
16. Fanaroff AA , Hack M , Walsh MC. Th e NICHD neonatal research network: changes in
practice and outcomes during the fi rst 15 years. Semin Perinatol 2003 ; 27: 281 –7.
17. Wilson- Costello D , Friedman H , Minich N , Fanaroff AA , Hack M. Improved survival rates
with increased neurodevelopmental disability for extremely low birth weight infants in the
1990s. Pediatrics 2005 ; 115:997 –1003.
18. Botting N , Powls A , Cooke RW , Marlow N. Cognitive and educational outcome of verylow-birthweight children in early adolescence. Dev Med Child Neurol 1998 ; 40: 652 –60.
19. Breslau N , Chilcoat HD . Psychiatric sequelae of low birth weight at 11 years of age. Biol
Psychiatry 2000 ; 47:1005 –11.
20. Nosarti C , Giouroukou E , Healy E , et al . Grey and white matter distribution in very preterm
adolescents mediates neurodevelopmental outcome. Brain 2008 ; 131: 205 –17.
21. Beck, S., Wojdyla, D., Say, L., Betran, A.P., Merialdi, M., et al. (2010). The worldwide
incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bulletin
of the World Health Organization, 88(1), 31-38
324
22. Blencowe, H., Cousens, S., Oestergaard, M., Chou, D., Moller, A.B., et al. (2012). National,
regional and worldwide estimates of preterm birth rates in the year 2010 with time trends for
selected countries since 1990: a systematic analysis. The Lancet, in press.
23. Byrne B,.Morrison JJ. Preterm birth. Clin Evid 2004;1903-22. 15. Martin JA, Hamilton BE,
Sutton PD, Ventura SJ, Menacker F, Munson ML. Births:final data for 2003. Natl Vital Stat
Rep 2005;54:1-116.
24. McPheeters ML, Miller WC, Hartmann KE, Savitz DA, Kaufman JS, Garrett JM et al. The
epidemiology of threatened preterm labor: a prospective cohort study. Am J Obstet Gynecol
2005;192:1325-9
25. Mercer BM, Goldenberg RL, Das A, Moawad AH, Iams JD, Meis PJ, et al. The preterm
prediction study: a clinical risk assessment system. Am J Obstet Gynecol 1996;174: 1885-95.
26. Iams JD, Goldenberg RL, Mercer BM et al. The Preterm Prediction Study: Can low-risk
womwn destined for sponthaneus preterm birth be identified? Am J Obstet Gynecol 2001;184:
652-5.
27. Goldenberg RL, Rouse DJ. The prevention of premature birth. N Engl J Med 1998; 339: 31320
28. Colton T, Kayne HL, Zhang Y, Heeren T. A metaanalysis of home uterine activity monitoring.
Am J Obstet Gynecol 1995; 173: 1499-1505
29. The Collaborative Home Uterine Monitoring Study (CHUMS) Group. A multicenter
randomized controlled trial of home uterine monitoring: active versus sham device. Am J
Obstet Gynecol 1995; 173: 1120-1127 11.
30. Lu GC, Goldenberg RL. Current concepts on the pathogeneses and markers of preterm births.
Clin Perinatol 2000; 27: 263-283
31. Kazemier B, Buijs P, Mignini L, Limpens J, de Groot C, Mol B; EBM CONNECT. Impact of
obstetric history on the risk of spontaneous preterm birth in singleton and multiple
pregnancies: a systematic review. BJOG. 2014 Jun 5. doi:10.1111/1471-0528.12896
32. Chan RL. Biochemical markers of spontaneous preterm birth in asymptomatic women.
Biomed Res Int. 2014;2014:164081.
33. Honest H, Forbes CA, Durée KH, Norman G, Duffy SB, Tsourapas A, Roberts TE, Barton
PM, Jowett SM, Hyde CJ, Khan KS. Screening to prevent spontaneous preterm birth:
systematic reviews of accuracy and effectiveness literature with economic modelling. Health
Technol Assess. 2009 Sep;13(43):1-627. doi: 10.3310/hta13430.
34. Gotsch F, Gotsch F, Romero R, Erez O, Vaisbuch E, Kusanovic JP, Mazaki-Tovi S, Kim SK,
Hassan S, Yeo L. The preterm parturition syndrome and its implications for understanding the
biology, risk assessment, diagnosis, treatment and prevention of preterm birth. J Matern Fetal
Neonatal Med. 2009;22 Suppl 2:5-23.
35. Romero R, Espinoza J, Kusanovic JP, Gotsch F, Hassan S, Erez O, Chaiworapongsa T, Mazor
M. The preterm parturition syndrome. BJOG. 2006 Dec;113 Suppl 3:17-42. Review. Erratum
in: BJOG. 2008 Apr;115(5):674-5.
36. Romero R, Espinoza J, Gonçalves LF, Kusanovic JP, Friel L, Hassan S. The role of
inflammation and infection in preterm birth. Semin Reprod Med. 2007 Jan;25(1):21-39.
Review. PubMed PMID: 17205421 e
37. Romero R, Chaiworapongsa T, Espinoza J. Micronutrients and intrauterine infection, preterm
birth and the fetal inflammatory response syndrome. J Nutr.2003 May;133(5 Suppl 2):1668S1673S.
38. Revie. Menon R, Conneely KN, Smith AK. DNA methylation: an epigenetic risk factor in
preterm birth. Reprod Sci. 2012 Jan;19(1):6-13.
39. Dhobale M, Joshi S. Altered maternal micronutrients (folic acid, vitaminB(12)) and omega 3
fatty acids through oxidative stress may reduce neurotrophic factors in preterm pregnancy. J
Matern Fetal Neonatal Med. 2012 Apr;25(4):317-23.
325
40. Burris HH, Collins JW Jr. Race and preterm birth--the case for epigenetic inquiry. Ethn Dis.
2010 Summer;20(3):296-9.
41. Burdet J, Rubio AP, Salazar AI, Ribeiro ML, Ibarra C, Franchi AM.Inflammation, Infection
and Preterm Birth. Curr Pharm Des. 2014;20(29):4741-8
42. Petit E, Abergel A, Dedet B, Subtil D. [The role of infection in preterm birth]. J Gynecol
Obstet Biol Reprod (Paris). 2012 Feb;41(1):14-25.
43. Keelan JA. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of
preterm birth. J Reprod Immunol. 2011 Mar;88(2):176-84.
44. Vrachnis N, Vitoratos N, Iliodromiti Z, Sifakis S, Deligeoroglou E, Creatsas G. Intrauterine
inflammation and preterm delivery. Ann N Y Acad Sci. 2010 Sep;1205:118-22. doi:
10.1111/j.1749-6632.2010.05684.x. Review.
45. MacIntyre DA, Sykes L, Teoh TG, Bennett PR. Prevention of preterm labour via the
modulation of inflammatory pathways. J Matern Fetal Neonatal Med. 2012 Apr;25 Suppl
1:17-20. doi: 10.3109/14767058.2012.666114. Epub 2012 Mar 13. Review
46. Simpson KL, Keelan JA, Mitchell MD. Labour-associated changes in the regulation
production of immunomodulators in human amnion by glucocorticoids, bacterial
lipopolysaccharide and pro-inflammatory cytokines. J Reprod Fertil 1999; 116:321-7.
47. Kelly RW. Inflamatory mediators and parturition. J Reprod Fertil 1996; 106:89-96
48. Junqueira LC, Zugaib M, Montes GS. Morphologic and histochemical evidence for the
occurrence of collagenolysis and for the role of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes
during cervical ripening. Am J Obstet Gynecol 1980;138:273-81.
49. Liggins GC. Cervical ripening as an inflammatory process. In: Ellwood DA, Anderson AB,
editors. The cervix in pregnancy and labor: clinical and biochemical investigations.
Edinburgh: Churchill Livingstone; 1981. p. 1-9
50. Mackler Mackler A, Iezza G, Akin MR et al. macrophage trafficing in the uterus and cervix
precedes parturation in the mouse. Biol reprod 1999; 61:879-83.
51. Rajabi MR, Dean DD, Beydoun S, Woessner JF Jr. Elevated tissue levels of collagenase
during dilatation of uterine cervices in human parturition. Am J Obstet Gynecol
1988;159:971-6
52. Osmers R, Rath W, Adelmann-Grill BC, Fittkow C, Kuloczik M, Szeverenyi M, et al. Origin
of cervical collagenase during parturition. Am J Obstet Gynecol 1992;166:1455-60.
53. Thomson AJ, Telfer JF, Young J et al. leukocytes infiltrate the myometrium during human
parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod 1999;
14:229-36.
54. Winkler M, Fisscher DC, Ruck P et al. Parturation at term: paralel increases in interleukin-8
and proteinase concentrations and neutrophil count in the lower uterine segment. Hum reprod
1999; 14:1096-100.
55. Romero R, Gomez R, Mazor M, et al: The preterm labor syndrome. In Elder MG, Romero R,
Lamont RF (eds). Preterm Labor. New York: Churchill Livingstone, 1997, pp 29-49
56. Goldenberg RL, Culhane JF, Iams JD, Romero R (2008) Epidemiology and causes of preterm
birth. Lancet 371: 75-84.
57. Romero R, Mazor M (1988) Infection and preterm labor. Clin Obstet Gynecol 31: 553-584M
58. Goldenberg RL, Hauth JC, Andrews WW. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl
J Med 2000;342:1500–1507. [PubMed: 10816189]
59. Yoon BH, Romero R, Kim M, et al. Clinical implications of detection of Ureaplasma
urealyticum in the amniotic cavity with the polymerase chain reaction. Am J Obstet Gynecol
2000;183:1130–1137
60. Berger A, Witt A, Haiden N, et al. Microbial invasion of the amniotic cavity at birth is
associated with adverse short-term outcome of preterm infants. J Perinat Med 2003;31:115–
121
326
61. Rinaldi SF, Catalano RD, Wade J, Rossi AG, Norman JE. Decidual neutrophil infiltration is
not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J
Immunol. 2014 Mar 1;192(5):2315-25.
62. Adams Waldorf KM, Rubens CE, Gravett MG. Use of nonhuman primate models to
investigate mechanisms of infection-associated preterm birth. BJOG. 2011Jan;118(2):136-44.
63. Kullander S: Fever and parturition: An experimental study in rabbits. Acta Obstet Gynecol
Scand Suppl 66:77-85, 1977
64. Hirsch E, Blanchard R, Mehta S. Differential fetal and maternal contributions to the cytokine
milieu in a murine model of infection-induced preterm birth. Am J Obstet Gynecol 1999; 180:
429-34
65. Hirsch E, Ichiko I and Hirsh D. A model of intrauterine infection and preterm delivery in
mice. Am J Obstet Gynecol 1995;172:1598-603
66. Davies JK, Shikes RH, Sze CI et al. Histologic inflammation in the maternal and fetal
compartments in a rabbit model of acute intra-amniotic infection. Am J Obstet Gynecol
2000;183:1088-93.
67. Ernst LM, Gonzalez J, Ofori E, Elovitz M. Inflammation-induced preterm birthin a murine
model is associated with increases in fetal macrophages and circulating erythroid precursors.
Pediatr Dev Pathol. 2010 Jul-Aug;13(4):273-81
68. Munn MB, Groome LJ, Atterbury JL, et al: Pneumonia as a complication of pregnancy. J
Matern Fetal Med 8:151-154, 1999.
69. Jeffcoat MK, Geurs NC, Reddy MS, et al: Current evidence regarding periodontal disease as a
risk factor in preterm birth. Ann Periodontol 6:183-188, 2001.
70. Offenbacher S, Boggess KA, Murtha AP, et al: Progressive periodontal disease and risk of
very preterm delivery. Obstet Gynecol 107:29-36,2006.
71. Xiong X, Buekens P, Fraser WD, et al: Periodontal disease and adverse pregnancy outcomes:
A systematic review. BJOG 113:135-143, 2006.ee
72. Gibbs RS, Romero R, Hillier SL, Eschenbach DA, Sweet RL. A review of premature birth and
subclinical infection. Am J Obstet Gynecol 1992; 166: 1515-28.
73. Horvath B, Lakatos F, Tóth C, Bödecs T, Bódis J. Silent chorioamnionitis and associated
pregnancy outcomes: a review of clinical data gathered over a 16-year period. J Perinat Med.
2014 Jul 1;42(4):441-7.
74. Ustün C, Koçak I, Bariş S, Uzel A, Saltik F. Subclinical chorioamnionitis as an etiologic
factor in preterm deliveries. Int J Gynaecol Obstet. 2001 Feb;72(2):109-15.
75. Elovitz MA, Brown AG, Breen K, Anton L, Maubert M, Burd I. Intrauterine inflammation,
insufficient to induce parturition, still evokes fetal and neonatal brain injury. Int J Dev
Neurosci. 2011 Oct;29(6):663-71
76. Duff P, Kopelman NJ. Subclinical intra-amniotic infection in asyntomatic patients with
refractory preterm labor. Obstet Gynecol 1987; 69: 756-9.
77. Romero R, Sirtori M, Oyarzun E et al. Infection and labor. V. Prevalence, microbiology, and
clinical significance of ntraamniotic infection in women with preterm labor and intact
membranes. Am J Obstet Gynecol 1989; 161: 817-824
78. Hillier SL, Witkin SS, Krohn MA, Watts DH, Kiviat NB, Eschenbach DA. The relationship of
amniotic fluid cytokines and preterm delivery, amniotic fluid infection, histologic
chorioamnionitis, and chorioamnion infection. Am J Obstet Gynecol 1993; 81: 941-8.
79. Cassell GH, Davis RO, Waites KB, et al: Isolation of Mycoplasma hominis and Ureaplasma
urealyticum from amniotic fl uid at 16-20 weeks of gestation: Potential effect on outcome of
pregnancy. Sex Transm Dis 10:294-302, 1983.
80. Gray DJ, Robinson HB, Malone J, et al: Adverse outcome in pregnancy following amniotic fl
uid isolation of Ureaplasma urealyticum. Prenat Diagn 12:111-117, 1992.
81. Horowitz S, Mazor M, Romero R, et al: Infection of the amniotic cavity with Ureaplasma
urealyticum in the midtrimester of pregnancy. J Reprod Med 40:375-379, 1995.
327
82. Silver HM, Sperling RS, St Gibbs RS. Evidence relating bacterial vaginosis to intraamniotic
infection. Am J Obstet Gynecol 1989; 161: 808-12.
83. Romero R, Salafia CM, Athanassiadis AP, Hanoaka S, Mazor M, Sepulved W, et al. The
relationship between acute inflammatory lesions of the preterm placenta and amniotic fluid
microbiology. Am J Obstet Gynecol 1992; 166: 1382-8
84. Martius J, Escheenbach DA. The role of bacterial vaginosis as a cause of amniotic fluid
infectionn, chorioamnionitis and prematurity: a review. Arch Gynecol Obstet 1990; 247: 113.
85. Newton RE, Piper, PeairsW. Bacterial vaginosis and intraamniotic infection. Am J Obstet
Gynecol 1997; 176: 672-7. : 77: 63-68.
86. Gravett MG, Hummel D, Eschenbach DA, Holmes KK. Preterm labor associated with
subclinical amniotic fluid infection and with bacterial vaginosis. Obstet Gynecol 1986; 67:
229–37.
87. Brocklehurst P, Gordon A, Heatley E, Milan SJ. Antibiotics for treating bacterial vaginosis in
pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31;
88. Flenady V, Hawley G, Stock OM, Kenyon S, Badawi N. Prophylactic antibiotics for
inhibiting preterm labour with intact membranes. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Dec
5;12:
89. Romero R, Munoz H, Gomez R, et al: Antibiotic therapy reduces the rate of infection-induced
preterm delivery and perinatal mortality. Am J Obstet Gynecol 170:390, 1994.
90. Fidel P, Ghezzi F, Romero R, et al: The effect of antibiotic therapy on intrauterine infectioninduced preterm parturition in rabbits. J Matern Fetal Neonatal Med 14:57-64, 2003
91. Challis JRG, Lye SJ and Gibb W.Understanding preterm labor.Ann N Y acad Sci 2001;
943:225-34.
92. Peltier MR, Drobek CO, Bhat G, Saade G, Fortunato SJ, Menon R. Amniotic fluid and
maternal race influence responsiveness of fetal membranes to bacteria. J Reprod Immunol.
2012
93. Mirmonsef P, Gilbert D, Zariffard MR, Hamaker BR, Kaur A, Landay AL, Spear GT.The
effects of commensal bacteria on innate immune responses in the female genital tract. Am J
Reprod Immunol. 2011 Mar;65(3):190-5.
94. Abrahams VM, Potter JA, Bhat G, Peltier MR, Saade G, Menon R. Bacterial modulation of
human fetal membrane Toll-like receptor expression. Am J Reprod Immunol. 2013
Jan;69(1):33-40.
95. Witkin SS, Linhares IM, Giraldo P. Bacterial flora of the female genital tract: function and
immune regulation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2007 Jun;21(3):347-54.
96. Fukata M, Vamadevan AS, Abreu MT. Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors
(NLRs) in inflammatory disorders. Semin Immunol. 2009 Aug;21(4):242-53
97. Noguchi T, Sado T, Naruse K, Shigetomi H, Onogi A, Haruta S, Kawaguchi R,Nagai A,
Tanase Y, Yoshida S, Kitanaka T, Oi H, Kobayashi H. Evidence for activation of Toll-like
receptor and receptor for advanced glycation end products in preterm birth. Mediators
Inflamm. 2010;2010:490406.
98. Buhimschi CS, Baumbusch MA, Dulay AT, Oliver EA, Lee S, Zhao G, Bhandari V,
Ehrenkranz RA, Weiner CP, Madri JA, Buhimschi IA. Characterization of RAGE, HMGB1,
and S100beta in inflammation-induced preterm birth and fetal tissue injury. Am J Pathol. 2009
Sep;175(3):958-75.
99. Thaxton JE, Nevers TA, Sharma S. TLR-mediated preterm birth in response to pathogenic
agents. Infect Dis Obstet Gynecol. 2010;2010. pii: 378472
100.
Underhill DM, Ozinsky A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.
Curr Opin Immunol. 2002 Feb;14(1):103-10
328
101.
Arancibia SA, Beltrán CJ, Aguirre IM, Silva P, Peralta AL, Malinarich F, Hermoso
MA. Toll-like receptors are key participants in innate immune responses. Biol Res.
2007;40(2):97-112.
102.
Romero R, Chaiworapongsa T, Alpay Savasan Z, Xu Y, Hussein Y, Dong Z,
Kusanovic JP, Kim CJ, Hassan SS. Damage-associated molecular patterns (DAMPs) in
preterm labor with intact membranes and preterm PROM: a study of the alarmin HMGB1. J
Matern Fetal Neonatal Med. 2011 Dec;24(12):1444-55.
103.
Rubartelli A, Lotze MT, Latz E, Manfredi A. Mechanisms of sterile inflammation.
Front Immunol. 2013 Nov 22;4:398. doi: 10.3389/fimmu.2013.00398.eCollection 2013
104.
McDonald B, Pittman K, Menezes GB, Hirota SA, Slaba I, Waterhouse CC, Beck PL,
Muruve DA, Kubes P. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile
inflammation. Science. 2010 Oct 15;330(6002):362-6
105.
Burdet J, Rubio AP, Salazar AI, Ribeiro ML, Ibarra C, Franchi AM.Inflammation,
Infection and Preterm Birth. Curr Pharm Des. 2014 Jan 30. [Epubahead of print] PubMed
PMID: 24588830.
106.
Jaiswal MK, Agrawal V, Mallers T, Gilman-Sachs A, Hirsch E, Beaman
KD.Regulation of apoptosis and innate immune stimuli in inflammation-induced preterm
labor. J Immunol. 2013 Dec 1;191(11):5702-13. doi: 10.4049/jimmunol.1301604. Epub 2013
Oct 25.:
107.
Agrawal V, Hirsch E. Intrauterine infection and preterm labor. Semin Fetal Neonatal
Med. 2012 Feb;17(1):12-9. doi: 10.1016/j.siny.2011.09.001. Epub 2011 Sep 25.
108.
Romero R, Kusanovic JP, Chaiworapongsa T, Hassan SS. Placental bed disorders in
preterm labor, preterm PROM, spontaneous abortion and abruptio placentae. Best Pract Res
Clin Obstet Gynaecol. 2011 Jun;25(3):313-27.
109.
Lappas M. NOD1 and NOD2 regulate proinflammatory and prolabor mediators in
human fetal membranes and myometrium via nuclear factor-kappa B. Biol Reprod.2013 Jul
18;89(1):14. doi: 10.1095/biolreprod.113.110056
110.
Lindström TM, Bennett PR. The role of nuclear factor kappa B in human labour.
Reproduction. 2005 Nov;130(5):569-81. Review
111.
Cookson VJ, Chapman NR. NF-kappaB function in the human myometrium during
pregnancy and parturition. Histol Histopathol. 2010 Jul;25(7):945-56. Review.
112.
Markovic D, Bari MF, Lu B, Vatish M, Grammatopoulos DK. Corticotropin-releasing
hormone interacts with interleukin-1β to regulate prostaglandin H synthase-2 expression in
human myometrium during pregnancy and labor. J Clin Endocrinol Metab. 2013
Jul;98(7):2864-75. doi: 10.1210/jc.2013-1094. Epub 2013 May 10
113.
Slater DM, Dennes WJ, Campa JS, Poston L, Bennett PR. Expression of cyclooxygenase types-1 and -2 in human myometrium throughout pregnancy. Mol Hum Reprod
1999;5:880–884
114.
Ackerman WE, Summerfield TL, Vandre DD, Robinson JM, Kniss DA: Nuclear
factor-kappa B regulates inducible prostaglandin E synthase expression in human amnion
mesenchymal cells. Biol Reprod 2008, 78:68-76.
115.
Kniss DA, Rovin B, Fertel RH, Zimmerman PD: Blockade NF-kappaB activation
prohibits TNF-alpha-induced cyclooxygenase-2 gene expression in ED27 trophoblast-like
cells. Placenta 2001, 22:80-89.
116.
Callejas NA, Casado M, Bosca L, Martin-Sanz P: Requirement of nuclear factor
kappaB for the constitutive expression of nitric oxide synthase-2 and cyclooxygenase-2 in rat
trophoblasts. J Cell Sci 1999, 112:3147-3155
117.
Helmer H, Tretzmüller U, Brunbauer M, Kaider A, Husslein P, Knöfler M. Production
of oxytocin receptor and cytokines in primary uterine smooth muscle cells cultivated under
inflammatory conditions. J Soc Gynecol Investig 2002;9:15–21. 21.
329
118.
Khanjani S, Kandola MK, Lindstrom TM, Sooranna SR, Melchionda M, Lee YS,
Terzidou V, et al. NF-κβ regulates a cassette of immune/inflammatory genes in human
pregnant myometrium at term. J Cell Mol Med 2011;15:809–824
119.
Choi SJ, Oh Sy, Kim JH, Roh CR. Changes of nuclear factor kappa B (NF-kappaB),
cyclooxygenase-2 (COX-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in human myometrium
before and during term labor. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2007 Jun;132(2):182-8.
120.
Fan MS, Jiang ZY, Zou YF, Qu L, Zhou X, Sun LZ. [Effect of transforming growth
factor β1 on the expression of matrix metalloproteinase 9, tissue inhibitor of metalloproteinase
1 and nuclear factor kappa B signalling pathway in the human amniotic cells WISH].
121.
Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2013 Jan;48(1):29-33 Allport VC, Pieber D, Slater
DM, Newton R, White JO, Bennett PR. Human labour is associated with nuclear factor-κB
activity which mediates cyclo-oxygenase-2 expression and is involved with the ‘functional
progesterone withdrawal’. Mol Hum Reprod 2001;7:581–586.
122.
Lim S, MacIntyre DA, Lee YS, Khanjani S, Terzidou V, Teoh TG, Bennett PR.
Nuclear factor kappa B activation occurs in the amnion prior to labour onset and modulates
the expression of numerous labour associated genes. PLoS One. 2012;7(4):e34707..
123.
Vora S, Abbas A, Kim CJ, Summerfield TL, Kusanovic JP, Iams JD, Romero R,
Kniss DA, Ackerman WE 4th. Nuclear factor-kappa B localization and function within
intrauterine tissues from term and preterm labor and cultured fetal membranes. Reprod Biol
Endocrinol. 2010 Jan 25;8:8.
124.
Tan H, Yi L, Rote NS, Hurd WW, Mesiano S. Progesterone receptor-A and -B have
opposite effects on proinflammatory gene expression in human myometrial cells: implications
for progesterone actions in human pregnancy and parturition. J Clin Endocrinol Metab. 2012
May;97(5):E719-30. doi: 10.1210/jc.2011-3251. Epub 2012 Mar 14.
125.
Vrachnis N, Malamas FM, Sifakis S, Tsikouras P, Iliodromiti Z. Immune aspects and
myometrial actions of progesterone and CRH in labor. Clin Dev Immunol. 2012;2012:937618.
doi: 10.1155/2012/937618. Epub 2011 Oct 19. Review.
126.
Brown AG, Leite RS, Strauss JF 3rd. Mechanisms underlying “functional”
progesterone withdrawal at parturition. Ann. NY Acad. Sci. 1034, 36–49 (2004)
127.
Pieber D, Allport VC, Hills F, Johnson M, Bennett PR. Interactions between
progesterone receptor isoforms in myometrial cells in human labour. Mol Hum Reprod. 2001
Sep;7(9):875-9. PubMed PMID: 11517295.
128.
Goldman S, Weiss A, Almalah I, Shalev E. Progesterone receptor expression in
human decidua and fetal membranes before and after contractions: possible mechanism for
functional progesterone withdrawal. Mol Hum Reprod. 2005 Apr;11(4):269-77. Epub 2005
Mar 11. PubMed PMID: 15764807.
129.
Condon JC, Hardy DB, Kovaric K, Mendelson CR. Up-regulation of the progesterone
receptor (PR)-C isoform in laboring myometrium by activation of nuclear factor-kappaB may
contribute to the onset of labor through inhibition of PR function. Mol Endocrinol. 2006
Apr;20(4):764-75
130.
Hardy DB, Janowski BA, Corey DR, Mendelson , Progesterone receptor plays a major
antiinflammatory role in human myometrial cells by antagonism of nuclear factor-kappaB
activation of cyclooxygenase 2 expression. CR Mol Endocrinol. 2006 Nov; 20(11):2724-33
131.
Raghupathy R. Th1-type immunity is incompatible with successful
pregnancy.Immunol. Today 1997; 18: 478-82
132.
Hansen WR, Kellan JA, Skinner SJM and Mitchell MD. Key enzimes of
prostaglandin biosynthesis and metabolism. Coordinate regulation of expression by cytokines
in gestational tissue: A review. Prostag Lipid Mediat 1999; 57:243-57.
133.
Saito S. Cytokine cross-talk between mother and the embryo/placenta . Jour Reprod
Immun 2001; 52:15-33.Saito S. Cytokine network at the feto-maternal interface. Jour Reprod
Immun 2000; 47:87–103
330
134.
Raghupathy, R., Makhseed, M., Azizieh, Fet al. Maternal Th1- and Th2-type
reactivity to placental antigens in normal human pregnancy and unexplained recurrent
spontaneous abortions. Cell. Immunol.1999; 196:122–130.
135.
Piccinni MP and Romagnani R. Regulation of fetal allograft survival by hormonecontrolled Th1- and Th2-type cytokines. Immunol. Res 1996; 1: 141–150
136.
Brombacher F, Kastelein RA and Alber G. Novel IL-12 family members shed light on
the orchestration of Th1 responses. Trends Immunol 2003; 24 (4):207-212
137.
Trinchieri, G. Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory
functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu. Rev.
Immunol.1995; 13: 251-27
138.
Dyer JFM, You Wu C and Seder RA. The regulation of IL-12: Its role in infectious,
autoimmune, and allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 1998;102:11-5.
139.
Bach EA, Aguet M and Schreiber RD. The IFNgamma receptor: A paradigm for
cytokine receptor signaling. Ann Rev Immunol 1997; 15:563-91.
140.
Munder M, Mallo M, Eichmann K and Modolell M. Murine Macrophages Secrete
Interferon upon Combined Stimulation with Interleukin (IL)-12 and IL-18: A Novel Pathway
of Autocrine Macrophage Activation. J. Exp. Med.1998; 187:2103-2108.
141.
Hasbold, J., J. S. Hong, M. R. Kehry, and P. D. Hodgkin. 1999. Integrating signals
from IFN-gamma and IL-4 by B cells: positive and negative effects on CD40 ligand-induced
proliferation, survival, and division-linked isotype switching to IgG1, IgE, and IgG2a. J.
Immunol. 163:4175-4181
142.
Yoshimoto, T., H. Okamura, Y. Tagawa, Y. Iwakura, and K. Nakanishi. 1997.
Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-γ
production from activated B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 3948-3953.
143.
Munder M, Mallo M, Eichmann K and Modolell M. Murine Macrophages Secrete
Interferon upon Combined Stimulation with Interleukin (IL)-12 and IL-18: A Novel Pathway
of Autocrine Macrophage Activation. J. Exp. Med.1998; 187:2103-2108.
144.
Ohteki T, Fukao T, Suzue K et al.Interleukin 12-dependent Interferon Production by
CD8+ Lymphoid Dendritic Cells. J. Exp. Med 1999; 189:1981-1986
145.
Kniss DA, Iams JD. Regulation of parturation update: Endocrine and paracrine
effectors of term and preterm labor. Clin Perinat 1998; 25(4): 819-836.
146.
Knofler M, Kiss H, Mosl B, et al. Interleukin-1 stimulates TNF-a release from
cytotrophoblastic BeWo cells independetly of induction of the TNF-a m RNA. FEBS 1997;
405: 213-8.
147.
Friebe-Hoffmann U, Chiao JP, Rauk PN. Effect of IL-1beta and IL-6 on oxytocin
secretion in human uterine smooth muscle cells. Am J Reprod Immunol 2001 Sep; 46(3): 22631
148.
Romero R, Mazor M, Brandt F, et al. Interleukin-1alpha and interleukin-1beta in
preterm and term human parturition. Am J Reprod Immunol 1992; 27: 117-23.
149.
Fortunato SJ, Menon RP, Swan KF, Menon R. Inflammatory cytokine (interleukins 1,
6, and 8 and tumor necrosis factor-alpha) release from cultured human fetal membranes in
response to endotoxic lipopolysaccharide mirrors amniotic fluid concentrations. Am J Obstet
Gynecol 1996; 174: 1855-62.
150.
Romero R, Manogue KR, Mitchell MD, Wu YK, Oyarzun E, Hobbins JC, et al.
Infection and labor IV. Cachectin-tumor necrosis factor in the amniotic fluid of women with
intraamniotic infection and preterm labor. Am J Obstet Gynecol 1989; 161: 336-41
151.
Bry K, Hallman M. Synergistic stimulation of amnion cell prostaglandin E2 synthesis
by interleukin-1, tumor necrosis factor and products from activated human granulocytes.
Prostaglandins Leukotrienes & Essential Fatty Acids,1991; 44(4): 241-5.
152.
Gibb W, Sun M. Cellular specificity of interleukin-1 beta stimulated expression of
type-2 PGHS in human amnion cell culture. Biol Reprod 1998; 59: 1139-42.
331
153.
Casey ML, Cox SM, Beutler B, Milewich L, MacDonald PC. Cachetin tumor necrosis
factor-alpha formation in human decidua: potential role of cytokines in infection induced
preterm labor. J Clin Invest 1989; 83: 430-6.
154.
Fortunato S, Menon R, Swan KF, Lombardi SJ. Interleukin-10 and transforming
growth factor-beta inhibit amniochorion tumor necrosis factor-alpha production by contrasting
mechanisms of action: therapeutic implications in prematurity. Am J Obstet Gynecol 1997:
177: 803-7
155.
Romero R, Yoon BH, Mazor M, Gomez R, Diamond MP, Kenney JS, et al. The
diagnostic and prognostic value of amniotic fluid white blood cell count, glucose, interleukin6, and gram stain in patients with preterm labor and intact membranes. Am J Obstet Gynecol
1993; 169: 805-16.
156.
Andrews WW, Hauth JC, Goldenberg RL, Gomez R, Romero R, Cassell GH.
Amniotic fluid interleukin-6: correlation with upper genital tract microbial colonization and
gestational age in women delivered after spontaneous labor versus indicated delivery. Am J
Obstet Gynecol 1995; 173: 606-12.
157.
Hsu CD, Meaddough E, Aversa K, et al.Elevated amniotic fluid levels of leukemia
inhibitory factor, interleukin 6, and interleukin 8 in intra-amniotic infection. Am J Obstet
Gynecol 1998; 179: 1267-70.
158.
Hsu CD, Meaddough E, Hong SF, Aversa K, Lu LC, Copel JA. Elevated amniotic
fluid nitric oxide metabolites and interleukin-6 in intraamniotic infection. J Soc Gynecol
Invest 1998; 5: 21-4.
159.
Hsu CD, Meaddough E, Aversa K, Copel JA. The role of amniotic fluid l-selectin,
GRO-alpha, and interleukin-8 in the pathogenesis of intraamniotic infection. Am J Obstet
Gynecol 1997; 178: 428-32
160.
Winkler M, Fisscher DC, Ruck P et al. Parturation at term: paralel increases in
interleukin-8 and proteinase concentrations and neutrophil count in the lower uterine segment.
Hum reprod 1999; 14:1096-100
161.
Weaver JD, Scott S, Williams OB. The bacterial flora found in nonspecific vaginal
discharge. Am J Obstet Gynecol. 1950 Oct;60(4):880-4.
162.
Gardner HL, Dukes CD. Haemophilus vaginalis vaginitis: a newly defined specific
infection previously classified non-specific vaginitis. Am J Obstet Gynecol. 1955
May;69(5):962-76
163.
Paramel Jayaprakash T, Schellenberg JJ, Hill JE. Resolution and characterization of
distinct cpn60-based subgroups of Gardnerella vaginalis in the vaginal microbiota. PLoS One.
2012;7(8):e43009. doi: 10.1371/journal.pone.0043009. Epub 2012 Aug.
164.
Eren AM, Zozaya M, Taylor CM, Dowd SE, Martin DH, Ferris MJ. Exploring the
diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous
couples through subtle nucleotide variation. PLoS One. 2011;6(10):e26732. doi:
10.1371/journal.pone.0026732. Epub 2011 Oct 25
165.
Datcu R. Characterization of the vaginal microflora in health and disease. Dan Med J.
2014 Apr;61(4):B4830. PubMed PMID: 24814599.
166.
Ling Z, Liu X, Chen X, Zhu H, Nelson KE, Xia Y, Li L, Xiang C. Diversity of
cervicovaginal microbiota associated with female lower genital tract infections. Microb Ecol.
2011 Apr;61(3):704-14. doi: 10.1007/s00248-011-9813
167.
Schwebke JR, Richey CM and Weiss HL. Correlation of biheviors with
microbiological changes in vaginal flora. J Infect Dis 1999; 180:1632-6.
168.
Escheenbach DA, Thwin SS, Patton DL et al. Influence of the normal menstrual cycle
on vaginal tissue, discharge, and microflora. Clin Infect Dis 2000;30:901-5
169.
Ravel J, Brotman RM, Gajer P, Ma B, Nandy M, Fadrosh DW, Sakamoto J, Koenig
SS, Fu L, Zhou X, Hickey RJ, Schwebke JR, Forney LJ. Daily temporal dynamics of vaginal
332
microbiota before, during and after episodes of bacterial vaginosis. Microbiome. 2013 Dec
2;1(1):29
170.
Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the
healthy human microbiome. Nature. 2012 Jun 13;486(7402):207-14.
doi:10.1038/nature11234. PubMed PMID: 22699609; PubMed Central PMCID:
PMC3564958.
171.
Fettweis JM, Serrano MG, Sheth NU, Mayer CM, Glascock AL, Brooks JP, Jefferson
KK; Vaginal Microbiome Consortium (additional members), Buck GA. Species-level
classification of the vaginal microbiome. BMC Genomics. 2012;13 Suppl 8:S17. doi:
10.1186/1471-2164-13-S8-S17. Epub 2012 Dec 17
172.
Faust K, Sathirapongsasuti JF, Izard J, Segata N, Gevers D, Raes J,Huttenhower C.
Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol.
2012;8(7):e1002606
173.
Martin DH. The microbiota of the vagina and its influence on women's health and
disease. Am J Med Sci. 2012 Jan;343(1):2-9
174.
Gordon JI, Klaenhammer TR. A rendezvous with our microbes. Proc Natl Acad Sci U
S A. 2011 Mar 15;108 Suppl 1:4513-5.
175.
Martin DH, Zozaya M, Lillis R, Miller J, Ferris MJ. The microbiota of the human
genitourinary tract: trying to see the forest through the trees. Trans Am Clin Climatol Assoc.
2012;123:242-56. PubMed PMID: 23303991; PubMed CentralPMCID: PMC3540603.
176.
Martin DH. The microbiota of the vagina and its influence on women's health and
disease. Am J Med Sci. 2012 Jan;343(1):2-9. doi: 10.1097/MAJ.0b013e31823ea228. Review.
177.
Fredricks DN. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the
vaginal microbiota. Anaerobe. 2011 Aug;17(4):191-5. doi: 10.1016/j.anaerobe.2011.01.001.
Epub 2011 Mar 3. PubMed PMID: 21376827
178.
Jespers V, Menten J, Smet H, Poradosú S, Abdellati S, Verhelst R, Hardy L, Buvé A,
Crucitti T. Quantification of bacterial species of the vaginal microbiome in different groups of
women, using nucleic acid amplification tests. BMC Microbiol. 2012 May 30;12:83. doi:
10.1186/1471-2180-12-83. PubMed PMID: 22647069; PubMed Central PMCID:
PMC3418157.
179.
Shipitsyna E, Roos A, Datcu R, Hallén A, Fredlund H, Jensen JS, Engstrand L,
Unemo M. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age--sensitive
and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible? PLoS One. 2013 Apr
9;8(4):e60670
180.
Ravel J, Gajer P, Abdo Z, Schneider GM, Koenig SS, McCulle SL, Karlebach S,
Gorle R, Russell J, Tacket CO, Brotman RM, Davis CC, Ault K, Peralta L, Forney LJ.
Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 15;108
Suppl 1:4680-7. doi: 10.1073/pnas.1002611107
181.
Marconi C, Donders GG, Parada CM, Giraldo PC, da Silva MG. Do Atopobium
vaginae, Megasphaera sp. and Leptotrichia sp. change the local innate immune response and
sialidase activity in bacterial vaginosis? Sex Transm Infect. 2013 Mar;89(2):167-73. doi:
10.1136/sextrans-2012-050616. Epub 2012 Oct 16. PubMed PMID: 23076402
182.
Ling Z, Kong J, Liu F, Zhu H, Chen X, Wang Y, Li L, Nelson KE, Xia Y, Xiang
C.Molecular analysis of the diversity of vaginal microbiota associated with bacterial
vaginosis. BMC Genomics. 2010 Sep 7;11:488. doi:10.1186/1471-2164-11-488.
183.
Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE, Fortenberry JD, Fidel PL Jr, Martin DH.
Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe,
with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis. 2004 Feb 13;4:5. PubMed PMID:15018635;
PubMed Central PMCID:
184.
Sobel JD. Bacterial vaginosis. Annu Rev Med 2000; 51:349-56
333
185.
Fredricks DN, Fiedler TL, Marrazzo JM. Molecular identification of bacteria
associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 2005; 353:1899–1911
186.
Wolraht H, Forsum U, Larsson PG and Boren H. Analisis of bacterial vaginosisrelated amnines in vaginal fluid by gas chromatography and mass spectrometry. J Clin Microb
2001; 39:4026-31
187.
Mead PB. epidemiology of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol 1993; 169:446-9
188.
Bernstein PS. Screening for bacterial vaginosis in pregnancy. ACOG 2000; 48th
Annual Clinical Meeting
189.
Ralph SG, Rutheford AJ and Wilson JD. Influence of bacterial vaginosis on
concepcion and miscarriagin the first trimestar:cohort study. BMJ 1999; 319:220-3.
190.
Donders GG, Van Bulck B, Caudron J et al. Realtionship of bacterial vaginosis and
mycoplasmas to the risk of spontaneus abortion. Am J Obstet Gynecol 2000; 183:431-7
191.
McGregor JA, French JI, Jones W, et al. Bacterial vaginosis is associated with
prematurity and vaginal fluid mucinase and sialidase: results of a controlled trial of topical
clindamycin cream. Am J Obstet Gynecol 1994;170:1048–60.
192.
Hay PE, Lamont RF, Taylor-Robinson, et al. Abnormal bacterial colonisation of the
genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. BMJ 1994;308:295–8.xt]
193.
Hillier SL, Nugent RP, Eschenbach DA, et al. Association between bacterial vaginosis
and preterm delivery of a low-birth-weight infant.NEngl JMed 1995;333:1737–42.
194.
Chaim W,.Mazor M and Leiberman JR. The relationship between bacterial vaginosis
and preterm birth. A review.Arch Gynecol Obstet 1997; 259:51-58. ,
195.
Silver HM, Sperling RS and St Gibbs RS. Evidence relating bacterial vaginosis to
intraamniotic infection. Am J Obstet Gynecol 1989; 161:808-12.
196.
Martius J and Escheenbach DA. The role of bacterial vaginosis as a cause of amniotic
fluid infectionn, chorioamnionitis and prematurity: a review. Arch Gynecol Obstet 1990;
247:1-13.
197.
Eschenbach DA. bacterial vaginosis. In: Hitchcock PJ, Mac Cay HT, Wasserheit IJ
Eds. Sexually transmitted diseases and adverse outcomes in pregnancy. Washington.
DC:ASM press; 1999; 103-23.
198.
McDonald HM, O’Loughlin JA, Vigneswaran R et al. Impact of metronidazole
therapy on pretherm birth in womwn with bacterial vaginosis flora(Gardnerella vaginalis): a
randosimed, placebo controlled trial. BJOG 1997; 104:1391-7.
199.
Carey JC, Klebanoff M, Hauth JC, Hillier SL, Thom EA, Ernest JM, et al.
Metronidazole to prevent preterm delivery in pregnant women with asymptomatic bacterial
vaginosis. National Institute of Child Health and Human Development Network of MaternalFetal Medicine Units. N Engl J Med 2000; 342:534-40.
200.
Morales WJ, Schorr S, Albritton J. Effect of metronidazole in patients with preterm
birth in preceding pregnancy and bacterial vaginosis: a placebo-controlled, double-blind study.
Am J Obstet Gynecol 1994;171:345-7.
201.
Hauth JC, Goldenberg RL, Andrews WM, DuBard MB, Copper RL. Reduced
incidence of preterm delivery with metronidazole and erythromycin in women with bacterial
vaginosis. N Engl J Med 1995;333:1732–6
202.
Donders GGG. Bacterial vaginosis in pregnancy: screen and treat? Eur J Obstet
Gynecol Reprod Biol 1999;83:1–4.
203.
Donders GGG. Traetmant of sexually transmitted bacterial diseases in pregnat
womwn. drugs 2000; 59:477-85.
204.
Brocklehurst P, Gordon A, Heatley E, Milan SJ. Antibiotics for treating bacterial
vaginosis in pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31;1:CD000262. doi:
10.1002/14651858.CD000262.pub4. Revie .
205.
McDonald HM, Brocklehurst P, Gordon A. Antibiotics for treating bacterial vaginosis
in pregnancy. Cochrane Database Syst. Rev . 1, CD000262 (2007).
334
206.
Nygren P, Fu R, Freeman Met al. Evidence on the benefits and harms of screening
and treating pregnant women who are asymptomatic for bacterial vaginosis: an update review
for the US Preventive Services Task Force. Ann. Intern. Med. 148(3), 220–233 (2008)
207.
Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31;1:CD000262
208.
Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is
improved by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol.
1991;29(2):297-301
209.
Cauci S, Culhane JF. High sialidase levels increase preterm birth risk among women
who are bacterial vaginosis-positive in early gestation. Am J Obstet Gynecol. 2011
Feb;204(2):142.e1-9. doi: 10.1016/j.ajog.2010.08.061. Epub 2010 Nov5. PubMed PMID:
2105572
210.
Marconi C, Donders GG, Bellen G, Brown DR, Parada CM, Silva MG. Sialidase
activity in aerobic vaginitis is equal to levels during bacterial vaginosis. Eur J Obstet Gynecol
Reprod Biol. 2013 Apr;167(2):205-9. doi:10.1016/j.ejogrb.2012.12.003. Epub 2013 Feb 10 5.
211.
Hay, P. E.et al . Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent
preterm delivery and late miscarriage. BMJ. 308 , 295–298 (1994).
212.
Donders, G. G. Definition and classification of abnormal vaginal flora. Best Pract Res
Clin Obstet Gynaecol. 21 , 355–373 (2007)
213.
Verhelst R, Cools P, Lopes dos Santos Santiago G, Temmerman M, Veneechoutte M.
Garnderella. In: Molecular detection of human bacterial pathogens. Liu D, editor. Boca Raton:
Press Taylor & Fracis Group. 2011; p. 81-95
214.
Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen KC, Eschenbach D, Holmes KK. Nonspecific
vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 1983;
74(1):14-22.
215.
Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears
for use in genitourinary medicine clinics.Sex Transm Infect. 2002;78(6):413-5
216.
Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Van Simaey L, De Ganck C,et
al. Comparison between Gram stain and culture for the characterization of vaginal microflora:
definition of a distinct grade that resembles grade I microflora and revised categorization of
grade Imicroflora. BMC Microbiol. 2005; 5:61
217.
Donders GG, Vereecken A, Bosmans E, Dekeersmaecker A, Salembier G, Spitz B.
Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic
vaginitis. BJOG 2002; 109(1):34-43
218.
Srinivasan S, Morgan MT, Liu C, Matsen FA, Hoffman NG, Fiedler TL, et al. More
than meets the eye: associations of vaginal bacteria with gram stain morphotypes using
molecular phylogenetic analysis. PLoS One. 2013; 8(10):e78633.
219.
Srinivasan S, Hoffman NG, Morgan MT, Matsen FA, Fiedler TL, Hall RW, et al.
Bacterial Communities in Women with Bacterial Vaginosis: High Resolution Phylogenetic
Analyses Reveal Relationships of Microbiota to Clinical Criteria. PLoS ONE, 2012; 7(6):
e37818.
220.
Brotman RM, Ravel J, Cone RA, Zenilman JM. Rapid fluctuation of the vaginal
microbiota measured by Gram stain analysis. Sex Transm Infect. 2010; Aug;86(4):297-302
221.
Biagi E, Vitali B, Pugliese C, Candela M, Donders GG, Brigidi P. Quantitative
variations in the vaginal bacterial population associated with asymptomatic infections: a realtime polymerase chain reaction study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009 Mar; 28(3):281-5
222.
Srinivasan S, Liu C, Mitchell CM, Fiedler TL, Thomas KK, Agnew KJ, Marrazzo JM,
Fredricks DN. Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial
vaginosis. PLoS One. 2010 Apr 15;5(4):e10197. doi:10.1371/journal.pone.0010197. PubMed
PMID: 20419168; PubMed Central PMCID: PMC2855365.
223.
Ravel J, Brotman RM, Gajer P, Ma B, Nandy M, Fadrosh DW, Sakamoto J, Koenig
SS, Fu L, Zhou X, Hickey RJ, Schwebke JR, Forney LJ. Daily temporal dynamics of vaginal
335
microbiota before, during and after episodes of bacterial vaginosis. Microbiome. 2013 Dec
2;1(1):29. doi: 10.1186/2049-2618-1-29.
224.
Wira CR, Fahey JV, Sentman CL, Pioli PA, Shen L. Innate and adaptive immunity in
female genital tract: cellular responses and interactions. Immunol Rev. 2005 Aug;206:306-35.
Review. PubMed PMID: 16048557.
225.
Hickey DK, Patel MV, Fahey JV, Wira CR. Innate and adaptive immunity at mucosal
surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection
against the transmission of sexually transmitted infections. J Reprod Immunol. 2011
Mar;88(2):185-94. doi: 10.1016/j.jri.2011.01.005. Epub2011 Feb 26. Review. PubMed PMID:
21353708; PubMed Central PMCID: PMC3094911.
226.
Wira CR, Fahey JV. The innate immune system: gatekeeper to the female
reproductive tract. Immunology. 2004 Jan;111(1):13-5. PubMed PMID: 14678193;PubMed
Central PMCID: PMC1782397.
227.
Rodriguez-Garcia M, Patel MV, Wira CR. Innate and adaptive anti-HIV immune
responses in the female reproductive tract. J Reprod Immunol. 2013Mar;97(1):74-84.
228.
Hickey DK, Patel MV, Fahey JV, Wira CR. Innate and adaptive immunity at mucosal
surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection
against the transmission of sexually transmitted infections. J Reprod Immunol. 2011
Mar;88(2):185-94.
229.
Wira CR, Fahey JV, Rodriguez-Garcia M, Shen Z, Patel MV. Regulation of Mucosal
Immunity in the Female Reproductive Tract: The Role of Sex Hormones in Immune
Protection Against Sexually Transmitted Pathogens. Am J Reprod Immunol. 2014 Apr 16.
230.
Wira CR, Grant-Tschudy KS, Crane-Godreau MA. Epithelial cells in the female
reproductive tract: a central role as sentinels of immune protection. Am J Reprod Immunol.
2005 Feb;53(2):65-76. Review. PubMed PMID: 15790340.
231.
Quayle AJ. The innate and early immune response to pathogen challenge in the
female genital tract and the pivotal role of epithelial cells. J Reprod Immunol. 2002 OctNov;57(1-2):61-79. Review. PubMed PMID: 12385834
232.
Andersen JM, Al-Khairy D, Ingalls RR. Innate immunity at the mucosal surface: role
of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial
pathogens. Biol Reprod. 2006 May;74(5):824-31. Epub 2006 Jan 18. PubMed PMID:
16421230.
233.
Hase K, Ohno H. [Epithelial cells as sentinels in mucosal immune barrier]. Nihon
Rinsho Meneki Gakkai Kaishi. 2006 Feb;29(1):16-26. Review. Japanese. PubMed PMID:
16505599
234.
Walz A, Peveri P, Aschauer H, Baggiolini M. Purification and amino acid sequencing
of NAF, a novel neutrophil-activating factor produced by monocytes. Biochem. Biophys. Res.
Commun. Dec; 1987 149(2):755–761. [PubMed: 3322281]
235.
Yoshimura T, Matsushima K, Tanaka S, Robinson EA, Appella E, Oppenheim JJ,
Leonard EJ. Purification of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor that has
peptide sequence similarity to other host defense cytokines. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
Dec; 1987 84(24):9233– 9237.
236.
Al-Mushrif S, Eley A, Jones BM. Inhibition of chemotaxis by organic acids from
anaerobes may prevent a purulent response in bacterial vaginosis. J Med Microbiol. 2000
Nov;49(11):1023-30
237.
Mirmonsef P, Gilbert D, Zariffard MR, Hamaker BR, Kaur A, Landay AL, Spear GT.
The effects of commensal bacteria on innate immune responses in the female genital tract. Am
J Reprod Immunol. 2011; 65:190–195.
238.
Kobayashi SD, Voyich JM, Burlak C, DeLeo FR. Neutrophils in the innate immune
response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). Nov; 2005 53(6):505–517.
336
239.
Ravichandran KS. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me
signaling pathways. Immunity. 2011 Oct 28;35(4):445-55
240.
Elliott MR, Chekeni FB, Trampont PC, Lazarowski ER, Kadl A, Walk SF, Park
D,Woodson RI, Ostankovich M, Sharma P, Lysiak JJ, Harden TK, Leitinger N,Ravichandran
KS. Nucleotides released by apoptotic cells act as a find-me signal to promote phagocytic
clearance. Nature. 2009 Sep 10;461(7261):282-6. doi:10.1038/nature08296.
241.
Gude DR, Alvarez SE, Paugh SW, Mitra P, Yu J, Griffiths R, Barbour SE,Milstien S,
Spiegel S. Apoptosis induces expression of sphingosine kinase 1 to release sphingosine-1phosphate as a "come-and-get-me" signal. FASEB J. 2008 Aug;22(8):2629-38.
242.
Kobayashi SD, DeLeo FR. Role of neutrophils in innate immunity: a systems biologylevel approach. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2009 Nov-Dec;1(3):309-33.
243.
Colotta F, Re F, Polentarutti N, Sozzani S, Mantovani A (1992) Modulation of
granulocyte survival and programmed cell death by cytokines and bacterial products. Blood
80: 2012–2020 10
244.
Lee A, Whyte MKB, Haslett C (1993) Prolongation of in vitro lifespan and functional
longevity of neutrophils by inflammatory mediators acting through inhibition of apoptosis. J
Leukoc Biol 54: 283–288.
245.
Kobayashi SD, Braughton KR, Whitney AR, Voyich JM, Schwan TG, Musser JM,
DeLeo FR. Bacterial pathogens modulate an apoptosis differentiation program in human
neutrophils. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 16;100(19):10948-53
246.
Dibbert B, et al. Cytokine-mediated Bax deficiency and consequent delayed
neutrophil apoptosis: a general mechanism to accumulate effector cells in inflammation. Proc
Natl Acad Sci USA 1999;96: 13330–13335.9.
247.
Saba S, Soong G, Greenberg S, Prince A.Bacterial stimulation of epithelial G-CSF
and GM-CSF expression promotes PMN survival in CF airways. Am J Respir Cell Mol Biol
2002;27:561–567
248.
Lee A, Whyte MKB, Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neutrophil
functional longevity by inflammatory mediators. J Leukoc Biol 1993;54:283–28. 60.
249.
Gasmi L, McLennan AG, Edwards SW. The diadenosine polyphosphates Ap3A and
Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil–platelet interactions during
inflammation. Blood 1996;87:3442–3449. 61.
250.
Lee E, et al. Reversal of human neutrophil survival by leukotriene B4 receptor
blockade and 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase activating protein inhibitors. Am J Respir
Crit Care Med 1999;160:2079–2085. 62.
251.
Colotta F, Re F, Polantarutti N, Sozzani S, Mantovani A. Modulation of granulocyte
survival and programmed cell death by cytokines and bacterial products. Blood
1992;80:2012–2020. 63.
252.
Pericle F, et al. Interleukin-2 prevention of apoptosis in human neutrophils. Eur J
Immunol 994;24:440–444. 64.
253.
Biffl WL, Moore EE, Moore FA, Barnett CCJ. Interleukin-6 suppression of neutrophil
apoptosis is neutrophil concentration dependent. J Leukoc Biol 1995;58:582–584. 65.
254.
Girard D, Paquet ME, Paquin R, Beaulieu AD. Differential effects of interleukin-15
(IL-15) and IL-2 on Human neutrophils: modulation of phagocytosis, cytoskeleton
rearrangement, gene expression and apoptosis by IL-15. Blood 1996;88:3176–3184. 66.
255.
Klebanoff SF, Olszowski S, Voorhis WCV, Ledbetter JA, Waltersdorph AM,
Schlechte KG. Effects of g-interferon on human neutrophils:protection from deterioration on
storage. Blood 1992;80:225–234. 67.
256.
Daigle I, Yousefi S, Colonna M, Green DR, Simon HU. Death receptors bind SHP-1
and block cytokine-induced anti-apoptotic signaling in neutrophils. Nat Med 2002;8:61–67.
68.
337
257.
Sabroe I, Jones EC, Usher LR, Whyte MK, Dower SK. Toll-like receptor (TLR) 2 and
TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte
lipopolysaccharide responses. J Immunol 2002;168:4701–4710
258.
Borjesson DL, Kobayashi SD, Whitney AR, Voyich JM, Argue CM, Deleo FR.
Insights into pathogen immune evasion mechanisms: Anaplasma phagocytophilum fails to
induce an apoptosis differentiation program in human neutrophils. J Immunol. 2005 May
15;174(10):6364-72. PubMed PMID: 15879137. 2:
259.
Voyich JM, Braughton KR, Sturdevant DE, Whitney AR, Saïd-Salim B, Porcella
SF,Long RD, Dorward DW, Gardner DJ, Kreiswirth BN, Musser JM, DeLeo FR. Insights into
mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J
Immunol. 2005 Sep 15;175(6):3907-19. PubMed PMID: 16148137. 3:
260.
Kobayashi SD, Voyich JM, Somerville GA, Braughton KR, Malech HL, Musser JM,
DeLeo FR. An apoptosis-differentiation program in human polymorphonuclear leukocytes
facilitates resolution of inflammation. J Leukoc Biol. 2003 Feb;73(2):315-22. PubMed PMID:
12554809.
261.
Kobayashi SD, Voyich JM, Braughton KR, DeLeo FR. Down-regulation of
proinflammatory capacity during apoptosis in human polymorphonuclear leukocytes. J
Immunol. 2003 Mar 15;170(6):3357-68. PubMed PMID: 12626596.
262.
Kennedy AD, DeLeo FR. Neutrophil apoptosis and the resolution of infection.
Immunol Res. 2009;43(1-3):25-61.
263.
Hitti J, Hillier SL, Agnew KJ, Krohn MA, Reisner DP, Eschenbach DA. Vaginal
indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstet Gynecol. 2001 Feb;97(2):211-9.
264.
Danforth, D. N., 1983, “The Morphology of the Human Cervix,” Clin. Obstet.
Gynecol., 26(1), pp. 7–13
265.
Uldbjerg N, Ekman G, Malmstrom A. Ripening of the human uterine cervix related to
changes in collagen, glycosaminoglycans and collagenolytic activity. Am J Obstet Gynecol
1982; 147:662. 80.
266.
Uldbjerg N, Forman A, Peterson L et al. Biomechanical and biochemical changes of
the uterus and cervix during pregnancy. In: Reece E, Hobbins J, Mahoney M et al, eds.
Medicine of the Fetus and Mother. Philadelphia: JB Lippincott, 1992:849. 81.
267.
Liggins G. Cervical ripening as an inflammatory reaction. In: Ellwood D, Anderson
A, eds. The Cervix in Pregnancy and Labour: Clinical and Biochemical Investigations.
Edinburgh: Churchill Livingstone, 1981
268.
Ito A, Hiro D, Ojima Y et al. Spontaneous production of interleukin-1-like factors
from pregnant rabbit uterine cervix. Am J Obstet Gynecol 1988; 159:261-65. 83.
269.
Ito A, Hiro D, Sakyo K et al. The role of leukocyte factors on uterine cervical ripening
and dilation. Biol Reprod 1987; 37:511-17. 84.
270.
Ito A, Leppert PC, Mori Y. Human recombinant interleukin-1 alpha increases
elastase-like enzyme in human uterine cervical fibroblasts. Gynecol Obstet Invest 1990;
30:239-41. 278 Immunology of Pregnancy 85.
271.
Osmers RG, Blaser J, Kuhn W et al. Interleukin-8 synthesis and the onset of labor.
Obstet Gynecol 1995; 86:223-29. 86.
272.
Maradny EE, Kanayama N, Halim A et al. Stretching of fetal membranes increases
the concentration of interleukin-8 and collagenase activity. Am J Obstet Gynecol 1996;
174:843-49
273.
Ogawa M, Hirano H, Tsubaki H et al.The role of cytokines in cervical ripening:
Correlations between the concentrations of cytokines and hyaluronic acid in cervical mucus
and the induction of hyaluronic acid production by inflammatory cytokines by human cervical
fibroblasts. Am J Obstet Gynecol 1998;179:105-10.
274.
Junqueira LCU, Zugaib M, Montes GS, Toledo OMS, Krisztan RM, Shigihara KM.
Morphologic and histochemical evidence for the occurrence of collagenolysis and for the role
338
of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes during cervical dilation. Am J Obstet Gynecol
1980;138:273-81.
275.
Kobayashi H and Terao T.Hyaluronic acid-specific regulation of cytokines by human
uterine fibroblasts, Am J Physiol 1997; 273:1151-9.
276.
Ogawa M, Hirano H, Tsubaki H et al.The role of cytokines in cervical ripening:
Correlations between the concentrations of cytokines and hyaluronic acid in cervical mucus
and the induction of hyaluronic acid production by inflammatory cytokines by human cervical
fibroblasts. Am J Obstet Gynecol 1998;179:105-10.
277.
Watari M, Watari H, DiSanto ME, Chacko S, Shi GP, Strauss JF III. Proinflammatory cytokines induce expression of matrixmetabolizing enzymes in human cervical
smooth muscle cells. Am J Pathol 1999;154(6):1755–62.
278.
Watari M, Watari HFujimoto T. Lipopolysaccharide Induces Interleukin-8 Production
By Human Cervical Smooth Muscle Cells. J Soc Gynecol Investig 2003;10:110 –7.
279.
Fortunato SJ. Menon R, Lombardi SJ. Expression of a progelatinase activator (MT1MMP) in human fetal mebranes. Am J Reprod Immunol 1998; 39:316-22.
280.
Fortunato SJ. Menon R, Lombardi SJ. Presence of four tissue inhibitors of matrix
metalloproteinases (TIMP –1, 2, 3, 4) in human fetal mebranes. Am J Reprod Immunol 1998;
40:395-400.
281.
Full Huang HY, Wen Y, Urwin C et al. Cytokine-Mediated Regulation of 92Kilodalton Type IV Collagenase, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1), and
TIMP-3 Messenger Ribonucleic Acid Expression in Human Endometrial Stromal Cells. J
Clin Endocrin Metab 1998; 83:1721-29. .
282.
Challis JR, Sloboda DM, Alfaidy N, et al. Prostaglandins and mechanisms of preterm
birth. Reproduction 2002;124(1):1–17.
283.
Gibb W, Challis JR. Mechanisms of term and preterm birth. J Obstet Gynaecol Can
2002;24(11):874–83.
284.
Whittle WL, Patel FA, Alfaidy N, et al. Glucocorticoid regulation of human and ovine
parturition: The relationship between fetal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation and
intrauterine prostaglandin production. Biol Reprod 2001;64(4): 1019–32.
285.
Winkler M, Oberpichler A, Tschesche H, Ruck P, Fischer DC, Rath W.
Collagenolysis in the lower uterine segment during parturition at term: Correlations with stage
of cervical dilatation and duration of labor. Am J Obstet Gynecol 1999;181(1):153–8
286.
R . A . Word, X. H. Li, M. Hnat, and K. Car r i ck , “Dynamics of cer v ical
remodeling dur ing preg nancy and par tur ition: mechanisms and cur rent concepts,”Se minar
s in Re product ive Me d i c i n e, vol. 25, no. 1, pp. 69–79, 2007
287.
Wood C, Bannerman R, Booth R et al. The prediction of premature labor by
observation of the cervix and external tocography. Am J Obstet Gynecol 1965; 91:396. 104.
288.
Catalano PM, Ashikaga T, Mann LI. Cervical change and uterine activity as predictors
of preterm delivery. Am J Perinatol 1989; 6:185-90. 105.
289.
Leveno KJ, Cox K, Roark ML. Cervical dilatation and prematurity revisited. Obstet
Gynecol 1986; 68:434-35. 106. Heath VC, Southall TR, Souka AP et al. Cervical length at 23
weeks of gestation: Prediction of spontaneous preterm delivery. Ultrasound Obstet Gynecol
1998; 12:312-17.
290.
Uldbjerg N, Ekman G, Malmstrom A, Olsson K, Ulmsten U.Ripening of the human
uterine cervix related to changes in collagen, glycosaminoglycans, and collagenolytic activity.
Am Obstet Gynecol 1983;147(6):662–6.
291.
Rotten D, Gavignet C, Colin MC, Robert AM, Godeau G. Evolution of the elastic
fiber network of the human uterine cervix before, during and after pregnancy. A quantitative
evaluation by automated image analysis. Clin Physiol Biochem 1988;6(5):285–92.
339
292.
Watari M, Watari H, DiSanto ME, Chacko S, Shi GP, Strauss JF III. Proinflammatory cytokines induce expression of matrixmetabolizing enzymes in human cervical
smooth muscle cells. Am J Pathol 1999;154(6):1755–62.
293.
Bokstrom H, Brannstrom M, Alexandersson M, Norstrom A.Leukocyte
subpopulations in the human uterine cervical stroma early and term pregnancy. Hum Reprod
1997;12(3):586–90.
294.
Collins JJ, Usip S, McCarson KE, Papka RE. Sensory nerves and neuropeptides in
uterine cervical ripening. Peptides 2002; 23(1):167–83.
295.
Knudsen UB, Uldbjerg N, Rechberger T, Fredens K. Eosinophils in human cervical
ripening. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1997;72(2):165–8.
296.
Owiny JR, Gilbert RO, Wahl CH, Nathanielsz PW. Leukocytic invasion of the ovine
cervix at parturition. J Soc Gynecol Investig 1995;2(4):593–6.
297.
Spanggaard H, Knudsen UB, Uldbjerg N, Jeziorska M, Woolley DE, Danielsen CC.
Mast cells in cervical ripening an immunohistochemical and biomechanical study in rats. Eur J
Obstet Gynecol Reprod Biol 1997;73(1):91–7.
298.
Stjernholm Y, Sennstrom M, Granstrom L, Ekman G, Johansson O. Protein gene
product 9.5-immunoreactive nerve fibers and cells in human cervix of late pregnant, postpartal
and non-pregnant women. Acta Obstet Gynecol Scand 1999;78(4): 299–304.
299.
Weiss G. Endocrinology of Parturition . J Clin Endoc and Metab.2000; 85:4421-5.
300.
Yallampalli C, Buhimschi I, Chwalisz K, Garfield RE, Dong YL. Preterm birth in rats
produced by the synergistic action of a nitric oxide inhibitor (NG -nitro-L-arginine methyl
ester) and an antiprogestin (onapristone). Am J Obstet Gynecol 1996;175:207-12
301.
Kelly RW, Leask R, Calder AA. Choriodecidual production of interleukin-8 and
mechanism of parturation. Lancet 1992; 339:776.8
302.
Chwalisz K, Shi Shao O, Neff G, et al: The effect of antigestagen ZK 98, 199 on the
uterine cervix. Acta Endocrinol 283:113, 1987. 57.
303.
Elliott CL, Brennand JE, Calder AA: The effects of mifepristone on cervical ripening
and labor induction in primigravidae. Obstet Gynecol 92:804-809, 1998. 58.
304.
Giacalone PL, Daures JP, Faure JM, et al: The effects of mifepristone on uterine
sensitivity to oxytocin and on fetal heart rate patterns. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol
97:30-34, 2001. 59.
305.
Norman J: Antiprogesterones. Br J Hosp Med 45:372-375, 1991. 60.
306.
Stenlund PM, Ekman G, Aedo AR, et al: Induction of labor with mifepristone: A
randomized, double-blind study versus placebo. Acta Obstet Gynecol Scand 78:793-798,
1999. 61.
307.
Chwalisz K, Shao-Qing S, Garfi eld RE, et al: Cervical ripening in guineapigs after a
local application of nitric oxide. Hum Reprod 12:2093-2101, 1997. 62.
308.
Hegele-Hartung C, Chwalisz K, Beier HM, et al: Ripening of the uterine cervix of the
guinea-pig after treatment with the progesterone antagonist onapristone (ZK 98.299): An
electron microscopic study. Hum Reprod 4:369-377, 1989. 63.
309.
Wolf JP, Sinosich M, Anderson TL, et al: Progesterone antagonist (RU 486) for
cervical dilation, labor induction, and delivery in monkeys: Effectiveness in combination with
oxytocin. Am J Obstet Gynecol 160:45-47, 1989. 64.
310.
Stys SJ, Clewell WH, Meschia G: Changes in cervical compliance at parturition
independent of uterine activity. Am J Obstet Gynecol 130:414- 418, 1978. 65.
311.
Chwalisz K: The use of progesterone antagonists for cervical ripening and as an
adjunct to labour and delivery. Hum Reprod (9 Suppl 1):131-161, 1994. 66.
312.
DeFranco EA, O’Brien JM, Adair CD, et al: Vaginal progesterone is associated with a
decrease in risk for early preterm birth and improved neonatal outcome in women with a short
cervix: A secondary analysis from a randomized, double-blind, placebo-controlled trial.
Ultrasound Obstet Gynecol 30:697-705, 200767.
340
313.
Meis PJ, Klebanoff M, Thom E, et al: Prevention of recurrent preterm delivery by 17
alpha-hydroxyprogesterone caproate. N Engl J Med 348:2379-2385, 2003. 68.
314.
Fonseca EB, Celik E, Parra M, et al: Progesterone and the risk of preterm birth among
women with a short cervix. N Engl J Med 357:462-469, 2007. 69.
315.
Facchinetti F, Paganelli S, Comitini G, et al: Cervical length changes during preterm
cervical ripening: Effects of 17-alpha-hydroxyprogesterone caproate. Am J Obstet Gynecol
196:453-454, 2007
316.
Phelps JY, Higby K, Smyth MH, Ward JA, Arredondo F, Mayer AR. Accuracy and
intraobserver variability of simulated cervical dilatation measurements. Am J Obstet Gynecol.
Sep 1995;173(3 Pt 1):942-945. 43.
317.
Newman RB, Goldenberg RL, Iams JD, et al. Preterm prediction study: Comparison
of the cervical score and Bishop score for prediction of spontaneous preterm delivery. Obstet
Gynecol. Sep 2008;112(3):508-515. 47
318.
Celik, E., To, M., Gajewska, K., Smith, G. C. S., and Nicolaides, K. H., 2008,
“Cervical Length and Obstetric History Predict Spontaneous Preterm Birth: Development and
Validation of a Model to Provide Individualized Risk Assessment,” Ultrasound Obstet.
Gynecol., 31(5), pp. 549–554. [29]
319.
Fonseca, E. B., Celik, E., Parra, M., Singh, M., and Nicolaides, K. H., 2007,
“Progesterone and the Risk of Preterm Birth Among Women With a Short Cervix,” N. Engl. J.
Med., 357(5), pp. 462–469. [30]
320.
Hassan, S. S., Romero, R., Berry, S. M., Dang, K., Blackwell, S. C., Treadwell, M. C.,
and Wolfe, H. M., 2000, “Patients With an Ultrasonographic Cervical Length<or¼15 mm
Have Nearly a 50% Risk of Early Spontaneous Preterm Delivery,” Am. J. Obstet. Gynecol.,
182(6), pp. 1458–1467. [31]
321.
Hassan, S. S., Romero, R., Vidyadhari, D., Fusey, S., Baxter, J. K., Khandelwal, ,
2011, “Vaginal Progesterone Reduces the Rate of Preterm Birth in Women With a
Sonographic Short Cervix: A Multicenter, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled
Trial,” Ultrasound Obstet. Gynecol., 38(1), pp. 18–31.].
322.
Iams, J. D., Goldenberg, R. L., Meis, P. J., Mercer, B. M., Moawad, A., Das, A.,
Thom, E., McNellis, D., Copper, R. L., Johnson, F., and Roberts, J. M., 1996, “The Length of
the Cervix and the Risk of Spontaneous Premature Delivery. National Institute of Child Health
and Human Development Maternal Fetal Medicine Unit Network,” N. Engl. J. Med., 334(9),
pp. 567–572
323.
Andersen HF, CE Nugent, SDWanty, RH Hayashi: Prediction of risk for preterm
delivery by ultrasonographic measurement of cervical length. Am J Obstet Gynecol 1990;
163: 859-67. 10)
324.
Cook CM, DA Ellwood: The cervix as a predictor of preterm delivery in 'at-risk'
women. Ultrasound Obstet Gynecol 2000;15:109-13. 11)
325.
Hassan SS, R Romero, SM Berry,et al.: Patients with an ultrasonographic cervical
length < or =15 mm have nearly a 50% risk of early spontaneous preterm delivery. Am J
Obstet Gynecol. 2000;182:1458-67.12)
326.
Heath VC, TR Southall, AP Souka, A Elisseou, KH Nicolaides: Cervical length at 23
weeks of gestation: prediction of spontaneous preterm delivery. Ultrasound Obstet Gynecol.
1998;12:312-7. 13)
327.
Taipale P, V Hiilesmaa: Sonographic measurement of uterine cervix at 18-22 weeks
gestation and the risk of preterm delivery. Obstet Gynecol. 1998 ;92:902-7.
328.
Heath VC, Southall TR, Souka AP, Elisseou A, Nicolaides KH. Cervical length at 23
weeks of gestation: prediction of spontaneous preterm delivery. Ultrasound Obstet Gynecol.
1998;12:312-317. 7.
341
329.
Crane JM, Hutchens D. Transvaginal sonographic measurement of cervical length to
predict preterm birth in asymptomatic women at increased risk: a systematic review.
Ultrasound Obstet Gynecol. 2008;31:579–587
330.
Owen J, Szychowski JM, Hankins G, et al. Does midtrimester cervical length >25 mm
predict preterm birth in high-risk women? Am J Obstet Gynecol. Oct 2010;203(4):393.e1-5
331.
Conde-Agudelo A, Romero R, Hassan SS, Yeo L. Transvaginal sonographic cervical
length for the prediction of spontaneous preterm birth in twin pregnancies: A systematic
review and metaanalysis. Am J Obstet Gynecol. Aug 2010;203(2):128.e1-12
332.
Iams JD, Berghella V. Care for women with prior preterm birth. Am J Obstet
Gynecol. Aug 2010;203(2):89-100.
333.
Iams JD. Prediction and early detection of preterm labor. Obstet Gynecol. Feb
2003;101(2):402-412
334.
Iams JD, Creasy RK. Preterm Labor and Delivery. 5th ed. Philadelphia: Saunders;
2004.
335.
Meis PJ, Klebanoff M, Thom E, et al; National Institute of Child Health and Human
Development Maternal-Fetal Medicine Units Network. Prevention of recurrent preterm
delivery by 17 alpha-hydroxyprogesterone caproate. N Engl J Med. 2003;348:2379-2385.
336.
Hassan SS, Romero R, Vidyadhari D, et al; PREGNANT Trial. Vaginal progesterone
reduces the rate of preterm birth in women with a sonographic short cervix: a multicenter,
randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Ultrasound Obstet Gynecol. 2011;38:1831.
337.
da Fonseca EB, Bittar RE, Carvalho MH, Zugaib M. Prophylactic administration of
progesterone by vaginal suppository to reduce the incidence of spontaneous preterm birth in
women at increased risk: a randomized placebo-controlled double-blind study. Am J Obstet
Gynecol. 2003;188:419-424.
338.
Berghella V, Rafael TJ, Szychowski JM, et al. Cerclage for short cervix on
ultrasonography in women with singleton gestations and previous preterm birth: a metaanalysis. Obstet Gynecol. 2011;117:663-671.8.
339.
Berghella V, Odibo AO, To MS, Rust OA, Althuisius SM. Cerclage for short cervix
on ultrasonography: meta-analysis of trials using individual patient-level data. Obstet
Gynecol. 2005;106:181-189
340.
Fonseca EB, Celik E, Parra M, Singh M, Nicolaides KH. Progesterone and the risk of
preterm birth among women with a short cervix. N Engl J Med. 2007;357:462-469.
341.
Hassan SS, Romero R, Vidyadhari D, et al. Vaginal progesterone reduces the rate of
preterm birth in women with a sonographic short cervix: a multicenter, randomized, doubleblind, placebo-controlled trial. Ultrasound Obstet Gynecol. 2011;38:18-31.
342.
Romero R, Nicolaides K, Conde-Agudelo A, et al. Vaginal progesterone in women
with an asymptomatic sonographic short cervix in the midtrimester decreases preterm delivery
and neonatal morbidity: a systematic review and metaanalysis of individual patient data. Am J
Obstet Gynecol. 2012;206:124. e1-19.)
343.
Larma JD, Iams JD. Is sonographic assessment of the cervix necessary and helpful?
Clin Obstet Gynecol. 2012 Mar;55(1):324-35.
344.
Arisoy R, Yayla M. Transvaginal sonographic evaluation of the cervix in
asymptomatic singleton pregnancy and management options in short cervix. J Pregnancy.
2012;2012:201628. doi: 10.1155/2012/201628. Epub 2012 Feb 22. Review.
345.
Chandiramani M, Seed PT, Orsi NM, Ekbote UV, Bennett PR, Shennan AH, Tribe
RM. Limited relationship between cervico-vaginal fluid cytokine profiles and cervical
shortening in women at high risk of spontaneous preterm birth. PLoS One.
2012;7(12):e52412. doi: 10.1371/journal.pone.0052412. Vis JY,
346.
Kuin RA, Grobman WA, Mol BW, Bossuyt PM, Opmeer BC. Additional effects of
the cervical length measurement in women with preterm contractions: a systematic review.
342
Arch Gynecol Obstet. 2011 Sep;284(3):521-6. doi:10.1007/s00404-011-1892-z. Epub 2011
Apr 12. Review.
347.
Kayem G, Maillard F, Popowski T, Haddad B, Sentilhes L. Uterine cervical length
measurement by endovaginal ultrasonography: Technique and main utilizations]. J Gynecol
Obstet Biol Reprod (Paris). 2010 Jun;39(4):267-75. doi: 10.1016/j.jgyn.2010.03.005. Epub
2010 Apr 10. Review.
348.
Meijer-Hoogeveen M, Stoutenbeek P, Visser GH. Transperineal versus transvaginal
sonographic cervical length measurement in second- and third-trimester pregnancies.
Ultrasound Obstet Gynecol. 2008 Oct;32(5):657-62.
349.
Celik E, To M, Gajewska K, Smith GC, Nicolaides KH; Fetal Medicine Foundation
Second Trimester Screening Group. Cervical length and obstetric history predict spontaneous
preterm birth: development and validation of a model to provide individualized risk
assessment. Ultrasound Obstet Gynecol. 2008 May;31(5):549-54
350.
Crane JM, Hutchens D. Transvaginal sonographic measurement of cervical length to
predict preterm birth in asymptomatic women at increased risk: a systematic review.
Ultrasound Obstet Gynecol. 2008 May;31(5):579-87.
351.
Holst RM, Jacobsson B, Hagberg H, Wennerholm UB. Cervical length in women in
preterm labor with intact membranes: relationship to intra-amniotic inflammation/microbial
invasion, cervical inflammation and preterm delivery. Ultrasound Obstet Gynecol. 2006
Nov;28(6):768-74.
352.
Hong JS, Park KH, Noh JH, Suh YH. Cervical length and the risk of microbial
invasion of the amniotic cavity in women with preterm premature rupture of membranes. J
Korean Med Sci. 2007 Aug;22(4):713-7.
353.
Whitworth MK, Pafilis I, Vince G, Quenby S.. Park KH, Hong JS, Kang WS, Shin
DM. Transvaginal ultrasonographic measurement of cervical length in predicting intraamniotic infection and impending preterm delivery in preterm labor: a comparison with
amniotic fluid white blood cell count. J Perinat Med. 2008;36(6):479-84.
354.
Jung HJ, Park KH, Kim SN, Hong JS, Oh KJ, Kim G, Kwon JY. Non-invasive
prediction of intra-amniotic inflammation in women with preterm labor. Ultrasound Obstet
Gynecol. 2011 Jan;37(1):82355.
Park KH, Lee SY, Kim SN, Jeong EH, Oh KJ, Ryu A. Prediction of imminent preterm
delivery in women with preterm premature rupture of membranes. J Perinat Med. 2011 Nov
16;40(2):151-7.
356.
Larsson PG, Carlsson B, Fåhraeus L, Jakobsson T, Forsum U. Diagnosis of
bacterial vaginosis: need for validation of microscopic image area used for scoring
bacterial morphotypes. Sex Transm Infect. 2004; 80(1):63-7.
357.
Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears
for use in genitourinary medicine clinics. Sex Transm Infect. 2002;78(6):413-5.
Vandamme, P., B. Pot, M. Gillis, P. de Vos, K. Kersters, and J. Swings.
Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev
1996; 60: 407-38..
358.
359.
Bruno Biavati and Paola Mattarelli. The family bifidobacteriaceae. In: Martin
Dworkin, Stanley Falkow, Eugene Rosenberg, Karl-Heinz Schleifer, Erko
Stackebrandt, Editors. A Handbook on the Biology of Bacteria. Springer Science
Business Media, LLC; 2006. p. 3:322–38.
360.
Bergey’s manual of systematic bacteriology. Ninth editionBaltimore: John G
Holt editor. Williams&Wilkins Company; 2000, p. 573-574.
343
361.
Eribe, E.R.K. et al., Genetic diversity of Leptotrichia and description of
Leptotrichia goodfellowii sp. nov., Leptotrichia hofstadii sp. nov., Leptotrichia shahii
sp. nov., and Leptotrichia wadei sp. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54, 583, 2004
362.
Eribe, E.R., and Olsen, I., SDS-PAGE of whole-cell proteins and random
amplified polymorphic DNA (RAPD) analyses of Leptotrichia isolates, Microbial
Ecol. Health Dis., 14, 193, 2002
363.
Söderberg, G., Lindberg, A.A., and Nord, C.E., Bacteroides fragilis in acute
salpingitis, Infection, 7, 226, 1979.
364.
Evaldson, G. et al., Microbiological findings in pregnant women with
premature rupture of the membranes, Med. Microbiol. Immunol., 168, 283, 1980.
365.
Collins MD, Hoyles L, Tornqvist E, von Essen R, Falsen E: Characterization
of some strains from human clinical sources which resemble “Leptotrichia
sanguinegens“: description of Sneathia sanguinegens sp. nov., gen. nov. Syst Appl
Microbiol 2001, 24(3):358-361
366.
Shukla SK, Meier PR, Mitchell PD, Frank DN, Reed KD: Leptotrichia
amnionii sp. nov., a novel bacterium isolated from the amniotic fluid of a woman after
intrauterine fetal demise. J Clin Microbiol 2002, 40(9):3346-3349.
367.
Marrazzo JM, Martin DH, Watts DH, Schulte J, Sobel JD, Hillier SL, Deal
C,Fredricks DN. Bacterial vaginosis: identifying research gaps proceedings of a
workshop sponsored by DHHS/NIH/NIAID. Sex Transm Dis. 2010 Dec;37(12):73244
368.
Fredricks, D.N. et al., Changes in vaginal bacterial concen¬trations with
metronidazole therapy for bacterial vaginosis as assessed by quantitative PCR,
J.Clin.Microbiol., 2009, January 14. (Epub ahead of print).
369.
Fredricks, D.N. et al., Targeted PCR for detection of vagi¬nal bacteria
associated with bacterial vaginosis, J.Clin.Microbiol., 45, 3270, 2007.
370.
Tamrakar, R. et al., Association between Lactobacillus spe¬cies and bacterial
vaginosis-related bacteria, and bacterial vaginosis scores in pregnant Japanese women,
BMC Infect.Dis., 7, 128, 2007.
371.
Fredricks, D.N., Fiedler, T.L., and Marazzo, J.M., Molecular identification of
bacteria associated with bacterial vaginosis, N.Engl.J.Med., 353, 1899, 2005.
372.
Fredricks D.N., and Marrazzo, J.M., Molceular methodology in determining
vaginal flora in health and disease: Its time has come, Curr.Infect.Dis.Rep., 7, 463,
2005. 76. Thilesen, C.M. et al., Leptotrichia amnionii, an emerging pathogen of the
female urogenital tract, J.Clin.Microbiol., 45, 2347, 2007.
373.
Srinivasan S, Fredricks DN: The human vaginal bacterial biota and bacterial
vaginosis. Interdiscip Perspect Infect Dis 2008, 2008:750479.
374.
Haggerty CL, Totten PA, Ferris M, Martin DH, Hoferka S, Astete SG,
Ondondo R, Norori J, Ness RB: Clinical characteristics of bacterial vaginosis among
women testing positive for fastidious bacteria. Sex Transm Infect 2009, 85(4):242248.
375.
Ling Z, Kong J, Liu F, Zhu H, Chen X, Wang Y, Li L, Nelson KE, Xia Y,
Xiang C: Molecular analysis of the diversity of vaginal microbiota
376.
Boennelycke, M. et al., Leptotrichia amnionii found in septic abortion in
Denmark, Scand.J.Infect.Dis., 39, 382, 2007.
344
377.
Domann, E. et al., Culture-independent identification of patho¬genic bacteria
and polymicrobial infections in the genitouri¬nary tract of renal transplant recipients,
J.Clin.Microbiol., 41, 5500, 2003,
378.
DiGiulio, D.B. et al., Microbial prevalence, diversity and abun¬dance in
amniotic fluid during preterm labor: A molecular and culture-based investigation,
PLoS ONE, 3, e 3056, 2008.80.
379.
Han, Y.W. et al., Uncultivable bacteria as etiologic agents of intra-amniotic
inflammation leading to preterm birth, J.Clin.Microbiol., 47, 38, 2009.
380.
Slover CM, Danzinger L: Lactobacillus : a review. Clin Microbiol Newsl
2008,30: 23– 27.
381.
Donders GG, Vereecken A, Bosmans E, et al. Definition of a type of abnormal
vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. BJOG 2002;
109: 34-43
382.
Martínez-Martínez, W., Calderón-Badía, B., & Cruz-Lage, L. Comparison of
diagnostic methods for bacterial vaginosis. African Journal of Microbiology Research.
2014. 8(12), 1360-1367
383.
Ramsey PS, Lyon MD, Goepfert AR, Cliver S, Schwebke J, Andrews WW,
Goldenberg RL, Hauth JC. Use of vaginal polymorphonuclear to epithelial cell ratios
for the prediction of preterm birth. Obstet Gynecol. 2005 Jan;105(1):139-44
384.
Berntsson M, Tunbäck P. Clinical and microscopic signs of cervicitis and
urethritis: correlation with Chlamydia trachomatis infection in female STI patients.
Acta Derm Venereol. 2013 Mar 27;93(2):230-3.
385.
Berntsson M, Tunbäck P. Clinical and microscopic signs of cervicitis and
urethritis: correlation with Chlamydia trachomatis infection in female STI patients.
Acta Derm Venereol. 2013 Mar 27;93(2):230-3.
386.
Cauci S, Guaschino S, De Aloysio D, Driussi S, De Santo D, Penacchioni P,
Quadrifoglio F Interrelationships of interleukin-8 with interleukin-1beta and
neutrophils in vaginal fluid of healthy and bacterial vaginosis positive women. Mol
Hum Reprod. 2003 Jan;9(1):53-8.
387.
Culhane JF, Desanto D, Goldenberg RL, McCollum KF, King F, Guaschino S.
Variation in Nugent score and leukocyte count in fluid collected from different vaginal
sites. Obstet Gynecol. 2005 Jan;105(1):120-3.
388.
Datcu R, Gesink D, Mulvad G, Montgomery-Andersen R, Rink E, Koch A,
Ahrens P, Jensen JS. Vaginal microbiome in women from Greenland assessed by
microscopy and quantitative PCR. BMC Infect Dis. 2013 Oct 16;13(1):480.
389.
Eschenbach DA, Thwin SS, Patton DL, Hooton TM, Stapleton AE, Agnew K,
Winter C, Meier A, Stamm WE. Influence of the normal menstrual cycle on vaginal
tissue, discharge, and microflora. Clin Infect Dis. 2000 Jun;30(6):901-7.
390.
Fidel PL Jr, Barousse M, Espinosa T, Ficarra M, Sturtevant J, Martin DH,
Quayle AJ, Dunlap K. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new
hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun.
2004 May;72(5):2939-46.
391.
Geisler WM, Yu S, Venglarik M, Schwebke JR. Vaginal leucocyte counts in
women with bacterial vaginosis: relation to vaginal and cervical infections. Sex
Transm Infect. 2004 Oct;80(5):401-5.
392.
Hitti J, Hillier SL, Agnew KJ, Krohn MA, Reisner DP, Eschenbach DA.
Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstet Gynecol. 2001
Feb;97(2):211-9.
345
393.
Holst E, Goffeng AR, Andersch B. Bacterial vaginosis and vaginal
microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy
outcome. J Clin Microbiol. 1994 Jan;32(1):176-86
394.
Lazenby GB, Soper DE, Nolte FS. Correlation of leukorrhea and Trichomonas
vaginalis infection. J Clin microbiol. 2013 Jul;51(7):2323-7.
395.
Matsubara S, Yamada T, Minakami H, Sato I. Stimulated polymorphonuclear
leukocytes in vaginal secretions from patients with preterm labor. Gynecol Obstet
Invest 1998; 45:35– 40.
396.
Moore SG, Miller WC, Hoffman IF, Fox KK, Owen-O'Dowd J, McPherson
JT, Privette A, Schmitz JL, Leone PA. Clinical utility of measuring white blood cells
on vaginal wet mount and endocervical gram stain for the prediction of chlamydial
and gonococcal infections. Sex Transm Dis. 2000 Oct;27(9):530-8.
397.
Peipert JF, Ness RB, Soper DE, Bass D. Association of lower genital tract
inflammation with objective evidence of endometritis. Infect Dis Obstet Gynecol.
2000;8(2):83-7
398.
Prakash M, Patterson S, Kapembwa MS. Macrophages are increased in
cervical epithelium of women with cervicitis. Sex Transm Infect. 2001 Oct;77(5):3669.
399.
Simhan HN, Bodnar LM. Prepregnancy body mass index, vaginal
inflammation, and the racial disparity in preterm birth. Am J Epidemiol. 2006 Mar
1;163(5):459-66.
400.
Simhan HN, Caritis SN, Krohn MA, Hillier SL. Elevated vaginal pH and
neutrophils are associated strongly with early spontaneous preterm birth. Am J Obstet
Gynecol. 2003 Oct;189(4):1150-4.
401.
Simhan HN, Caritis SN, Krohn MA, Hillier SL. The vaginal inflammatory
milieu and the risk of early premature preterm rupture of membranes. Am J Obstet
Gynecol. 2005 Jan;192(1):213-8.
402.
Steinhandler L, Peipert JF, Heber W, Montagno A, Cruickshank C.
Combination of bacterial vaginosis and leukorrhea as a predictor of cervical
chlamydial or gonococcal infection. Obstet Gynecol. 2002 99:603-7.
403.
Novikova N, Yassievich E, Mårdh PA. Microscopy of stained smears of
vaginal secretion in the diagnosis of recurrent vulvovaginal candidosis. Int J STD
AIDS. 2002 May;13(5):318-22.
404.
Yamada T, Matsubara S, Minakami H, Ohkuchi A, Hirat-suka M, Sato I.
Relation between viability of vaginal polymorphonuclear leukocytes and presence of
histologic chorioamnionitis. Acta Obstet Gynecol Scand 2000;79: 818 –23.
405.
Yamada T, Minakami H, Matsubara S, Kohmura Y, Aoya T, Sato I. Changes
in the number of polymorphonuclear leukocytes and concentrations of IL-8 and
granulocyte elastase in the vaginas of normal pregnant women. Am J Reprod Immunol
2002;47:98 –103.
406.
Yamada T, Minakami H, Matsubara S, Yatsuda T, Sato I. Changes in
polymorphonuclear leukocytes in the vagina of patients with preterm labor. Gynecol
Obstet Invest 1998;45:32– 4.
407.
Yano J, Kolls JK, Happel KI, Wormley F, Wozniak KL, Fidel PL Jr. The acute
n eutrophil response mediated by S100 alarmins during vaginal Candida infections is
independent of the Th17-pathway. PLoS One. 2012;7(9):e46311.
408.
Yudin MH, Hillier SL, Wiesenfeld HC, Krohn MA, Amortegui AA, Sweet RL.
Vaginal polymorphonuclear leukocytes and bacterial vaginosis as markers for
histologic endometritis among women without symptoms of pelvic inflammatory
disease. Am J Obstet Gynecol. 2003 Feb;188(2):318-23.
346
409.
Srinivasan U, Ponnaluri S, Villareal L, Gillespie B, Wen A, Miles A, Bucholz
B, Marrs CF, Iyer RK, Misra D, Foxman B. Gram stains: a resource for retrospective
analysis of bacterial pathogens in clinical studies. PLoS One. 2012;7(10):e42898. doi:
10.1371/journal.pone.0042898. Epub 2012 Oct 11
410.
Santiago GL, Tency I, Verstraelen H, [[]elst R, Trog M, Temmerman M,
Vancoillie L, Decat E, Cools P, Vaneechoutte M. Longitudinal qPCR study of the
dynamics of L. crispatus, L. iners, A. vaginae, (sialidase positive) G. vaginalis, and P.
bivia in the vagina. PLoS One. 2012;7(9):e45281. doi: 0.1371/journal.pone. 5281.
Epub 2012 Sep 21.
411.
Santiago GL, Cools P, Verstraelen H, Trog M, Missine G, El Aila N, Verhelst
R, Tency I, Claeys G, Temmerman M, Vaneechoutte M. Longitudinal study of the
dynamics of vaginal microflora during two consecutive menstrual cycles. PLoS One.
2011;6(11):e28180
412.
Hamilton, R.D., and Zahler, S.A., A study of Leptotrichia buccalis,
J.Bacteriol., 73, 386, 1957.
413.
Eribe, E.R.K., and Olsen, I., Leptotrichia species in human infections,
Anaerobe, 14, 131, 2008
414.
Harwich MD Jr, Serrano MG, Fettweis JM, Alves JM, Reimers MA; Vaginal
Microbiome Consortium (additional members), Buck GA, Jefferson KK. Genomic
sequence analysis and characterization of Sneathia amnii sp. nov. BMC Genomics.
2012;13 Suppl 8:S4. doi: 10.1186/1471-2164-13-S8-S4. Epub 2012 Dec 17
415.
Verstraelen H, Verhelst R, Roelens K, Claeys G, Weyers S, De Backer E,
Vaneechoutte M, Temmerman M. Modified classification of Gram-stained vaginal
smears to predict spontaneous preterm birth: a prospective cohort study. Am J Obstet
Gynecol. 2007 Jun;196(6):528.e1-6.
416.
Sobel JD, Subramanian C, Foxman B, Fairfax M, Gygax SE. Mixed vaginitismore than coinfection and with therapeutic implications. Curr Infect Dis Rep. 2013
Apr;15(2):104-8. doi: 10.1007/s11908-013-0325-5
417.
Donders GG, Van Calsteren K, Bellen G, Reybrouck R, Van den Bosch T,
Riphagen I, Van Lierde S. Predictive value for preterm birth of abnormal vaginal
flora, bacterial vaginosis and aerobic vaginitis during the first trimester of pregnancy.
BJOG. 2009 Sep;116(10):1315-24. doi: 10.1111/j.1471-0528.2009.02237.x. Epub
2009 Jun 17. PubMed PMID: 19538417. 3:
418.
Fan AP, Xue FX. Clinical characteristics of aerobic vaginitis and its mixed
infections.. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2010 Dec;45(12):904-908. Chinese.
PubMed PMID: 21211421.
419.
M. G. Netea, G. D. Brown, B. J. Kullberg, and N. A. Gow, “An
integratedmodel of the recognition of Candida albicans by the innate immune system,”
Nature Reviews Microbiology, vol. 6, no. 1, pp. 67–78, 2008.
420.
M. Schaller, U. Boeld, S. Oberbauer, G. Hamm, B. Hube, and H. C. Korting,
“Polymorphonuclear leukocytes (PMNs) induce protective Th1-type cytokine
epithelial responses in an Clinical and Developmental Immunology 9 in vitro model of
oral candidosis,” Microbiology, vol. 150, no. 9, pp. 2807–2813, 2004.
421.
C. C. Villar, H. Kashleva, A. P. Mitchell, and A. Dongari-Bagtzoglou,
“Invasive phenotype of Candida albicans affects the host proinflammatory response to
infection,” Infection and Immunity, vol. 73, no. 8, pp. 4588–4595, 2005.
422.
P. L. Fidel Jr., “Distinct protective host defenses against oral and vaginal
candidiasis,” Medical Mycology, vol. 40, no. 4, pp. 359–375, 2002
423.
Bhavsar AP, Guttman JA, Finlay BB Manipulation of host-cell pathways by
bacterial pathogens. Nature. 2007;449:827-34.
347
424.
Finlay BB, McFadden G. Anti-immunology: evasion of the host immune
system by bacterial and viral pathogens. Cell. 2006 Feb 24;124(4):767-82. Hornef
MW, Wick MJ, Rhen M, Normark S. Bacterial strategies for overcoming host innate
and adaptive immune responses. Nat Immunol. 2002 Nov;3(11):1033-40.
425.
Brodsky IE, Medzhitov R. Targeting of immune signalling networks by
bacterial pathogens. Nat Cell Biol. 2009 May;11(5):521-6. doi: 10.1038/ncb0509521.Finlay BB, Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited.
Microbiol Mol Biol Rev. 1997 Jun;61(2):136-69
426.
Méresse S, Steele-Mortimer O, Moreno E, Desjardins M, Finlay B, Gorvel JP
Controlling the maturation of pathogen-containing vacuoles: a matter of life and death.
Nat Cell Biol. 1999;1:E183-8.
427.
Cossart P, Roy CR. Manipulation of host membrane machinery by bacterial
pathogens. Curr Opin Cell Biol. 2010 Aug;22(4):547-54. . 24
428.
Müller MP, Peters H, Blümer J, Blankenfeldt W, Goody RS, Itzen A The
Legionella effector protein DrrA AMPylates the membrane traffic regulator Rab1b.
Science. 2010;329:946-9.
429.
Salinas-Carmona MC, Zúñiga JM, Pérez-Rivera LI, Segoviano-Ramírez JC,
Vázquez-Marmolejo AV Nocardia brasiliensis Modulates IFN-gamma, IL-10, and IL12 cytokine production by macrophages from BALB/c Mice. J Interferon Cytokine
Res. 2009;29:263-71.
430.
Joshi SG, Francis CW, Silverman DJ, Sahni SK Nuclear factor kappa B
protects against host cell apoptosis during Rickettsia rickettsii infection by inhibiting
activation of apical and effector caspases and maintaining mitochondrial integrity.
Infect Immun. 2003;71:4127-36.22 .
431.
Häcker G, Kirschnek S, Fischer SF Apoptosis in infectious disease: how
bacteria interfere with the apoptotic apparatus. Med Microbiol Immunol. 2006;195:119.
432.
Chaudry AN, Travers PJ, Yuenger J, Colletta L, Evans P, Zenilman JM,
Tummon A. Analysis of vaginal acetic acid in patients undergoing treatment for
bacterial vaginosis. J Clin Microbiol. 2004 Nov;42(11):5170-5x
433.
Tedelind S, Westberg F, Kjerrulf M, Vidal A. Anti-inflammatory properties of
the short-chain fatty acids acetate and propionate: a study with relevance to
inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2007; 13:2826–2832. [PubMed:
17569118]19.
434.
Segain JP, Raingeard de la Bletiere D, Bourreille A, Leray V, Gervois N,
Rosales C, Ferrier L, Bonnet C, Blottiere HM, Galmiche JP. Butyrate inhibits
inflammatory responses through NFkappaB inhibition: implications for Crohn's
disease. Gut. 2000; 47:397–403.
435.
Luhrs H, Gerke T, Muller JG, Melcher R, Schauber J, Boxberge F, Scheppach
W, Menzel T. Butyrate inhibits NF-kappaB activation in lamina propria macrophages
of patients with ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol. 2002; 37:458–466. [PubMed:
11989838)
436.
Aoyama M, Kotani J, Usami M. Butyrate and propionate induced activated or
non-activated neutrophil apoptosis via HDAC inhibitor activity but without activating
GPR-41/GPR-43 pathways. Nutrition. 2010 Jun;26(6):653-61
437.
Kurita-Ochiai T, Fukushima K, Ochiai K. Lipopolysaccharide stimulates
butyric acid-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Infect
Immun. 1999 Jan;67(1):22-9. 2: Kurita-Ochiai T, Amano S, Fukushima K, Ochiai K.
Cellular events involved in butyric acid-induced T cell apoptosis. J Immunol. 2003
Oct 1;171(7):3576-84.34
348
438.
Cox MA, Jackson J, Stanton M, Rojas-Triana A, Bober L, Laverty M, Yang X,
Zhu F, Liu J, Wang S, Monsma F, Vassileva G, Maguire M, Gustafson E, Bayne M,
Chou CC, Lundell D, Jenh CH. Short-chain fatty acids act as antiinflammatory
mediators by regulating prostaglandin E(2) and cytokines. World J Gastroenterol.
2009; 15:5549–5557
439.
Dolgushin II, Andreeva IuS, Plekhanova EV. Interaction of neutrophils and
different bacterial agents. Zhurnal Mikrobiologii Epidemiologii i
Immunobiologii2008;5:103–5
440.
Beghini J, Giraldo PC, Riboldi R, Amaral RL, Eleutério J Jr, Witkin SS,
Guimarães F. Altered CD16 expression on vaginal neutrophils from women with
vaginitis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2013 Mar;167(1):96-9
441.
Dransfield I, Buckle AM, Savill JS, McDowall A, Haslett C, Hogg N.
Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16 (Fc gamma RIII)
expression. Journal of Immunology 1994;15:1254–63.
442.
Nusbaum P, Laine C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early
membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing
and vesicle release, CD43 and CD16 down-regulation and phosphatidylserine
externalization. Biochemical Society Transactions 2004;32:477–9.
443.
Song HO, Lim YS, Moon SJ, Ahn MH, Ryu JS. Delayed human neutrophil
apoptosis by Trichomonas vaginalis lysate. Korean Journal of Parasitology 2010;48:1–
7
444.
Hillier, S. L., M. A. Krohn, L. K. Rabe, S. J. Klebanoff, and D. A. Eschenbach.
1993. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis
in pregnant women. Clin. Infect. Dis. 16(Suppl. 4):S273–S281.
445.
Krohn, M. A., S. L. Hillier, and D. A. Eschenbach. 1989. Comparison methods
for diagnosing bacterial vaginosis among pregnant women. J. Clin. Microbiol.
27:1266–1271.
446.
Rumyantseva TA, Bellen G, Romanuk TN, Shipulina OI, Guschin AE,
Shipulin GA, Donders GG. Utility of Microscopic Techniques and Quantitative Realtime Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis of Vaginal Microflora Alterations.
J Low Genit Tract Dis. 2014 Jul 11.
447.
Datcu R. Characterization of the vaginal microflora in health and disease. Dan
Med J. 2014 Apr;61(4):B4830. PubMed PMID: 24814599.
448.
Mengistie Z, Woldeamanuel Y, Asrat D, Yigeremu M. Comparison of clinical
and gram stain diagnosis methods of bacterial vaginosis among pregnant women in
ethiopia. J Clin Diagn Res. 2013 Dec;7(12):2701-3.
doi:10.7860/JCDR/2013/5872.3736. Epub 2013 Dec 15.
449.
Hemalatha R, Ramalaxmi BA, Swetha E, Balakrishna N, Mastromarino P.
Evaluation of vaginal pH for detection of bacterial vaginosis. Indian J Med Res. 2013
Sep;138(3):354-9.
450.
Chawla R, Bhalla P, Chadha S, Grover S, Garg S. Comparison of Hay's criteria
with Nugent's scoring system for diagnosis of bacterial vaginosis. Biomed Res Int.
2013;2013:365194. doi: 10.1155/2013/365194. Epub 2013 Jun 13.
451.
Mittal V, Jain A, Pradeep Y. Development of modified diagnostic criteria for
bacterial vaginosis at peripheral health centres in developing countries. J Infect Dev
Ctries. 2012 May 14;6(5):373-7.
452.
Campos AA, Leite AP, Lisboa CV, Andrade CC, Bezerra AF, Mattar R, Souza
Ed. Comparative study between the pH test and of the KOH versus Nugent score for
diagnosis of bacterial vaginosis in pregnant women]. Rev Bras Ginecol Obstet. 2012
May;34(5):209-14.
349
453.
Gratacos, E., F. Figueras, M. Barranco, R. Ros, A. Andreu, P. L. Alonso, and
V. Cararach. 1999. Prevalence of bacterial vaginosis and correlation of clinical to
Gram stain diagnostic criteria in low risk pregnant women. Eur. J. Epidemiol. 15:913–
916. 15).
454.
Tam, M. T., M. Yungbluth, and T. Myles. 1998. Gram stain method shows
better sensitivity than clinical criteria for detection of bacterial vaginosis in
surveillance of pregnant low-income women in a clinical setting. Infect. Dis. Obstet.
Gynecol. 6:273–275.
455.
Sha BE, Chen HY, Wang QJ, Zariffard MR, Cohen MH, Spear GT. Utility of
Amsel criteria, Nugent score, and quantitative PCR for Gardnerella vaginalis,
Mycoplasma hominis, and Lactobacillus spp. for diagnosis of bacterial vaginosis in
human immunodeficiency virus-infected women. J Clin Microbiol. 2005
Sep;43(9):4607-12.
456.
De Backer E, Verhelst R, Verstraelen H, Alqumber MA, Burton JP, et al.
(2007) Quantitative determination by real-time PCR of four vaginal Lactobacillus
species, Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae indicates an inverse
relationship between L. gasseri and L. iners. BMC Microbiol 7: 115
457.
Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Delanghe J, VanSimaey
L, De Ganck C, Temmerman M, Vaneechoutte M: Cloning of16S rRNA genes
amplified from normal and disturbed vagi-nal microflora suggests a strong association
between Atopo-bium vaginae, Gardnerella vaginalis and bacterial vaginosis. BMC
Microbiol 2004, 4:16.
458.
Ferris MJ, Masztal A, Martin DH: Use of species-directed 16S rRNA gene
PCR primers for detection of Atopobium vaginae in patients with bacterial vaginosis.
J Clin Microbiol 2004, 42(12):5892-5894.
459.
Thies FL, Konig W, Konig B: Rapid characterization of the normal and
disturbed vaginal microbiota by application of 16S rRNA gene terminal RFLP
fingerprinting. J Med Microbiol 2007, 56(Pt 6):755-761.
460.
Burton JP, Chilcott CN, Al-Qumber M, Brooks HJ, Wilson D, Tagg JR,
Devenish C: A preliminary survey of Atopobium vaginae in women attending the
Dunedin gynaecology out-patients clinic: is the contribution of the hard-to-culture
microbiota overlooked in gynaecological disorders?
461.
Aust N Z J Obstet Gynaecol 2005, 45(5):450-452.] Bradshaw CS, Tabrizi SN,
Fairley CK, Morton AN, Rudland E, Garland SM. The association of Atopobium
vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral
metronidazole therapy. J Infect Dis. 2006 Sep 15;194(6):828-36
462.
Brotman RM, Ravel J, Cone RA, Zenilman JM (2010) Rapid fluctuation of the
vaginal microbiota measured by Gram stain analysis. Sex Transm Infect 86(4):297–
302.
463.
Hay PE, Ugwumadu A, Chowns J (1997) Sex, thrush and bacterial vaginosis.
Int J STD AIDS 8(10): 603–608.
464.
Keane FE, Ison CA, Taylor-Robinson D (1997) A longitudinal study of the
vaginal flora over a menstrual cycle. Int J STD AIDS 8(8): 489–494.
465.
Schwebke JR, Richey CM, Weiss HL (1999) Correlation of behaviors with
microbiological changes in vaginal flora. J Infect Dis 180(5): 1632–1636.
466.
Eschenbach DA, Thwin SS, Patton DL, Hooton TM, Stapleton AE, et al.
(2000) Influence of the normal menstrual cycle on vaginal tissue, discharge, and
microflora. Clin Infect Dis 30(6): 901–907.
467.
Brotman RM, Shardell MD, Gajer P, Fadrosh D, Chang K, Silver MI, Viscidi
RP, Burke AE, Ravel J, Gravitt PE. Association between the vaginal microbiota,
350
menopause status, and signs of vulvovaginal atrophy. Menopause. 2014; May;21(5):
450-8. doi: 10.1097/GME.0b013e3182a4690b0.
468.
Priestley CJ, Jones BM, Dhar J, Goodwin L (1997) What is normal vaginal
flora? Genitourin Med 73(1): 23–28.
469.
Gajer P, Brotman RM, Bai G, Sakamoto J, Schu¨ tte UM, et al. 2012 Temporal
dynamics of the human vaginal microbiota. Sci Transl Med 4(132): 132ra52.
470.
Srinivasan S, Liu C, Mitchell CM, Fiedler TL, Thomas KK, et al. (2010)
Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial
vaginosis. PLoS One 5(4): e10197
471.
Verstraelen H, Verhelst R, Claeys G, De Backer E, Temmerman M, et al.
(2009) Longitudinal analysis of the vaginal microflora in pregnancy suggests that
L.crispatus promotes the stability of the normal vaginal microflora and that L. gasseri
and/or L. iners are more conducive to the occurrence of abnormal vaginal microflora.
BMC Microbiol 9: 116.
472.
Zozaya-Hinchliffe M, Lillis R, Martin DH, Ferris MJ (2010) Quantitative PCR
assessments of bacterial species in women with and without bacterial vaginosis. J Clin
Microbiol 48(5): 1812–1819
473.
Forsum U, Jakobsson T, Larsson PG, Schmidt H, Beverly A, Bjørnerem A,
Carlsson B, Csango P, Donders G, Hay P, Ison C, Keane F, McDonald H, Moi H,
Platz-Christensen JJ, Schwebke J. An international study of the interobserver variation
between interpretations of vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS. 2002
Nov;110(11):811-8
474.
Ling Z, Kong J, Liu F, Zhu H, Chen X, Wang Y, Li L, Nelson KE, Xia Y,
Xiang C. Molecular analysis of the diversity of vaginal microbiota associated with
bacterial vaginosis. BMC Genomics. 2010 Sep 7;11:488.
475.
Shipitsyna E, Roos A, Datcu R, Hallén A, Fredlund H, Jensen JS, Engstrand L,
Unemo M. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible? PLoS
One. 2013 Apr 9;8(4):e60670
476.
Witkin SS, Ledger WJ. Complexities of the uniquely human vagina. Sci Transl
Med. 2012 May 2;4(132):132fs11
477.
Boskey ER, Cone RA, Whaley KJ, Moench TR. Origins of vaginal acidity:
high D/L lactate ratio is consistent with bacteria being the primary source. Hum
Reprod 2001;16:1809-13
478.
O'Hanlon DE, Moench TR, Cone RA. Vaginal pH and microbicidal lactic acid
when lactobacilli dominate the microbiota. PLoS One. 2013 Nov 6;8(11):e80074.
479.
Bai G, Gajer P, Nandy M, Ma B, Yang H, Sakamoto J, Blanchard MH, Ravel
J, Brotman RM. Comparison of storage conditions for human vaginal microbiome
studies. PLoS One. 2012;7(5):e36934. doi: 10.1371/journal.pone.0036934. Epub 2012
May 24
480.
O'Hanlon DE, Moench TR, Cone RA. In vaginal fluid, bacteria associated with
bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide.
BMC Infectious Diseases. 2011; 11:200. [PubMed: 21771337] 2. Linhares IM,
Summers PR, Larsen B, Giraldo PC, Witkin SS. Contemporary perspectives on
vaginal pH and lactobacilli. Am J Obstet Gynecol. 2010; 203:1.e1–1.e5
481.
Boskey ER, Telsch KM, Whaley KJ, Moench TR, Cone RA. Acid production
by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification.
Infect Immun. 1999 Oct;67(10):5170-5
351
482.
Marshall W, Tanner J. Puberty. In: Davis J, Dobbing J, editors. Scientific
Foundations of Paediatrics. London: Heinemann; 1981
483.
Farage MA, Maibach H. Lifetime changes in the vulva and vagina. Arch
Gynecol Obstet. 2006;273:195–202
484.
Larsen B, Monif GR. Understanding the bacterial flora of the female genital
tract. Clin Infect Dis. 2001;32:e69–77
485.
Shafer MA, Sweet RL, Ohm-Smith MJ, Shalwitz J, Beck A, Schachter J.
Microbiology of the lower genital tract in postmenarchal adolescent girls: differences
by sexual activity, contraception, and presence of nonspecific vaginitis. J Pediatr.
1985;107:974–81
486.
Galhardo CL, Soares JMJ, Simões RS, Haidar MA, Rodrigues de Lima G,
Baracat EC. Estrogen effects on the vaginal ph, flora and cytology in late
postmenopause after a long period without hormone therapy. Clin Exp Obstet
Gynecol. 2006;33:85–9. 48.
487.
Gupta S, Kumar N, Singhal N, Kaur R, Manektala U. Vaginal microflora in
postmenopausal women on hormone replacement therapy. Indian J Pathol Microbiol.
2006;49:457–61.3
488.
Devillard E, Burton JP, Hammond J, Lam D, Reid G. Novel insight into the
vaginal microflora in postmenopausal women under hormone replacement therapy as
analyzed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Eur J Obstet Gynecol
Reprod Biol. 2004;117:76–81. 47.
489.
Heinemann C, Reid G. Vaginal microbial diversity among postmenopausal
women with and without hormone replacement therapy. Can J
Microbiol.2005;51:777–81
490.
Witkin SS. Contemporary perspectives on vaginal pH and lactobacilli. Am J
Obstet Gynecol. 2011 Feb;204(2):120.e1-5.
491.
Menard J.P, Mazouni C, Fenollar F, Raoult D, Boubli L, Bretelle F.
Diagnostic accuracy of quantitative real-time PCR assay versus clinical and Gram
stain identification of bacterial vaginosis. European Journal of Clinical Microbiology
& Infectious Diseases : Official Publication of the European Society of Clinical
Microbiology, 2010; 29(12), 1547–52
492.
Pastore LM, Thorp JM Jr, Royce RA, Savitz DA, Jackson TP. Risk score for
antenatal bacterial vaginosis: BV PIN points. J Perinatol. 2002 Mar;22(2):125-32.
PubMed PMID: 11896517.
493.
Zodzika J, Rezeberga D, Jermakova I, Vasina O, Vedmedovska N, Donders G.
Factors related to elevated vaginal pH in the first trimester of pregnancy. Acta Obstet
Gynecol Scand. 2011 Jan;90(1):41-6. doi: 10.1111/j.1600-0412.2010.01011.x. Epub
2010 Nov 26. PubMed PMID: 21275914
494.
Wiesenfeld HC, Macio I. The infrequent use of office-based diagnostic tests
for vaginitis. Am J Obstet Gynecol. 1999 Jul;181(1):39-41. Wiesenfeld HC, Macio I.
A growing concern: inability to diagnose vulvovaginal infections correctly. Obstet
Gynecol. 2004 Jul;104(1):199
495.
.Nenadić DB, Pavlović MD. Value of bacterial culture of vaginal swabs in
diagnosis of vaginal infections. Vojnosanit Pregl. Accepted for press
496.
Hammerschlag MR, Alpert S, Rosner I, et al. Microbiology of the vagina in
children: normal and potentially pathogenic organisms. Pediatrics. 1978;62:57–62.
Hammerschlag MR, Alpert S, Onderdonk AB, et al. Anaerobic microflora of the
vagina in children. Am J Obstet Gynecol. 1978;131:853–6
497.
Larsen B, Monif GR. Understanding the bacterial flora of the female genital
tract. Clin Infect Dis. 2001;32:e69–77.
352
498.
Bach EA, Aguet M and Schreiber RD. The IFNgamma receptor: A paradigm
for cytokine receptor signaling. Ann Rev Immunol 1997; 15:563-91. full B-ćelije
takođe produkuju IFN-gama.
499.
Chang HC, et al. The transcription factor PU. 1 is required for the development
of IL-9-producing T cells and allergic inflammation. Nat Immunol. 2010; 11:527–534.
500.
Dardalhon V, et al. IL-4 inhibits TGF-beta-induced Foxp3 + T cells and,
together with TGF-beta,generates IL-9 + IL-10 + Foxp3(-) effector T cells. Nat
Immunol. 2008; 9:1347–1355.
501.
Staudt V, et al. Interferon-regulatory factor 4 is essential for the developmental
program of T helper 9 cells. Immunity. 2010; 33:192–202.
502.
Veldhoen M, et al. Transforming growth factor-beta ‘reprograms’ the
differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset. Nat
Immunol. 2008; 9:1341–1346.
503.
Kaplan MH, et al. STAT3-dependent IL-21 production from T helper cells
regulates hematopoietic progenitor cell homeostasis. Blood. 2011; 117:6198–6201. 6.
504.
Goswami R, Kaplan MH. Gcn5 is required for PU. 1-dependent Interleukin-9
(IL-9) induction in Th9 cells. J Immunol. 2012; 189:3026–3033.
505.
Tan C, et al. Antigen-specific Th9 cells exhibit uniqueness in their kinetics of
cytokine production and short retention at the inflammatory site. J Immunol. 2010;
185:6795–6801.
506.
Goswami R, Kaplan MH. A brief history of IL-9. J Immunol. 2011; 186:3283–
3288.
507.
Li S, Armstrong CM, Bertin N, Ge H, Milstein S, Boxem M et all. Map of the
interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 2004 Jan 23;303(5657):5403.
508.
Vidal M, Cusick ME, Barabási AL. Interactome networks and human disease.
Cell. 2011 Mar 18;144(6):986-98. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.016. Review.
509.
Missiuro PV, Liu K, Zou L, Ross BC, Zhao G, Liu JS, Ge H. Information flow
analysis of interactome networks. PLoS Comput Biol. 2009 Apr;5(4):e1000350. doi:
10.1371/journal.pcbi.1000350. Epub 2009 Apr 10.
510.
Cusick ME, Klitgord N, Vidal M, Hill DE. Interactome: gateway into systems
biology. Hum Mol Genet. 2005 Oct 15;14 Spec No. 2:R171-81. Epub 2005 Sep 14.
Review.
511.
Dudley DJ. Immunoendocrinology of preterm labor: The link between
corticotropin-releasing hormone and inflammation. Am J Obstet Gynecol
1999;180:S251-6. full
512.
Korebrits C, Ramirez MM, Watson L, Brinkman E, Bocking AD, Challis JR.
1998 Maternal corticotropin-releasing hormone is increased with impending
pretermbirth. J Clin Endocrinol Metab. 1998 83:1585-1591. full
513.
Copper RL, Goldenberg RL, Das A, Elder N, Swain M, Norman G, et al. The
preterm prediction study: maternal stress is associated with spontaneous preterm birth
at less than 35 weeks' gestation. Am J Obstet Gynecol 1996;175:1286-92
514.
Dudley DJ. Immunoendocrinology of preterm labor: The link between
corticotropin-releasing hormone and inflammation. Am J Obstet Gynecol
1999;180:S251-6
515.
Lockwood CJ. 1999 Stress-associated preterm delivery: the role of
corticotropin-releasing hormone. Am J Obstet Gynecol. 180:264S-266S
516.
Korebrits C, Ramirez MM, Watson L, Brinkman E, Bocking AD, Challis JR.
Maternal corticotropin-releasing hormone is increased with impending preterm birth. J
Clin Endocrinol Metab 1998;83:1585-91.
353
517.
McGregor JA, Jackson GM, Lachelin G. Salivary estriol as risk assessment for
preterm labor: a prospective trial. Am J Obstet Gynecol 1995;173:1337-42
518.
Copper RL, Goldenberg RL, Das A, Elder N, Swain M, Norman G, et al. The
preterm prediction study: maternal stress is associated with spontaneous preterm birth
at less than 35 weeks' gestation. Am J Obstet Gynecol 1996;175:1286-92.
519.
Lockwood CJ. 1999 Stress-associated preterm delivery: the role of
corticotropin-releasing hormone. Am J Obstet Gynecol. 180:264S-266S.
520.
Herrmann TS, Siega-Riz AM, Hobel CJ et al. Prolonged periods without food
intake during pregnancy increase risk for elevated maternal corticotropin-releasing
hormone concentrations. Am J Obstet Gynecol 2001;185:403-12
521.
Karteris E, Grammatopoulos D, Randeva H and Hillhouse EW. Signal
transduction characteristics of the Corticotropin-Releasing Hormone Receptors in the
Feto-Placental Unit. J Clin Endoc Metab 2000; 85: 1989-96
522.
Coleman MA, France JT, Schellenberg JC, Ananiew V, Townsend K, Keelan
JA, et al. Corticotropin-releasing hormone, corticotropin-releasing hormone-binding
protein, and activin A in maternal serum: prediction of preterm delivery and response
to glucocorticoids in women with symptoms of preterm labor. Am J Obstet Gynecol
2000;183:643-8.
523.
Jane Ellis M, Livesey JH, Inder WJ et al. Plasma corticotropin-releasing
hormone and unconjugated estriol in human pregnancy: Gestational patterns and
ability to predict preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 2002;186:94-9
524.
McLean M, Bisits A, Davies J, Walters W, Hackshaw A, de Voss K, et al.
Predicting risk of preterm delivery by second-trimester measurement of maternal
plasma corticotropin-releasing hormone and alpha-fetoprotein concentrations. Am J
Obstet Gynecol 1999;181:207-15.
525.
Inder WJ, Prickett TCR, Jane Eliss M et al. The Utility of Plasma CRH as a
Predictor of Preterm Delivery. J Clin Endocrinol Metab 86: 5706–5710, 200
526.
Christian LM, Glaser R, Porter K, Iams JD. Stress-induced inflammatory
responses in women: effects of race and pregnancy. Psychosom Med.
2013Sep;75(7):658-69. doi: 10.1097/PSY.0b013e31829bbc89. Epub 2013 Jul 19.
527.
Paul K, Boutain D, Manhart L, Hitti J. Racial disparity in bacterial vaginosis:
the role of socioeconomic status, psychosocial stress, and neighborhood
characteristics, and possible implications for preterm birth. Soc Sci Med. 2008
Sep;67(5):824-33. doi: 10.1016/j.socscimed.2008.05.017. Epub 2008 Jun 21.
528.
Culhane JF, Rauh V, McCollum KF, Elo IT, Hogan V. Exposure to chronic
stress and ethnic differences in rates of bacterial vaginosis among pregnant women.
Am J Obstet Gynecol. 2002 Nov;187(5):1272-6. PubMed PMID: 12439519.
529.
Culhane JF, Rauh V, McCollum KF, Hogan VK, Agnew K, Wadhwa PD.
Maternal stress is associated with bacterial vaginosis in human pregnancy. Matern
Child Health J. 2001 Jun;5(2):127-34. PubMed PMID: 11573838
530.
Shapiro GD, Fraser WD, Frasch MG, Séguin JR. Psychosocial stress in
pregnancy and preterm birth: associations and mechanisms. J Perinat Med. 2013
Nov;41(6):631-45. doi: 10.1515/jpm-2012-0295. Review. PubMed PMID: 24216160
531.
Opsjln SL, Wathen NC, Tingulstad S, Wiedswang G, Sundan A, Waage A,
Austgulen R. Tumor necrosis factor, interleukin-1, and interleukin-6 in normal human
pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1993; 169:397–404
532.
. Romero R, Brody DT, Oyarzun E, Mazor M, Wu YK, Hobbins JC, et al.
Infection and labor, III: interleukin-1: a signal for the onset of parturition. Am J Obstet
Gynecol 1989;160:1117-23
354
533.
Hirsch E, Muhle RA, Mussalli GM and Blanchard R Bacterially induced
preterm labor in the mouse does not require maternal interleukin-1 signaling. Am J
Obstet Gynecol 2002;186:523-30
534.
Romero, R, Mazor M, and Tartakovsky B. Systemic administration of
interleukin-1 induces preterm parturition in mice. Am J Obstet Gynecol 1991;165:
969-971.
535.
Hillier, SL, Witkin SS, Krohn MA, Watts DH, Kiviat NB, and Eschenbach
DA. The relationship of amniotic fluid cytokines and preterm delivery, amniotic fluid
infection, histologic chorioamnionitis, and chorioamnion infection. Obstet Gynecol
1993; 81: 941-8.
536.
Romero, R, Mazor M, Brandt F, Sepulveda W, Avila C, Cotton DB, and
Dinarello CA. Interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta in preterm and term human
parturition. Am J Reprod Immunol 1992; 27: 117-123
537.
Gibb W, Sun M. Cellular specificity of interleukin-1 beta stimulated
expression of type-2 PGHS in human amnion cell culture. Biol Reprod 1998;59:113942
538.
Hirsch E, Muhle RA, Mussalli GM and Blanchard R Bacterially induced
preterm labor in the mouse does not require maternal interleukin-1 signaling. Am J
Obstet Gynecol 2002;186:523-30
539.
Baggia S, Gravett MG, Witkin SS, Haluska GJ, Novy MJ. Interleukin-1β intraamniotic infusion induces tumor necrosis factor-α, prostaglandin production, and
preterm contractions in pregnant Rhesus monkeys. J Soc Gynecol Invest 1996;3:1216.
540.
Romero R, Mazor M, Tartakovsky B. Systemic administration of interleukin-1
induces preterm parturition in mice. Am J Obstet Gynecol 1991;165:969-71
541.
Bry K, Hallman M. Transforming growth factor-β2 prevents preterm delivery
induced by interleukin-1α and tumor necrosis factor α in the rabbit. Am J Obstet
Gynecol 1993;168:1318-22
542.
Coultrip LL, Lien JM, Gomez R, Kapernick P, Khoury A, Grossman JH. The
value of amniotic fluid interleukin-6 determination in patients with preterm labor and
intact membranes in the detection of microbial invasion of the amniotic cavity. Am J
Obstet Gynecol 1994;171:901-11.
543.
Hillier SL, Witkin SS, Krohn MA, Watts DH, Kiviat NB, Eschenbach DA. The
relationship of amniotic fluid cytokines and preterm delivery, amniotic fluid infection,
histological chorionamnionitis and chorioamniotic infection. Obstet Gynecol
1993;81:941-8.
544.
Romero R, Avila C, Santhanam U, et al. Amniotic fluid interleukin-6 in
preterm labor: association with infection. J Clin Invest 1990;85:1392-400.
545.
Greig PC, Ernest JM, Tcot L, Erikson M, Talley R. Amniotic fluid interleukin6 levels correlate with histologic chorioamnionitis and amniotic fluid cultures in
patient in premature labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol
1993;169:1035-44.
546.
Romero R, Yoon BH, Mazor M, et al. The diagnostic and prognostic value of
amniotic fluid white blood cell count, glucose, interleukin-6, and Gram stain in
patients with preterm labor and intact membranes. Am J Obstet Gynecol
1993;169:805-16.)
547.
Romero R, Yoon BH, Mazor M, Gomez R, Diamond MP, et al. The diagnostic
and prognostic value of amniotic fluid white blood cell count, glucose, interleukin-6,
and Gram stain in patients with preterm labor and intact membranes. Am J Obstet
Gynecol 1993;169:805-16.
355
548.
Romero R, Yoon BH, Kenney JS, Gomez R, Allison AC, et al. Amniotic fluid
interleukin-6 determinations are of diagnostic and prognostic value in preterm labor.
Am J Reprod Immunol 1993;30:167-83.
549.
Romero R, Yoon BH, Mazor M, Gomez R, Gonzales R, et al. A comparative
study of the diagnostic performance of amniotic fluid glucose, white blood cell count,
interleukin-6, and Gram stain in the detection of microbial invasion in patients with
preterm premature rupture of membranes. Am J Obstet Gynecol 1993;169:839-51
550.
Rizzo G, Capponi A, Rinaldo D, Tedeschi D, Arduini D, et al. Interleukin-6
concentrations in cervical secretions identify microbial invasion of the amniotic cavity
in patients with preterm labor and intact membranes. Am J Obstet Gynecol
1996;175:812-7.
551.
Dudley DJ, Trautman MS, Araneo B, Edwin SS, Mitchel MD. Decidual cell
biosynthesis of IL-6: regulation by inflammatory cytokines. J Clin Endocrinol Metab
1992;74:884-9.
552.
Romero R, Avila C, Santhanam U, et al. Amniotic fluid interleukin-6 in
preterm labor: association with infection. J Clin Invest 1990;85:1392-400.
553.
Dudley DJ, Trautman MS, Edwin SS, Lundin-Schiler S and Mitchel MD.
Biosynthesis of IL-6 by cultured human chorion laeve cells: regulation by citokines J
Clin Endocrinol Metab 1992;75:1081-6.
554.
Wenstrom KD, Andrews WW, Tamura T, DuBard MB, Johnston KE,
Hemstreet GP. Elevated amniotic fluid interleukin-6 levels AF genetic amniocentesis
predict subsequent pregnancy loss. Am J Obstet Gynecol 1996;175:830-3
555.
Romero R, Avila C, Santhanam U, et al. Amniotic fluid interleukin-6 in
preterm labor: association with infection. J Clin Invest 1990;85:1392-400
556.
557.
Yoon BH, Romero R, Kim CJ, Jun JK, Gomez R, Choi J-H, et al. Amniotic
fluid interleukin-6: a sensitive test for antenatal diagnosis of acute inflammatory
lesions of preterm placenta and prediction of perinatal mortality. Am J Obstet Gynecol
1995;172: 960-70.x
558.
Goepfert AR, Goldenberg, R. L, Andrews WW ez al. The preterm prediction
study: association between cervical interleukin-6 concentrations and spontaneus
preterm birth. Am J Obstet Gynecol 2001; 184:483-8
559.
Hemalatha R, Mastromarino P, Ramalaxmi BA, Balakrishna NV, Sesikeran B.
Effectiveness of vaginal tablets containing lactobacilli versus pH tablets on vaginal
health and inflammatory cytokines: a randomized, double-blind study. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2012 Nov;31(11):3097-105. doi:10.1007/s10096-012-1671-1.
Epub 2012 Jul 10
560.
Marconi C, Donders GG, Bellen G, Brown DR, Parada CM, Silva MG.
Sialidase activity in aerobic vaginitis is equal to levels during bacterial vaginosis. Eur
J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2013 Apr;167(2):205-9. doi:
10.1016/j.ejogrb.2012.12.003. Epub 2013 Feb 1.
561.
Cauci S, Culhane JF, Di Santolo M, McCollum K. Among pregnant women
with bacterial vaginosis, the hydrolytic enzymes sialidase and prolidase are positively
associated with interleukin-1beta. Am J Obstet Gynecol. 2008 Jan;198(1):132.e1-7.
562.
Mattsby-Baltzer I, Platz-Christensen JJ, Hosseini N, Rosén P. IL-1beta, IL-6,
TNFalpha, fetal fibronectin, and endotoxin in the lower genital tract of pregnant
women with bacterial vaginosis. Acta Obstet Gynecol Scand. 1998 Aug;77(7):701-6.
563.
Hedges SR, Barrientes F, Desmond RA, Schwebke JR. Local and systemic
cytokine levels in relation to changes in vaginal flora. J Infect Dis. 2006 Feb
15;193(4):556-62. Epub 2006 Jan 17. PubMed PMID: 16425135.
356
564.
Anton G, Rid J, Mylonas I, Friese K, Weissenbacher ER. Evidence of a TH1shift of local vaginal inflammatory response during bacterial vaginosis. Infection.
2008 Mar;36(2):147-52. doi: 10.1007/s15010-007-7152-2. Epub 2008 Mar 12.
PubMed PMID: 18330506.
565.
Nikolaitchouk N, Andersch B, Falsen E, Strombeck L, Mattsby-Baltzer I: The
lower genital tract microbiota in relation to cytokine-,SLPI- and endotoxin levels:
application of checkerboard DNA-DNA hybridization (CDH). APMIS 2008; 116:263–
277.
566.
Orfanelli T, Jayaram A, Doulaveris G, Forney LJ, Ledger WJ,Witkin SS:
Human epididymis protein 4 and secretory leukocyte protease inhibitor in vaginal
fluid: relation to vaginal components and bacterial composition. Reprod Sci 2014;
21:538–542.
567.
Sakai M, Ishiyama A, Tabata M, Sasaki Y, Yoneda S, Shiozaki A, Saito S:
Relationship between cervical mucus interleukin-8 concentrations and vaginal bacteria
in pregnancy. Am J Reprod Immunol 2004; 52:106–112.
568.
Kyongo JK, Jespers V, Goovaerts O, Michiels J, Menten J, Fichorova RN,
Crucitti T, Vanham G, Arien KK: Searching for lower female genital tract soluble and
cellular biomarkers: defining levels and predictors in a cohort of healthy Caucasian
women. PLoS ONE2012; 7:e43951
569.
Alvarez-Olmos MI, Barousse MM, Rajan L, Van Der Pol BJ, Fortenberry D,
Orr D, Fidel PL Jr: Vaginal lactobacilli in adolescents: presence and relationship to
local and systemic immunity, and to bacterial vaginosis. Sex Transm Dis 2004;
31:393–400.
570.
Xiao BB, Liao QP. [Analysis of diversity of vaginal microbiota in healthy
Chinese women by using DNA-fingerprinting]. Beijing Da Xue Xue Bao. 2012 Apr
18;44(2):281-7.
571.
Romero R, Hassan SS, Gajer P, Tarca AL, Fadrosh DW, Bieda J,
Chaemsaithong P, Miranda J, Chaiworapongsa T, Ravel J. The vaginal microbiota of
pregnant women who subsequently have spontaneous preterm labor and delivery and
those with a normal delivery at term. Microbiome. 2014 May 27;2:18.
doi:10.1186/2049-2618-2-18
572.
Lockwood CJ, Ghidini A, Wein R, Lapinsky R, Casal D, Berkowitz RL.
Increased interleukin-6 concentrations in cervical secretions are associated with
preterm delivery
573.
Rizzo G, CaPLoni A, Rinaldo D, Tedeschi D, Arduini D, Romanini C.
Interleukin-6 concentrations in cervical secretions identify microbial invasion of the
amniotic cavity in patients with preterm labor and intact membranes. Am J Obstet
Gynecol 1996;175:812-7
574.
Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular
mechanisms. J Pathol. 2010 May;221(1):3-12. doi: 10.1002/path.2697. Review
575.
Murrow L, Debnath J. Autophagy as a stress-response and qualitycontrolmechanism: implications for cell injury and human disease. Annu Rev Pathol.
2013 Jan 24;8:105-37. doi: 10.1146/annurev-pathol-020712-163918. Epub 2012 Oct
31.Review
576.
Jayaram A, Orfanelli T, Doulaveris G, Linhares I, Ledger W, Witkin S.
Autophagy and female genital tract infections: new insights and research directions.
BJOG. 2014 Jun;121(7):801-8.
577.
Li P, Du Q, Cao Z, Guo Z, Evankovich J, Yan W, et al. Interferon-γ induces
autophagy with growth inhibition and cell death in human hepatocellular carcinoma
357
(HCC) cells through interferon-regulatory factor-1 (IRF-1). Cancer Lett
2012;314:213–22.)
578.
Miettinen M, Matikainen S, Vuopio-Varkila J, Pirhonen J, Varkila K,
Kurimoto M, Julkunen I. Lactobacilli and streptococci induce interleukin-12 (IL-12),
IL-18, and gamma interferon production in human peripheral blood mononuclear
cells. Infect Immun. 1998 Dec;66(12):6058-62.
579.
Hirota Y, Cha J, Yoshie M, Daikoku T, Dey SK. Heightened uterine
mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signaling provokes preterm
birth in mice. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:180738
580.
Forsum U, Holst E, Larsson PG, et al.:Bacterial vaginosis a microbiological
and immunological enigma. APMIS 2005, 113: 81–90.
581.
Danielsson D, Teigen PK, Moi H. The genital econiche: focus on microbiota
and bacterial vaginosis. Ann N Y Acad Sci. 2011 Aug;1230:48-58.
doi:10.1111/j.1749-6632.2011.06041.x. Review.
582.
Nenadić DB, Pavlović MD. Cervical fluid cytokines in pregnant women:
Relation to vaginal wet mount findings and polymorphonuclear leukocyte counts. Eur
J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2008 Oct;140(2):165-70.
583.
Anderson BL, Cu-Uvin S, Raker CA, Fitzsimmons C, Hillier SL. Subtle
perturbations of genital microflora alter mucosal immunity among low-risk pregnant
women. Acta Obstet Gynecol Scand. 2011 May;90(5):510-5.
584.
Aboul Enien WM, El Metwally HA. Association of abnormal vaginal flora
with increased cervical tumour necrosis factor--alpha and interferon--gamma levels in
idiopathic infertility. Egypt J Immunol. 2005;12(2):53-9.
585.
Conde-Agudelo A, Papageorghiou AT, Kennedy SH, Villar J. Novel
biomarkers for the prediction of the spontaneous preterm birth phenotype: a systematic
reviewand meta-analysis. BJOG. 2011 Aug;118(9):1042-54.
586.
Menon R, Torloni MR, Voltolini C, Torricelli M, Merialdi M, Betrán AP,
Widmer M, Allen T, Davydova I, Khodjaeva Z, Thorsen P, Kacerovsky M, Tambor
V, Massinen T, Nace J, Arora C. Biomarkers of spontaneous preterm birth: an
overview of the literature in the last four decades. Reprod Sci. 2011 Nov;18(11):104670.
587.
Brou L, Almli LM, Pearce BD, Bhat G, Drobek CO, Fortunato S, Menon R.
Dysregulated biomarkers induce distinct pathways in preterm birth. BJOG. 2012
Mar;119(4):458-73.
588.
Thorsen P, Schendel DE, Deshpande AD, Vogel I, Dudley DJ, Olsen J.
Identification of biological/biochemical marker(s) for preterm delivery. Paediatr
Perinat Epidemiol. 2001 Jul;15 Suppl 2:90-103.,
589.
Kacerovsky M, Lenco J, Musilova I, Tambor V, Lamont R, Torloni MR,
Menon R; PREBIC Biomarker Working Group 2012-2013. Proteomic biomarkers for
spontaneous preterm birth: a systematic review of the literature. Reprod Sci. 2014
Mar;21(3):283-95. doi: 10.1177/1933719113503].
590.
Smith GC, Shah I, White IR, Pell JP, Crossley JA, Dobbie R. Maternal and
biochemical predictors of spontaneous preterm birth among nulliparous women: a
systematic analysis in relation to the degree of prematurity. Int J Epidemiol. 2006
Oct;35(5):1169-77
591.
Lockwood CJ, Senyei AE, Dische MR, Casal D, Shah KD, Thung SN, et al.
Fetal fibronectin in cervical and vaginal secretions as a predictor of preterm delivery.
N Engl J Med 1991;325:669-74.
592.
Nageotte MP, Casal D, Senyei AE. Fetal fibronectin in patients at increased
risk for premature birth. Am J Obstet Gynecol 1994;170:20-5.
358
593.
Inglis SR, Jeremias J, Kuno K, Lescale K, Peeper Q, Chervenak FA, et al.
Detection of tumor necrosis factor-alpha, inter-leukin-6, and fetal fibronectin in the
lower genital tract during pregnancy: relation to outcome. Am J Obstet Gynecol 1994;
171:5-10.
594.
Iams JD, Casal D, McGregor JA, Goodwin TM, Kreaden US, Lowensohn R, et
al. Fetal fibronectin improves the accuracy of diagnosis of preterm labor. Am J Obstet
Gynecol 1995; 173:141-5.
595.
Goldenberg RL, Mercer BM, Meis PJ, Copper RL, Das A, Mc- Nellis D. The
preterm prediction study: fetal fibronectin testing and spontaneous preterm birth.
NICHD Maternal Fetal Medi-cine Units Network. Obstet Gynecol 1996;87:643-8.
596.
Goldenberg RL, Thom E, Moawad AH, Johnson F, Roberts J, Caritis SN. The
preterm prediction study: fetal fibronectin, bacterial vaginosis, and peripartum
infection: NICHD Maternal Fetal Medicine Units Network. Obstet Gynecol
1996;87:656-60
597.
Andrews WW, Sibai BM, Thom EA, Dudley D, Ernest JM, McNellis D,
Leveno KJ, Wapner R, Moawad A, O'Sullivan MJ, Caritis SN, Iams JD, Langer O,
Miodovnik M, Dombrowski M; National Institute of Child Health & Human
Development Maternal-Fetal Medicine Units Network. Randomized clinical trial of
metronidazole plus erythromycin to prevent spontaneous preterm delivery in fetal
fibronectin-positive women. Obstet Gynecol. 2003 May;101(5 Pt 1):847-55.
598.
Shennan A, Crawshaw S, Briley A, Hawken J, Seed P, Jones G, Poston L. A
randomised controlled trial of metronidazole for the prevention of preterm birth in
women positive for cervicovaginal fetal fibronectin: the PREMET Study. BJOG. 2006
Jan;113(1):65-74.
599.
Briery CM, Chauhan SP, Magann EF, Cushman JL, Morrison JC. Treatment of
bacterial vaginosis does not reduce preterm birth among high-risk asymptomatic
women in fetal fibronectin positive patients. J Miss State Med Assoc. 2011
Mar;52(3):72-5.
600.
Andrews WW, Goldenberg RL; National Institute of Child Health and Human
Development Maternal-Fetal Medicine Units Network. What we have learned from an
antibiotic trial in fetal fibronectin positive women. Semin Perinatol. 2003
Jun;27(3):231-8. Review.
601.
Diaz-Cueto L, Dominguez-Lopez P, Tena-Alavez G, Cuica-Flores A, RosalesOrtiz S, Arechavaleta-Velasco F. Effect of clindamycin treatment on vaginal
inflammatory markers in pregnant women with bacterial vaginosis and a positive fetal
fibronectin test. Int J Gynaecol Obstet. 2009 Nov;107(2):143-6.
doi:10.1016/j.ijgo.2009.06.015. Epub 2009 Aug 3.
602.
McLaren JS, Hezelgrave NL, Ayubi H, Seed PT, Shennan AH. Prediction of
spontaneous preterm birth using quantitative fetal fibronectin after recent sexual
intercourse. Am J Obstet Gynecol. 2014 Jun 30. pii: S0002-9378(14)00635-8.doi:
10.1016/j.ajog.2014.06.055.
603.
Faron G, Buyl R, Foulon W. Does recent sexual intercourse during pregnancy
affect the results of the fetal fibronectin rapid test? A comparative prospective study. J
Perinat Med. 2014 Jun 14. pii:/j/jpme.ahead-of-print/jpm-2014-0127/jpm-20140127.xml. doi:10.1515/jpm-2014-0127.
604.
Shimoya K, Hashimoto K, Shimizu T, Saji F, Murata Y. Effect of sexual
intercourse on fetal fibronectin concentration in cervicovaginal secretions. Am J
Obstet Gynecol. 1998 Jul;179(1):255-6.
359
605.
Fielding CA, McLoughlin RM, McLeod L, Colmont CS, Najdovska M, Grail
D, Ernst M, Jones SA, Topley N, Jenkins BJ. IL-6 regulates neutrophil trafficking
during acute inflammation via STAT3. J Immunol. 2008 Aug 1;181(3):2189-95
606.
Biffl WL, Moore EE, Moore FA, Barnett CC Jr, Carl VS, Peterson VN.
Interleukin-6 delays neutrophil apoptosis. Arch Surg. 1996 Jan;131(1):24-9;
discussion 29-30.
607.
Chan RL. Biochemical markers of spontaneous preterm birth in asymptomatic
women. Biomed Res Int. 2014;2014:164081. doi: 10.1155/2014/164081. Epub 2014
Jan
608.
Menon R. Spontaneous preterm birth, a clinical dilemma: etiologic,
pathophysiologic and genetic heterogeneities and racial disparity. Acta Obstet
Gynecol Scand. 2008;87(6):590-600.
609.
Menon R, Fortunato SJ, Thorsen P, Williams S. Genetic associations in
preterm birth: a primer of marker selection, study design, and data analysis. J Soc
Gynecol Investig. 2006 Dec;13(8):531-41.
610.
Shah SJ, Yu KH, Sangar V, Parry SI, Blair IA. Identification and
quantification of preterm birth biomarkers in human cervicovaginal fluid by liquid
chromatography/tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 2009 May;8(5):2407-17.
doi: 10.1021/pr8010342. Erratum in: J Proteome Res. 2009 Jul;8(7):3786.
611.
Honest H, Bachmann LM, Sundaram R, Gupta JK, Kleijnen J, Khan KS. The
accuracy of risk scores in predicting preterm birth--a systematic review. J Obstet
Gynaecol. 2004 Jun;24(4):343-59. Review.
612.
Peterson WE, Sprague AE, Reszel J, Walker M, Fell DB, Perkins SL, Dunn SI,
Johnson M. Women's perspectives of the fetal fibronectin testing process: a qualitative
descriptive study. BMC Pregnancy Childbirth. 2014 Jun 4;14:190. doi: 10.1186/14712393-14-190
613.
Honest H, Forbes CA, Durée KH, Norman G, Duffy SB, Tsourapas A, Roberts
TE, Barton PM, Jowett SM, Hyde CJ, Khan KS. Screening to prevent spontaneous
preterm birth: systematic reviews of accuracy and effectiveness literature with
economic modelling. Health Technol Assess. 2009 Sep;13(43):1-627
614.
Bhat G, Williams SM, Saade GR, Menon R. Biomarker interactions are better
predictors of spontaneous preterm birth. Reprod Sci. 2014 Mar;21(3):340-50.
0.1177/1933719113497285.
615.
Deshpande SN, van Asselt AD, Tomini F, Armstrong N, Allen A, Noake C,
Khan K, Severens JL, Kleijnen J, Westwood ME. Rapid fetal fibronectin testing to
predict preterm birth in women with symptoms of premature labour: a systematic
review andcost analysis. Health Technol Assess. 2013 Sep;17(40):1-138.
doi:10.3310/hta17400. Review
616.
Dizon-Townson D, Major H, Varner M and Ward K. A promoter mutation that
increases transcription of the tumor necrosis factor-alpha gene is not associated with
preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 1997; 177:810-14.
617.
Dizon-Townson D, Kinney S, LU J and Ward K. A promoter mutation in the
tumor necrosis factor-alpha a possible association with intraamniotic infection and
preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 1999; 180:S97-103
618.
Beack and A. Olek, The Epigenome, WILEY-VCH GmbH Co.KGaA, 2003
619.
Rodenhiser D, Mann M. Epigenetics and human disease: translating basic
biology into clinical applications. CMAJ 2006; 174(3): 341-8.
620.
S Zdenko Herceg, Epigenetics and cancer: towards an evaluation of the impact
of environmental and dietary factors, Mutagenesis vol. 22 no. 2 pp. 91–103, 2007.
360
621.
Mitsuya K, Singh N, Sooranna SR, Johnson MR, Myatt L. Epigenetics of
human myometrium: DNA methylation of genes encoding contraction-associated
proteins in term and preterm labor. Biol Reprod. 2014 May 8;90(5):98. doi:
10.1095/biolreprod.113.113209. Print 2014 May. PubMed PMID: 24571989. 2:
622.
Chan RL. Biochemical markers of spontaneous preterm birth in asymptomatic
women. Biomed Res Int. 2014;2014:164081. doi: 10.1155/2014/164081. Epub 2014
Jan 19. PubMed PMID: 24551837; PubMed Central PMCID: PMC3914291. 3:
623.
Luo X, Shi Q, Gu Y, Pan J, Hua M, Liu M, Dong Z, Zhang M, Wang L, Gu Y,
Zhong J, Zhao X, Jenkins EC, Brown WT, Zhong N. LncRNA pathway involved in
premature preterm rupture of membrane (PPROM): an epigenomic approach to study
the pathogenesis of reproductive disorders. PLoS One. 2013 Nov 27;8(11):e79897.
doi: 10.1371/journal.pone.0079897. eCollection 2013.
624.
Cruickshank MN, Oshlack A, Theda C, Davis PG, Martino D, Sheehan P, Dai
Y, Saffery R, Doyle LW, Craig JM. Analysis of epigenetic changes in survivors of
preterm birth reveals the effect of gestational age and evidence for a long term legacy.
Genome Med. 2013 Oct 18;5(10):96. doi: 10.1186/gm500. eCollection 2013.
625.
Madan RP, Carpenter C, Fiedler T, Kalyoussef S, McAndrew TC,
Viswanathan S, Kim M, Keller MJ, Fredricks DN, Herold BC. Altered biomarkers of
mucosal immunity and reduced vaginal Lactobacillus concentrations in sexually active
female adolescents. PLoS One. 2012;7(7):e40415. doi: 10.1371/journal.pone.0040415.
Epub 2012 Jul 10.
626.
Bartlett JG, Onderdonk AB, Drude E, Goldstein C, Anderka M, Alpert S,
McCormack WM: Quantitative bacteriology of the vaginal flora. J Infect Dis 1977,
136:271–277.
627.
Sautter RL, Brown WJ: Sequential vaginal cultures from normal young
women. J Clin Microbiol 1980, 11:479–484.
628.
Wilks M, Tabaqchali S: Quantitative bacteriology of the vaginal flora during
the menstrual cycle. J Med Microbiol 1987, 24:241–245. 22. Priestley CJ, Jones BM,
Dhar J, Goodwin L: What is normal vaginal flora? Genitourin Med 1997, 73:23–28.,
629.
Hillier SL, Krohn MA, Rabe LK, Klebanoff SJ, Eschenbach DA: The normal
vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant
women. Clin Infect Dis 1993, 16:S273–S281.
630.
Korshunov VM, Gudieva ZA, Efimov BA, Pikina AP, Smeianov VV, Reid G,
Korshunova OV, Tiutiunnik VL, Stepin II: [The vaginal Bifidobacterium flora in
women of reproductive age]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 1999, 4:74–78.
631.
Rosenstein IJ, Morgan DJ, Sheehan M, Lamont RF, Taylor-Robinson D.
Bacterial vaginosis in pregnancy: distribution of bacterial species in different gramstain categories of the vaginal flora. J Med Microbiol. 1996 Aug;45(2):120-6. PubMed
PMID: 8683547.
632.
Drell T, Lillsaar T, Tummeleht L, Simm J, Aaspõllu A, Väin E, Saarma I,
Salumets A, Donders GG, Metsis M: Characterization of the vaginal micro- and
mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One 2013,
8:e54379.
633.
Sundquist A, Bigdeli S, Jalili R, Druzin ML, Waller S, Pullen KM, El-Sayed
YY, Taslimi MM, Batzoglou S, Ronaghi M: Bacterial flora-typing with targeted, chipbased pyrosequencing. BMC Microbiol 2007, 7:108.
634.
Burton JP, Dixon JL, Reid G: Detection of Bifidobacterium species and
Gardnerella vaginalis in the vagina using PCR and denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE). Int J Gynaecol Obstet 2003, 81:61–63.
361
635.
Hyman RW, Fukushima M, Diamond L, Kumm J, Giudice LC, Davis RW:
Microbes on the human vaginal epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A 2005,
102:7952–7957.
636.
Chaban B, Links MG, Jayaprakash TP, Wagner EC, Bourque DK, Lohn Z,
Albert AY, van Schalkwyk J, Reid G, Hemmingsen SM, Hill JE, Money DM.
Characterization of the vaginal microbiota of healthy Canadian women through the
menstrual cycle. Microbiome. 2014 Jul 4;2:23. doi: 10.1186/2049-2618-2-23
637.
Swidsinski A, Dörffel Y, Loening-Baucke V, Mendling W, Schilling J,
Patterson JL, Verstraelen H. Dissimilarity in the occurrence of Bifidobacteriaceae in
vaginal and perianal microbiota in women with bacterial vaginosis. Anaerobe.
2010;Oct;16(5):478-82. doi: 10.1016/j.anaerobe.2010.06.011. Epub 2010 Jul 8.
638.
Liu MB, Xu SR, He Y, Deng GH, Sheng HF, Huang XM, Ouyang CY, Zhou
HW. Diverse vaginal microbiomes in reproductive-age women with vulvovaginal
candidiasis. PLoSOne. 2013 Nov 12;8(11):e79812. doi:
10.1371/journal.pone.0079812. eCollection,2013.
639.
Cook CM, Ellwood DA. A longitudinal study of the cervix in pregnancy using
transvaginal ultrasound. Br J Obstet Gynaecol 1996;103:16–8.
640.
Smith CV, Anderson JC, Matamoros A, Rayburn WF. Transvaginal
sonography of cervical width and length during pregnancy. J Ultrasound Med
1992;11:465–7.
641.
Tongsong T, Kamprapanth P, Pitaksakorn J. Cervical length in normal
pregnancy as measured by transvaginal sonography. Int J Gynaecol Obstet
1997;58:313–5
642.
Smith CV, Anderson JC, Matamoros A, Rayburn WF. Transvaginal
sonography of cervical width and length during pregnancy. J Ultrasound Med
1992;11:465–7.
643.
Carvalho MH, Bittar RE, Brizot ML, Maganha PP, Borges da Fonseca ES, et
al. Cervical length at 11–14 weeks’ and 22–24 weeks’ gestation evaluated by
transvaginal sonography, and gestational age at delivery. Ultrasound Obstet Gynecol
2003;21:135–9
644.
Iams JD, Romero R, Culhane JF, Goldenberg RL. Primary, secondary, and
tertiary interventions to reduce the morbidity and mortality of preterm birth. Lancet
2008; 371: 164–175.
645.
Taipale P, Hiilesmaa V. Sonographic measurement of uterine cervix at 18–22
weeks’ gestation and the risk of preterm delivery. Obstet Gynecol 1998; 92: 902–907.
Heath VC, Southall TR,
646.
Souka AP, Elisseou A, Nicolaides KH. Cervical length at 23 weeks of
gestation: prediction of spontaneous preterm delivery. Ultrasound Obstet Gynecol
1998; 12: 312–317.
647.
Iams JD, Goldenberg RL, Meis PJ, Mercer BM, Moawad A, Das A, Thom E,
McNellis D, Copper RL, Johnson F, Roberts JM. The length of the cervix and the risk
of spontaneous premature delivery. National Institute of Child Health and Human
Development Maternal Fetal Medicine Unit Network. N Engl JMed 1996; 334: 567–
572
648.
Iams JD, Goldenberg RL, Meis PJ, Mercer BM, Moawad A, Das A, Thom E,
McNellis D, Copper RL, Johnson F, Roberts JM. The length of the cervix and the risk
of spontaneous premature delivery. N Engl J Med. 1996; 334:567–572.
649.
Hassan SS, Romero R, Berry SM, Dang K, Blackwell SC, Treadwell MC,
Wolfe HM. Patients with an ultrasonographic cervical length < or =15 mm have nearly
362
a 50% risk of early spontaneous preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 2000;
182:1458–1467.
650.
Salomon LJ, az-Garcia C, Bernard JP, Ville Y. Reference range for cervical
length throughout pregnancy: non-parametric LMS-based model applied to a large
sample. Ultrasound Obstet Gynecol. 2009; 33:459–464.
651.
Fonseca EB, Celik E, Parra M, Singh M, Nicolaides KH. Progesterone and the
risk of preterm birth among women with a short cervix. N Engl J Med. 2007;
357:462–469.
652.
De Franco EA, O'Brien JM, Adair CD, Lewis DF, Hall DR, Fusey S, SomaPillay P, Porter K, How H, Schakis R, Eller D, Trivedi Y, Vanburen G, Khandelwal
M, Trofatter K, Vidyadhari D, Vijayaraghavan J, Weeks J, Dattel B, Newton E,
Chazotte C, Valenzuela G, Calda P, Bsharat M, Creasy GW. Vaginal progesterone is
associated with a decrease in risk for early preterm birth and improved neonatal
outcome in women with a short cervix: a secondary analysis from a randomized,
double-blind, placebo-controlled trial. Ultrasound Obstet Gynecol. 2007; 30:697–705.
653.
Dodd JM, Flenady VJ, Cincotta R, Crowther CA. Progesterone for the
prevention of preterm birth: a systematic review. Obstet Gynecol. 2008; 112:127–
134.)
654.
Mancuso MS, Owen J. Prevention of preterm birth based on a short cervix:
cerclage. Semin Perinatol. 2009; 33:325–333.
655.
Owen J, Hankins G, Iams JD, Berghella V, Sheffield JS, Perez-Delboy A,
Egerman RS, Wing DA, Tomlinson M, Silver R, Ramin SM, Guzman ER, Gordon M,
How HY, Knudtson EJ, Szychowski JM, Cliver S, Hauth JC. Multicenter randomized
trial of cerclage for preterm birth prevention in high-risk women with shortened
midtrimester cervical length. Am J Obstet Gynecol. 2009; 201:375–378.
656.
Hassan S, Romero R, Hendler I, Gomez R, Khalek N, Espinoza J, Nien JK,
Berry SM, Bujold E, Camacho N, Sorokin Y. A sonographic short cervix as the only
clinical manifestation of intraamniotic infection. J Perinat Med. 2006; 34:13–19.
657.
Berghella V, Rust OA, Althuisius SM. Short cervix on ultrasound: does
indomethacin prevent preterm birth? Am J Obstet Gynecol. 2006; 195:809–813.
658.
Nicolaides KH, Tsoi E & To MS. Sonographic measurement of cervical length
and preterm delivery. In Critchley HO, Bennett PR & Thornton S (eds.). Preterm
Birth. RCOG Press, 2004, pp. 124–139
659.
Vendittelli F, Volumenie J. Transvaginal ultrasonography examination of the
uterine cervix in hospitalised women undergoing preterm labour. Eur J Obstet
Gynecol Reprod Biol 2000;90:3–11
660.
Crane JM, Van den Hof M, Armson BA, Liston R. Transvaginal ultrasound in
the prediction of preterm delivery: singleton and twin gestations. Obstet Gynecol
1997;90:357–63. 102.
661.
Tsoi E, Akmal S, Rane S, Otigbah C, Nicolaides KH. Ultrasound assessment
of cervical length in threatened preterm labor. Ultrasound Obstet Gynecol
2003;21:552–5.
662.
Tsoi E, Fuchs IB, Rane S, Geerts L, Nicolaides KH. Sonographic measurement
of cervical length in threatened preterm labor in singleton pregnancies with intact
membranes. Ultrasound Obstet Gynecol 2005;25:353–6.
663.
Berghella V, Kuhlman K, Weiner S, Texeira L, Wapner RJ. Cervical
funneling: sonographic criteria predictive of preterm delivery. Ultrasound Obstet
Gynecol. 1997;10:161–6
363
664.
Berghella V, Roman A, Daskalakis C, Ness A, Baxter JK. Gestational age at
cervical length measurement and incidence of preterm birth. Obstet Gynecol
2007;110:311–17
665.
Crane JM, Hutchens D. Transvaginal sonographic measurement of cervical
length to predict preterm birth in asymptomatic women at increased risk: a systematic
review. Ultrasound Obstet Gynecol 2008;31:579–87
666.
Heath VC, Southall TR, Souka AP, Elisseou A, Nicolaides KH. Cervical
length at 23 weeks of gestation: prediction of spontaneous preterm delivery.
Ultrasound Obstet Gynecol 1998;12:312–7
667.
Ozdemir I, Demirci F, Yucel O, Erkorkmaz U. Ultrasonographic cervical
length measurement at 10–14 and 20–24 weeks gestation and the risk of preterm
delivery. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2007;130:176–9
668.
Andersen HF, Nugent CE, Wanty SD, Hayashi RH. Prediction of risk for
preterm delivery by ultrasonographic measurement of cervical length. Am J Obstet
Gynecol 1990;163:859–67
669.
Berghella V, Baxter JK, Hendrix NW. Cervical assessment by ultrasound for
preventing preterm delivery. Cochrane Database Syst Rev 2009;CD007235.
670.
Davies G, Ottenhof C, Woodman M, Farley A, Julien N, Van VD, et al. Cervix
length and relaxin as predictors of preterm birth. J Obstet Gynaecol Can
2008;30:1124–31
671.
Mancuso MS, Figueroa D, Szychowski JM, Paden MM, Owen J. Midtrimester
bacterial vaginosis and cervical length in women at risk for preterm birth. Am J Obstet
Gynecol. 2011 Apr;204(4):342.e1-5. doi: 10.1016/j.ajog.2010.11.003. Epub 2010 Dec
22.
364
PRILOG 1
Tabela 37: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i Nove Podele u 6 grupa (NP-6G)
NP-6G
NORMAL
FULL
NORMAL MID
NORMAL
NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
NUGENT
NORMAL INTERMEDIAR
289
12
96,0
4,0
126
29
80,3
18,5
22
32
30,6
44,4
4
28
8,2
57,1
3
10
5,1
16,9
0
1
0,0
1,5
444
112
63,1
15,9
χ2=669,80; df=10; p<0.001
BV
0
0,0
2
1,3
18
25,0
17
34,7
46
78,0
65
98,5
148
21,0
∑
301
100,0
157
100,0
72
100,0
49
100,0
59
100,0
66
100,0
704
100,0
Tabela 38: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i Nove Podele u 3 grupe (NP-3G)
NP-3G
NORMAL
INTERMEDIAL
BV
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
NUGENT
NORMAL INTERMEDIAL
415
41
90,6
9,0
26
60
21,5
49,6
3
11
2,4
8,8
444
112
63,1
15,9
χ2=634,44; df=4; p<0.001
BV
2
0,4
35
28,9
111
88,8
148
21,0
∑
458
100,0
121
100,0
125
100,0
704
100,0
365
Tabela 39: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Nugentu („zlatni
standard“) i Nove Podele u 2 grupe (NP-2G)
NP-2G
NORMAL
BV
∑
n
%
n
%
n
%
NUGENT
NORMAL INTERMEDIAL
437
73
82,5
13,8
7
39
4,0
22,4
444
112
63,1
15,9
χ2=437,40; df=2; p<0.001
∑
BV
20
3,8
128
73,6
148
21,0
530
100,0
174
100,0
704
100,0
Tabela 40: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Amselu i Nove Podele u
6 grupa (NP-6G)
NP-6G
NORMAL
FULL
NORMAL
MID
NORMAL
NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
∑
AMSEL
NORMAL
BV
n
262
1
%
99,6
0,4
n
143
2
%
98,6
1,4
n
51
14
%
78,5
21,5
n
19
28
%
40,4
59,6
n
15
43
%
25,9
74,1
n
2
61
%
3,2
96,8
n
492
149
%
76,8
23,2
χ2=426,17; df=5; p<0.001
∑
263
100,0
145
100,0
65
100,0
47
100,0
58
100,0
63
100,0
641
100,0
Tabela 41: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Amselu i Nove Podele u
3 grupe (NP-3G)
AMSEL
NORMAL
BV
n
405
3
NORMAL
%
99,3
0,7
n
70
42
INTERMEDIAL
%
62,5
37,5
n
17
104
BV
%
14,0
86,0
n
492
149
∑
%
76,8
23,2
2
χ =395.29; df=2; p<0.001
NP-3G
∑
408
100,0
112
100,0
121
100,0
641
100,0
366
Tabela 42: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Amselu i Nove Podele u
2 grupe (NP-2G)
NP-2G
NORMAL
BV
∑
AMSEL
NORMAL
BV
n
456
17
%
96,4
3,6
n
36
132
%
21,4
78,6
n
492
149
%
76,8
23,2
χ2=390,60; df=1; p<0.001
∑
473
100,0
168
100,0
641
100,0
Tabela 43: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i Nugentu
Ison/Hay
Nugent
NORMAL
INTERMERDIAL
BV
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
Čist
Normalan Intermedia
nalaz
2
406
17
0,5
91,4
3,8
21
15
53
18,6
13,3
46,9
14
1
7
9,5
0,7
4,7
37
422
77
5,2
59,9
10,9
χ2=894,33; df=8; p<0.001
BV
Koke
0
0,0
3
2,7
121
81,8
124
17,6
19
4,3
21
18,6
5
3,4
45
6,4
∑
444
100,0
113
100,0
148
100,0
705
100,0
Tabela 44: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove podele
u 6 grupa (NP-6G)
Ison/Hay
NP-6G
NORMAL
FULL
NORMAL
MID
NORMAL
NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
Čist
nalaz
1
0,3
1
0,6
21
29,2
13
26,5
1
1,7
0
0,0
37
5,3
Normalan Intermedia
281
15
93,4
5,0
124
23
79,0
14,6
12
18
16,7
25,0
2
11
4,1
22,4
3
8
5,1
13,6
0
1
0,0
1,5
422
76
59,9
10,8
χ2=862,73; df=20; p<0.001
BV
Koke
0
0,0
1
0,6
4
5,6
12
24,5
42
71,2
65
98,5
124
17,6
4
1,3
8
5,1
17
23,6
11
22,4
5
8,5
0
0,0
45
6,4
∑
301
100,0
157
100,0
72
100,0
49
100,0
59
100,0
66
100,0
704
100,0
367
Tabela 45: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove podele
u 3 grupe (NP-3G)
Ison/Hay
NP-3G
NORMAL
INTERMEDIAL
BV
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
Čist
nalaz
2
0,4
34
28,1
1
0,8
37
5,3
Normalan Intermedia
405
38
88,4
8,3
14
29
11,6
24,0
3
9
2,4
7,2
422
76
59,9
10,8
χ2=819,41; df=8; p<0.001
BV
Koke
1
0,2
16
13,2
107
85,6
124
17,6
12
2,6
28
23,1
5
4,0
45
6,4
∑
458
100,0
121
100,0
125
100,0
704
100,0
Tabela 46: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Ison/Hayu i nove podele
u 2 grupe (NP-2G)
Ison/Hay
NP-2G
NORMAL
BV
∑
n
%
n
%
n
%
Čist
nalaz
23
4,3
14
8,0
37
5,3
Normalan Intermedia
417
56
78,7
10,6
5
20
2,9
11,5
422
76
59,9
10,8
χ2=470.27; df=4; p<0.001
BV
Koke
5
0,9
119
68,4
124
17,6
29
5,5
16
9,2
45
6,4
∑
530
100,0
174
100,0
704
100,0
Tabela 47: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i Nugentu
Claeys
Nugent
∑
Sličan
Normal
Intermedia
BV
Koke Leukoreje
normalnom
n
369
2
0
0
47
26
444
NORMAL
%
83,1
0,5
0,0
0,0
10,6
5,9
100,0
n
11
84
1
4
6
7
113
INTERMERDIAL
%
9,7
74,3
0,9
3,5
5,3
6,2
100,0
n
0
6
142
0
0
0
148
BV
%
0,0
4,1
95,9
0,0
0,0
0,0
100,0
n
380
92
143
4
53
33
705
∑
%
53,9
13,0
20,3
0,6
7,5
4,7
100,0
χ2=1155.27; df=10; p<0.001
368
Tabela 48: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i nove podele u
6 grupa (NP-6G)
Claeys
NP-6G
Normal Intermedia
NORMAL n
FULL
%
NORMAL n
MID
%
NORMAL n
NULL
%
n
BV NULL
%
n
BV MID
%
n
BV FULL
%
n
∑
%
240
79,7
117
74,5
18
25,0
4
8,2
1
1,7
0
0,0
380
54,0
BV
Koke Leukoreje
6
0
1
2,0
0,0
0,3
14
2
1
8,9
1,3
0,6
36
13
0
50,0
18,1 0,0
25
17
1
51,0
34,7 2,0
9
46
1
15,3
78,0 1,7
1
65
0
1,5
98,5 0,0
91
143
4
12,9
20,3 0,6
χ2=734,47; df=25; p<0.001
36
12,0
14
8,9
2
2,8
0
0,0
1
1,7
0
0,0
53
7,5
Sličan
normalnom
18
6,0
9
5,7
3
4,2
2
4,1
1
1,7
0
0,0
33
4,7
∑
301
100,0
157
100,0
72
100,0
49
100,0
59
100,0
66
100,0
704
100,0
Tabela 49: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i nove podele u
3 grupe (NP-3G)
Claeys
NP-3G
Normal
NORMAL
INTERMEDIA
BV
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
357
77,9
22
18,2
1
0,8
380
54,0
Intermedia
BV
Koke
20
2
2
4,4
0,4
0,4
61
30
1
50,4
24,8
0,8
10
111
1
8,0
88,8
0,8
91
143
4
12,9
20,3
0,6
χ2=707.72; df=10; p<0.001
Leukoreje
50
10,9
2
1,7
1
0,8
53
7,5
Sličan
normalnom
27
5,9
5
4,1
1
0,8
33
4,7
∑
458
100,0
121
100,0
125
100,0
704
100,0
Tabela 50: Uporedni rezultati mikroskopskog pregleda na osnovu kriterijuma po Claeysu i nove podele u
2 grupe (NP-2G)
Claeys
NP-2G
NORMAL
BV
∑
Normal Intermedia
n
%
n
%
n
%
375
70,8
5
2,9
380
54,0
BV
Koke Leukoreje
56
15
2
10,6
2,8
0,4
35
128
2
20,1
73,6 1,1
91
143
4
12,9
20,3 0,6
χ2=481.25; df=5; p<0.001
52
9,8
1
0,6
53
7,5
∑
Sličan
normalnom
30
530
5,7
100,0
3
174
1,7
100,0
33
704
4,7
100,0
369
Tabela 51: Raspodela KOKA po grupama na osnovu NP-6G
NP-6G
NORMAL n
FULL
%
NORMAL n
MID
%
NORMAL n
NULL
%
n
BV NULL
%
n
BV MID
%
n
BV FULL
%
n
∑
%
NOR
FULL
254
84,4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
254
36,1
NOR
NOR
BV
BV
MID NULL NULL MID
0
0
0
0
0
0
0
0
116
0
0
0
73,9
0
0
0
0
37
0
0
0
51,4
0
0
0
0
15
0
0
0
30,6
0
0
0
0
15
0
0
0
25,4
0
0
0
0
0
0
0
0
116
37
15
15
16,5
5,3
2,1
2,1
χ2=1260,863; df=30; p<0.001
BV
KOKE
FULL
0
47
0
15,6
0
41
0
26,1
0
35
0
48,6
0
34
0
69,4
0
44
0
74,6
9
57
13,6
86,4
9
258
1,3
36,6
∑
301
100
157
100,0
72
100
49
100
59
100
66
100
704
100
Tabela 52: Raspodela LEPTO po grupama na osnovu NP-6G
NP-6G
NORMAL n
FULL
%
NORMAL n
MID
%
NORMAL n
NULL
%
n
BV NULL
%
n
BV MID
%
n
BV FULL
%
n
∑
%
NOR NOR NOR
BV
BV
BV
FULL MID NULL NULL MID FULL
292
0
0
0
0
0
97,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0
149
0
0
0
0
0,0
94,9
0,0
0,0
0,0
0,0
0
0
61
0
0
0
0,0
0,0
84,7
0,0
0,0
0,0
0
0
0
38
0
0
0,0
0,0
0,0
77,6
0,0
0,0
0
0
0
0
57
0
0,0
0,0
0,0
0,0
96,6
0,0
0
0
0
0
0
65
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
98,5
292
149
61
38
57
65
41,5
21,2
8,7
5,4
8,1
9,2
χ2=3245,245; df=30; p<0.001
LEPTO
∑
9
3,0
8
5,1
11
15,3
11
22,4
2
3,4
1
1,5
42
6,0
301
100,0
157
100,0
72
100,0
49
100,0
59
100,0
66
100,0
704
100,0
370
Tabela 53: Raspodela BIFIDO formi po grupama na osnovu NP-6G
NP-6G
NORMAL FULL
NORMAL MID
NORMAL NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
NORMAL
BV
289
0
96,0
0,0
138
0
87,9
0,0
60
0
83,3
0,0
0
44
0,0
89,8
0
57
0,0
96,6
0
66
0,0
100,0
487
167
69,2
23,7
2
χ =697,083; df=10; p<0.001
BIFIDO
12
4,0
19
12,1
12
16,7
5
10,2
2
3,4
0
0,0
50
7,1
∑
301
100,0
157
100,0
72
100,0
49
100,0
59
100,0
66
100,0
704
100,0
Tabela 54: Uporedni rezultati određivanja broja PMN na mikroskopskom uvećanju X200 i X400
BROJ PMN X 200
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
BROJ PMN X 400
PMN0
PMN1
PMN2
161
26
4
84,3
13,6
2,1
58
160
22
23,4
64,5
8,9
10
43
42
8,3
35,8
35,0
5
18
45
3,8
13,6
34,1
234
247
113
33,9
35,7
16,4
χ2=557,628; df= 9; p<0.001
PMN3
0
0,0
8
3,2
25
20,8
64
48,5
97
14,0
∑
191
100,0
248
100,0
120
100,0
132
100,0
691
100,0
371
Tabela 55: Uporedni rezultati određivanja broja PMN na mikroskopskom uvećanju X200 i X1000
BROJ PMN X 1000
PMN0
PMN1
PMN2
164
27
0
85,9
14,1
0,0
73
144
28
29,4
58,1
11,3
29
12
54
10,0
45,0
24,2
53
3
31
2,3
23,5
40,2
252
256
110
36,5
37,0
15,9
χ2=471,181; df= 9; p<0.001
BROJ PMN X 200
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
PMN3
0
0,0
3
1,2
25
20,8
45
34,1
73
10,6
∑
191
100,0
248
100,0
120
100,0
132
100,0
691
100,0
Tabela 56: : Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po
grupama pacijentkinja na osnovu Nugentovih dijagnostičkih kriterijuma
Broj PMN X200
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
NUGENT
NORMAL
INTERMEDIAL
88
45
45,8
23,4
199
31
78,7
12,3
79
19
64,8
15,6
74
17
55,6
12,8
440
112
62,9
16
2
χ =62,51; df= 6; p<0.001
BV
59
30,7
23
9,1
24
19,7
42
31,6
148
21,1
∑
192
100
253
100
122
100
133
100
700
100
372
Tabela 57: Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po
grupama na osnovu podele po Ison/Hayu
Ison/Hay
Broj PMN
(X200)
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
Čist
nalaz
27
14,1
7
2,8
3
2,5
0
0
37
5,3
Normalan
Intermedia
83
24
43,2
12,5
196
19
77,5
7,5
69
17
56,6
13,9
71
15
53,4
11,3
419
75
59,9
10,7
χ2=103,03; df= 12; p<0.001
BV
Koke
46
24,0
17
6,7
21
17,2
40
30,1
124
17,7
12
6,3
14
5,5
12
9,8
7
5,3
45
6,4
∑
192
100
253
100
122
100
133
100
700
100
Tabela 58: Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po
grupama na osnovu podele po Claeysu
Broj PMN
(X200)
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
Claeys
Normal Intermedia
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
89
46,4
194
76,7
57
46,7
36
27,1
376
53,7
BV
Koke Leukoreje
37
59
2
1
19,3
30,7
1
0,5
26
18
1
3
10,3
7,1
0,4
1,2
15
24
1
17
12,3
19,7
0,8
13,9
13
42
0
32
9,8
31,6
0
24,1
91
143
4
53
13
20,4
0,6
7,6%
χ2=182,16; df= 15; p<0.001
∑
Sličan
normal
4
2,1
11
4,3
8
6,6
10
7,5
33
4,7
192
100
253
100
122
100
133
100
700
100
Tabela 59: Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po
grupama na osnovu podele po Amselu
BROJ PMN X200
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
AMSEL
NORMAL
112
63,3
202
91,8
89
79,5
86
66,7
489
76,6
χ2=53,64; df= 3; p<0.001
BV
65
36,7
18
8,2
23
20,5
43
33,3
149
23,4
∑
177
100
220
100
112
100
129
100
638
100
373
Tabela 60: Raspodela pacijentkinja sa različitim brojem PMN na mikroskopskom uvećanju x200 po
grupama na osnovu NP-6G
NP-6G
NORMAL
FULL
NORMAL
MID
NORMAL
NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
∑
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
BROJ PMN X 200
PMN0
PMN1
PMN2
52
153
46
17,4
51,3
15,4
40
54
32
25,6
34,6
20,5
29
19
18
40,3
26,4
25,0
21
11
11
42,9
22,4
22,4
15
13
7
25,9
22,4
12,1
34
3
8
51,5
4,5
12,1
191
253
122
27,3
36,2
17,5
χ2=110,94; df=15;p<0.001
PMN3
47
15,8
30
19,2
6
8,3
6
12,2
23
39,7
21
31,8
133
19,0
∑
298
100,0
156
100,0
72
100,0
49
100,0
58
100,0
66
100,0
699
100,0
374
PRILOG 2
Tabela 61: Mann-Whitney U test za podelu po Nugent-u
Kruskal Wallis test (x2 = 8,06; p = 0,018)
NORMALAN
INTERMED
BV
NORMALAN
0,736
0,005
INTERMED
0,005
0,027
BV
0,736
0,027
2
Kruskal Wallis test (x = 17,09; p < 0,001)
IL-6
NORMAL
INTERMED
BV
NORMALAN
0,042
0,000
INTERMED
0,164
0,042
BV
0,164
0,000
Kruskal Wallis test (x2 = 16,91; p < 0,001)
IL-1β
NORMALAN
INTERMED
BV
NORMALAN
0.086
0,000
INTERMED
0.086
0,092
BV
0,092
0,000
IL-12p70
Tabela 62: Mann-Whitney U test za podelu po Ison/Hay-u
IL-12p70
Čist nalaz
Normalan
Intermed
BV
Koke
IL-6
Čist nalaz
Normalan
Intermed
BV
Koke
IL-1β
Čist nalaz
Normalan
Intermed
BV
Koke
Kruskal Wallis test (x2 = 17,21; p = 0,002)
Čist
Normalan Intermed BV Koke
nalaz
0.298
0.004
0.002 0.497
0.494 0.040
0.004
0.031
0.298
0.031
0.019 0.740
0.494
0.002
0.019
0.023
0.497
0.740
0.040
0.023
Kruskal Wallis test (x2 = 14,85; p = 0,005)
Čist
Normalan Intermed BV Koke
nalaz
0.138
0.655 0.058
0.010
0.278
0.010
0.002 0.911
0.138
0.655
0.196 0.547
0.655
0.196
0.077
0.002
0.058
0.911
0.547
0.077
Kruskal Wallis test (x2 = 15,56; p = 0,004)
Čist
Normalan Intermed BV Koke
nalaz
0.536
0.632
0.088 0.940
0.536
0.727
0.000 0.457
0.632
0.727
0.011 0.760
0.088
0.116
0.000
0.011
0.940
0.457
0.760
0.166
-
375
Tabela 63: Mann-Whitney U test za podelu po Clayes-u
Kruskal Wallis test (x2 = 19,16; p = 0,002)
IL-6
Normal
Normal
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
IL-1β
Normal
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
0.233
0.000 0.434 0.722
0.233
0.052 0.679 0.642
0.052
0.758 0.035
0.000
0.434
0.679
0.758
0.583
0.722
0.642
0.035 0.583
0.059
0.422
0.598 0.858 0.201
Kruskal Wallis test (x2 = 16,01; p = 0,007)
Sličan
normalnom
0.059
0.422
0.598
0.858
0.201
-
Normal
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan
normalnom
0.187
0.000
0.337
0.856
0.271
0.187
0.070
0.445
0.572
0.792
0.000
0.070
0.652
0.051
0.325
0.337
0.445
0.652
0.465
0.512
0.856
0.572
0.051
0.465
0.483
0.271
0.792
0.325
0.512
0.483
-
Tabela 64:Mann-Whitney U test za podelu po Amsel-u
IL-1β
NORMAL
BV
Mann-Whitney U (26913,000; p = 0,015)
NORMAL
BV
0,015
0,015
376
Tabela 65: Mann-Whitney U test za podelu po NP-6G
IL-12p70
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
IFN-γ
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
IL-6
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
IL-1β
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
Kruskal Wallis test (x2 = 18,52; p = 0,002)
NOR FULL
0.021
0.001
0.625
0.192
0.239
NOR FULL
0.165
0.826
0.006
0.716
0.347
NOR FULL
0.318
0.179
0.136
0.160
0.010
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
0.625
0.192
0.021
0.001
0.357
0.063
0.012
0.357
0.007
0.020
0.063
0.530
0.007
0.530
0.012
0.020
0.413
0.106
0.179
0.062
Kruskal Wallis test (x2 = 12.89; p = 0,024)
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
0.165
0.826
0.716
0.006
0.450
0.533
0.001
0.450
0.899
0.009
0.001
0.009
0.016
0.533
0.899
0.016
0.949
0.596
0.632
0.004
Kruskal Wallis test (x2 = 12.09; p = 0,034)
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
0.318
0.179
0.136
0.160
0.690
0.431
0.510
0.690
0.649
0.873
0.431
0.649
0.828
0.510
0.873
0.828
0.386
0.189
0.019
0.074
Kruskal Wallis test (x2 = 18.98; p = 0,002)
BV FULL
0.239
0.413
0.106
0.179
0.062
BV FULL
0.347
0.949
0.596
0.004
0.632
BV FULL
0.010
0.019
0.074
0.386
0.189
-
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
0.135
0.090
0.041
0.003
0.010
0.135
0.560
0.325
0.068
0.038
0.090
0.560
0.704
0.309
0.168
0.041
0.325
0.704
0.531
0.361
0.003
0.068
0.309
0.531
0.801
0.010
0.038
0.168
0.361
0.801
-
377
Tabela 66: Mann-Whitney U test za podelu modifikovana NP-6G
QPMN-A
NF+NM
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
QPMN-B
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-17A
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-9
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-6
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-13
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-4
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
IL-1β
NF
BVF+BVM
NF+NM/CA
BVF+BVM/CA
NN+BVN
NN+BVN/CA
NF
0,082
0,755
0,030
0,095
0,031
NF
0,491
0,792
0,058
0,000
0,007
NF
0,092
0,911
0,087
0,731
0,005
NF
0,029
0,204
0,003
0,904
0,000
NF
0,000
0,413
0,209
0,108
0,064
NF
0,978
0,339
0,321
0,428
0,035
NF
0,224
0,730
0,112
0,271
0,006
NF
0,000
0,011
0,181
0,012
0,000
Kruskal Wallis test (x2 = 14,78; p = 0,011)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,082
0,755
0,095
0,030
0,105
0,016
0,030
0,105
0,127
0,040
0,016
0,726
0,040
0,127
0,726
0,030
0,076
0,418
0,594
0,005
Kruskal Wallis test (x2 = 48,20; p = 0,000)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,491
0,792
0,058
0,000
0,650
0,252
0,000
0,650
0,091
0,000
0,252
0,091
0,000
0,000
0,000
0,000
0,210
0,896
0,021
0,000
Kruskal Wallis test (x2 = 13,99; p = 0,016)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,092
0,911
0,087
0,731
0,095
0,883
0,133
0,095
0,077
0,872
0,883
0,077
0,101
0,133
0,872
0,101
0,706
0,737
0,005
0,035
Kruskal Wallis test (x2 = 20,50; p = 0,001)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,204
0,904
0,029
0,003
0,185
0,415
0,107
0,185
0,537
0,021
0,415
0,021
0,025
0,107
0,537
0,025
0,670
0,621
0,011
0,023
Kruskal Wallis test (x2 = 16,58; p = 0,005)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,413
0,209
0,108
0,000
0,049
0,053
0,001
0,451
0,268
0,001
0,451
0,805
0,049
0,053
0,268
0,805
0,263
0,891
0,847
0,018
Kruskal Wallis test (x2 = NF,14; p = 0,049)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,978
0,339
0,321
0,428
0,516
0,474
0,522
0,516
0,091
0,897
0,474
0,091
0,158
0,522
0,897
0,158
0,174
0,628
0,003
0,028
Kruskal Wallis test (x2 = 14,67; p = 0,012)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,224
0,730
0,112
0,271
0,271
0,690
0,056
0,271
0,153
0,158
0,690
0,153
0,025
0,056
0,158
0,025
0,434
0,176
0,010
0,003
Kruskal Wallis test (x2 = 32,53; p = 0,000)
BVF+BVM NF+NM/CA BVF+BVM/CA NN+BVN
0,181
0,000
0,011
0,012
0,054
0,003
0,009
0,682
0,526
0,003
0,682
0,429
0,009
0,526
0,429
-0,054
0,103
0,043
0,074
0,403
NN+BVN/CA
0,031
0,005
0,076
0,418
0,594
NN+BVN/CA
0,007
0,210
0,021
0,896
0,000
NN+BVN/CA
0,005
0,706
0,005
0,737
0,035
NN+BVN/CA
0,000
0,670
0,011
0,621
0,023
NN+BVN/CA
0,064
0,018
0,263
0,891
0,847
NN+BVN/CA
0,035
0,174
0,003
0,628
0,028
NN+BVN/CA
0,006
0,434
0,010
0,716
0,003
NN+BVN/CA
0,000
0,103
0,043
0,074
0,403
-
378
Tabela 67: Mann-Whitney U test za % apoptoze u podeli po Ison/Hay
% Apoptoze
Čist nalaz
Normalan
Intermed
BV
Koke
Kruskal Wallis test (x2 = 33,96; p = 0,027)
Čist nalaz
Normalan
Intermed
BV
Koke
0.013
0.019
0.198
0.006
0.013
0.664
0.297
0.115
0.019
0.664
0.156
0.343
0.198
0.297
0.156
0.053
0.006
0.115
0.343
0.053
-
Tabela 68: Mann-Whitney U test za % apoptoze u podeli po Claeysu
Kruskal Wallis test (x2 = 36,07; p = 0,050)
% Apoptoze
Normal
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
Normal
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan
normalnom
0.687
0.091
0.08
0.323
0.992
0.687
0.189
0.012
0.352
0.736
0.091
0.189
0.033
0.107
0.272
0.08
0.012
0.033
0.011
0.028
0.323
0.352
0.107
0.011
0.611
0.992
0.736
0.272
0.028
0.611
-
379
PRILOG 3
Tabela 69: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, Dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod tri grupe pacijentkinja na osnovu podele po Nugentu
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
131
47
39
217
11,87
12,22
15,46
12,59
9,66
9,15
12,49
10,16
134
50
42
226
8,29
5,63
8,89
7,81
34,51
10,07
38,08
31,49
427
109
146
682
0,61
0,87
2,54
1,07
1,35
2,43
9,92
4,86
425
109
145
679
40,69
40,20
39,74
40,41
7,04
5,87
6,95
6,84
%Aoptoze
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
QPMN-A
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
QPMN-B
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
Dužina grlića
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
Normalan
Intermed
BV
403
104
137
644
1087,10
1283,65
1628,41
1233,99
1304,79
1373,72
1666,14
1414,53
402
104
136
642
13,85
6,51
13,23
12,53
58,28
10,93
33,04
48,79
403
104
137
644
63,81
67,89
43,37
60,12
448,92
520,55
198,46
421,67
403
104
137
644
2905,71
3370,10
2078,05
2804,64
14484,67
15160,25
12798,78
14240,89
UKUPNO
403
104
137
644
49,27
25,92
39,49
43,42
133,45
54,33
69,19
112,66
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
403
104
137
644
127,54
20,09
33,22
90,13
1692,15
48,29
77,68
1339,47
403
104
137
644
175,59
133,28
233,76
181,13
465,25
337,84
820,32
544,91
403
104
137
644
45,14
36,24
36,63
41,89
200,40
68,21
73,97
164,40
403
104
137
644
1578,39
2757,65
20,01
1437,31
12298,99
16633,42
71,36
11815,78
IL-1β
pH
UKUPNO
TNF-α
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-12p70
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IFN-γ
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-2
Normalan
Intermed
BV
390
95
137
622
4,27
4,76
5,18
4,55
0,43
0,53
0,57
0,61
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
Normalan
Intermed
BV
403
104
137
644
12,49
9,59
12,39
12,00
17,97
13,97
20,26
17,92
UKUPNO
IL-4
Normalan
Intermed
BV
IL-17A
UKUPNO
IL-5
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-22
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
403
104
137
644
20,62
21,28
19,69
20,53
Normalan
Intermed
BV
85,56
82,54
70,08
81,90
IL-6
UKUPNO
IL-9
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
403
104
137
644
224,75
1631,37
629,62
538,04
4003,45
16324,59
6873,74
7934,67
IL-13
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-10
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
403
104
137
644
66,16
24,26
54,68
56,95
211,37
48,94
202,24
192,86
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
380
Tabela 70: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod pet grupa pacijentkinja na osnovu podele po Ison/Hay-u
parametri
%Apoptoze
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
QPMN-A
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
QPMN-B
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
Dužina grlića
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
pH
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
17
122
28
28
22
217
19,68
12,16
10,86
13,49
10,55
12,59
15,29
9,67
7,47
8,42
11,43
10,16
18
124
30
31
23
226
1,50
8,70
6,90
11,33
4,45
7,81
1,61
35,74
11,40
44,22
9,55
31,49
37
407
72
122
44
682
0,22
0,62
1,21
2,93
0,52
1,07
0,24
1,36
3,02
10,80
0,82
4,86
37
405
72
121
44
679
40,84
40,54
40,29
39,90
40,43
40,41
4,96
7,16
6,23
6,99
5,87
6,84
33
371
63
117
38
622
4,83
4,26
4,64
5,26
4,70
4,55
srednja
vrednost
0,42
0,41
0,59
0,55
0,62
0,61
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
1104,16
1116,92
1130,56
1719,88
1260,22
1233,99
977,74
1327,50
1398,59
1746,77
1286,97
1414,53
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
IL-12p70
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
IFN-γ
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
IL-2
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
382
69
113
43
642
9,91
14,33
5,82
14,46
4,35
12,53
17,04
59,71
8,57
35,76
6,36
48,79
35
383
69
114
43
644
1,66
64,01
111,35
51,74
13,02
60,12
4,74
458,65
642,31
216,74
68,85
421,67
35
383
69
114
43
644
25,91
2944,43
5025,89
2028,59
2314,36
2804,64
90,73
14704,49
18920,58
13157,21
8733,14
14240,89
35
383
69
114
43
644
37,14
51,72
21,72
42,18
12,70
43,42
srednja
vrednost
57,91
137,49
38,92
73,43
17,90
112,66
standardna
devijacija
IL-1β
TNF-α
parametri
n
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
13,55
12,88
9,00
12,87
5,49
12,00
19,52
18,36
10,54
21,62
5,86
17,92
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
42,04
21,38
15,10
20,48
4,22
20,53
119,79
87,71
54,45
76,02
6,27
81,90
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
39,09
235,94
1193,63
45,39
3889,02
538,04
70,58
4106,60
9686,95
91,74
25389,65
7934,67
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
76,06
65,39
23,90
59,02
13,88
56,95
242,69
205,11
42,50
220,59
25,05
192,86
parametri
n
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
26,44
134,80
19,08
33,17
9,02
90,13
47,24
1735,66
40,29
82,49
17,77
1339,47
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
114,88
175,43
241,82
174,18
206,86
181,13
218,38
465,99
1072,75
376,30
526,47
544,91
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
31,90
46,40
40,49
40,30
16,37
41,89
58,87
205,33
72,52
80,36
26,12
164,40
Čist nalaz
Normalan
Intermedia
BV
Koke
UKUPNO
35
383
69
114
43
644
16,62
1661,64
3318,91
22,80
1326,42
1437,31
35,43
12611,33
19288,07
77,86
8665,67
11815,78
IL-4
IL-5
IL-22
IL-6
IL-9
IL-13
IL-10
381
Tabela 71: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod šest grupa pacijentkinja na osnovu podele po Claeys-u
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
114
37
37
4
6
19
217
11,61
11,55
15,44
29,56
7,75
12,90
12,59
9,24
7,26
12,56
15,72
3,51
11,86
10,16
117
40
40
4
6
19
226
8,94
5,17
9,24
0,37
2,84
6,55
7,81
36,83
9,50
39,00
0,28
3,60
10,39
31,49
366
89
141
4
49
33
682
0,58
0,78
2,62
0,35
1,26
0,44
1,07
1,35
1,85
10,09
0,06
2,98
0,48
4,86
364
89
140
4
49
33
679
40,99
40,72
39,63
36,50
38,55
39,70
40,41
6,56
5,61
7,03
5,26
8,73
8,41
6,84
327
78
134
3
48
32
622
4,26
4,77
5,20
4,70
4,22
4,63
4,55
srednja
vrednost
0,39
0,54
0,56
0,52
0,41
0,74
0,61
standardna
devijacija
%Apoptoze
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
347
85
132
4
44
32
644
1087,89
1177,18
1625,89
2247,07
1192,04
1283,64
1233,99
1316,01
1211,51
1679,40
2160,10
1488,79
1308,23
1414,53
346
85
131
4
44
32
642
14,62
6,03
13,59
1,55
11,83
5,15
12,53
62,42
10,16
33,61
2,03
19,77
7,52
48,79
347
85
132
4
44
32
644
67,19
82,76
44,83
0,01
28,78
36,93
60,12
480,32
575,35
202,06
0,01
120,06
134,94
421,67
347
85
132
4
44
32
644
2838,67
2898,15
2156,65
2,47
4226,79
3254,91
2804,64
14353,89
12591,92
13034,20
1,72
17303,31
18388,55
14240,89
347
85
132
4
44
32
644
52,49
24,01
39,73
7,62
39,55
21,60
43,42
srednja
vrednost
142,46
46,97
69,88
11,09
66,14
37,41
112,66
standardna
devijacija
347
85
132
4
44
32
644
143,84
19,65
33,44
3,15
34,76
15,72
90,13
1823,31
40,83
78,86
4,71
69,47
38,65
1339,47
347
85
132
4
44
32
644
179,13
154,14
234,03
23,06
186,51
68,60
181,13
488,58
368,47
834,56
19,99
313,11
130,39
544,91
347
85
132
4
44
32
644
47,53
32,04
37,16
13,35
45,22
25,38
41,89
214,62
60,77
75,26
16,56
87,92
26,48
164,40
347
85
132
4
44
32
644
1503,11
2024,22
20,41
1,72
2612,67
3572,89
1437,31
11778,28
13762,63
72,64
3,02
17205,15
20177,04
11815,78
IL-1β
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
QPMN-A
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
QPMN-B
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
Dužina grlića
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
pH
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
parametri
n
IL-4
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
TNF-α
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IL-12p70
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IFN-γ
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IL-2
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
parametri
n
IL17A
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
347
85
132
4
44
32
644
347
85
132
4
44
32
644
12,57
9,54
12,32
5,66
13,67
9,58
12,00
21,37
24,63
19,70
4,42
17,44
10,13
20,53
12,57
18,07
14,96
20,30
2,40
19,26
10,72
17,92
91,29
90,93
71,16
5,19
35,30
18,87
81,90
18,07
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
347
85
132
4
44
32
644
256,60
1988,76
654,05
12,28
19,82
36,10
538,04
4314,30
18057,20
7002,53
16,45
45,38
105,23
7934,67
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
347
85
132
4
44
32
644
64,17
23,57
55,56
10,71
43,87
96,93
56,95
193,04
45,16
205,93
12,08
64,56
399,04
192,86
IL-5
IL-6
IL-13
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IL-22
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IL-9
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
IL-10
Normalan
Intermed
BV
Koke
Leukoreje
Sličan normalnom
UKUPNO
382
Tabela 72: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod tri grupe pacijentkinja na osnovu podele po Amsel-u
Parametri
%Apoptoze
Normalan
BV
QPMN-A
Normalan
BV
QPMN-B
Normalan
BV
Dužina grlića
Normalan
BV
pH
Normalan
BV
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
157
44
12,22
12,91
10,31
9,47
162
48
8,24
8,10
31,78
35,64
482
147
0,69
2,53
1,71
9,88
480
146
40,66
39,64
6,66
7,50
472
148
4,32
5,29
srednja
vrednost
0,44
0,48
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
455
137
1166,23
1521,49
1360,75
1600,59
454
136
13,68
10,77
56,06
25,95
455
137
74,50
27,40
496,18
118,75
455
137
3257,51
2035,40
15379,33
12623,31
455
137
47,85
35,77
srednja
vrednost
127,83
64,90
standardna
devijacija
455
137
116,79
23,21
1592,79
57,51
455
137
192,08
153,15
607,53
335,55
455
137
47,88
28,94
192,10
56,13
455
137
1778,12
433,43
13537,49
4854,16
IL-1β
parametri
n
Normalan
BV
455
137
12,89
10,26
18,42
16,91
Normalan
BV
455
137
21,96
14,67
85,14
58,24
Normalan
BV
455
137
383,12
1247,08
5325,57
14223,17
Normalan
BV
455
137
56,79
50,09
178,53
201,45
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
Normalan
BV
TNF-α
Normalan
BV
IL-12p70
Normalan
BV
IFN-γ
Normalan
BV
IL-2
Normalan
BV
parametri
IL-17A
Normalan
BV
IL-22
Normalan
BV
IL-9
Normalan
BV
IL-10
Normalan
BV
n
383
Tabela 73: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod šest gupa pacijentkinja na osnovu NP-6G
parametri
%Apoptoze
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
Br. PMN - Metoda A
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
Br. PMN - Metoda B
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
Dužina grlića
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
pH
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
84
59
38
10
9
17
217
11,66
12,52
12,28
20,26
13,74
12,98
12,59
8,56
10,68
12,48
13,04
8,18
8,30
10,16
84
62
39
11
12
18
226
9,85
6,93
3,48
1,97
4,54
16,48
7,81
42,47
13,28
7,39
2,85
11,65
57,40
31,49
285
154
71
49
58
64
681
0,56
0,66
0,65
0,44
1,58
4,78
1,07
1,13
1,81
1,47
0,68
2,72
14,70
4,86
283
154
71
49
58
63
678
40,90
40,02
40,86
40,29
38,83
40,13
40,40
6,74
7,15
5,62
7,12
7,31
7,16
6,85
258
138
63
45
56
61
621
4,24
4,31
4,60
5,06
5,04
5,47
4,55
srednja
vrednost
0,36
0,47
0,53
0,54
0,57
0,43
0,61
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
275
141
67
45
55
60
643
1061,66
1169,64
1230,86
1397,39
1546,75
1775,90
1234,61
1376,17
1244,52
1206,28
1460,59
1590,18
1800,49
1415,54
275
140
67
45
55
59
641
12,37
15,40
6,44
16,72
8,87
13,53
12,52
29,34
90,04
10,91
38,26
12,07
36,62
48,83
275
141
67
45
55
60
643
54,59
28,49
169,29
14,41
88,51
17,26
57,43
384,78
127,93
968,55
67,26
297,55
80,70
416,43
275
141
67
45
55
60
643
3719,04
1104,27
1271,93
9980,83
507,03
34,60
2710,35
16605,72
9196,51
7416,22
26590,56
3666,69
155,70
14049,40
275
141
67
45
55
60
643
54,58
31,24
36,96
43,44
30,44
40,60
43,48
srednja
vrednost
154,54
60,92
67,00
76,70
50,12
75,77
112,74
standardna
devijacija
275
141
67
45
55
60
643
172,56
26,62
28,50
33,98
20,16
38,12
90,27
2047,62
59,57
58,08
90,47
48,61
78,71
1340,51
275
141
67
45
55
60
643
144,80
186,73
148,96
266,64
371,05
128,03
180,74
364,98
571,11
340,08
509,75
1250,89
193,83
545,24
275
141
67
45
55
60
643
46,89
44,38
30,75
40,35
25,66
42,30
41,96
236,84
83,00
42,92
104,12
44,20
72,28
164,52
275
141
67
45
55
60
643
2092,09
1239,39
863,52
25,88
29,92
12,34
1262,03
14470,68
10705,69
6941,20
59,65
102,40
31,02
10955,04
IL-1β
n
IL-4
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
275
141
67
45
55
60
643
12,67
11,66
10,81
12,81
9,79
12,67
12,02
19,20
15,93
12,80
21,16
13,95
21,88
17,93
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
275
141
67
45
55
60
643
18,01
13,25
33,61
47,95
10,16
23,84
20,56
50,48
30,90
179,48
129,27
17,92
95,71
81,96
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
275
141
67
45
55
60
643
316,06
31,00
1221,00
50,84
3057,15
49,31
538,86
4846,18
80,47
9831,23
99,16
22447,96
99,81
7940,82
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
275
141
67
45
55
60
643
70,55
41,20
52,74
38,47
33,92
72,30
57,04
223,36
129,70
179,93
70,12
71,49
294,39
193,00
IL-5
IL-6
IL-13
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
TNF-α
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IL-12p70
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IFN-γ
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IL-2
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
parametri
IL-17A
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IL-22
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IL-9
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
IL-10
NOR FULL
NOR MID
NOR NULL
BV NULL
BV MID
BV FULL
UKUPNO
n
384
Tabela 74: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod tri gupe pacijentkinja na osnovu NP-3G
parametri
%Apoptoze
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
QPMN-A
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
QPMN-B
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
Dužina grlića
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
pH
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
143
48
26
217
12,02
13,94
13,24
12,59
9,47
12,88
8,10
10,16
146
50
30
226
8,61
3,15
11,70
7,81
33,29
6,67
44,93
31,49
439
120
122
681
0,60
0,57
3,26
1,07
1,40
1,21
10,89
4,86
437
120
121
678
40,59
40,63
39,50
40,40
6,89
6,25
7,23
6,85
396
108
117
621
4,27
4,79
5,26
4,55
srednja
vrednost
0,40
0,58
0,54
0,61
standardna
devijacija
parametri
n
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
416
112
115
643
12,33
11,62
11,30
12,02
18,14
16,61
18,49
17,93
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
416
112
115
643
16,39
39,37
17,30
20,56
44,83
160,71
70,28
81,96
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
416
112
115
643
219,44
750,84
1487,84
538,86
3940,37
7602,98
15523,44
7940,82
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
416
112
115
643
60,60
47,00
53,95
57,04
197,00
145,77
218,27
193,00
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
parametri
IL-1β
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
TNF-α
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-12p70
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IFN-γ
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-2
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
parametri
IL-17A
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-22
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-9
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
IL-10
Normalan
Intermed
BV
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
416
112
115
643
1098,26
1297,77
1666,31
1234,61
1332,48
1310,56
1699,64
1415,54
415
112
114
641
13,39
10,57
11,28
12,52
57,39
26,02
27,63
48,83
416
112
115
643
45,75
107,06
51,33
57,43
321,60
751,93
215,84
416,43
416
112
115
643
2832,78
4771,04
260,54
2710,35
14564,63
18203,62
2537,17
14049,40
416
112
115
643
46,67
39,57
35,74
43,48
srednja
vrednost
130,93
70,79
64,71
112,74
standardna
devijacija
416
112
115
643
123,09
30,70
29,53
90,27
1665,59
72,51
66,38
1340,51
416
112
115
643
159,01
196,24
244,25
180,74
445,40
418,48
880,62
545,24
416
112
115
643
46,04
34,61
34,34
41,96
198,39
73,59
60,82
164,52
416
112
115
643
1803,07
526,97
20,75
1262,03
13307,23
5368,36
74,45
10955,04
n
385
Tabela 75: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod dve gupe pacijentkinja na osnovu NP-2G
parametri
%Apoptoze
Normalan
BV
QPMN-A
Normalan
BV
QPMN-B
Normalan
BV
DUŽINA GRLIĆA
Normalan
BV
pH
Normalan
BV
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
181
36
12,07
15,19
10,13
10,04
185
41
7,53
9,09
29,82
38,53
510
171
0,60
2,45
1,41
9,28
508
170
40,63
39,73
6,72
7,19
459
162
4,31
5,21
srednja
vrednost
0,44
0,55
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
483
160
1116,65
1590,68
1315,32
1635,92
482
159
12,43
12,82
53,45
30,98
483
160
62,88
40,95
468,33
186,90
483
160
2616,27
2994,37
13800,89
14815,50
483
160
45,33
37,91
srednja
vrednost
124,04
68,13
standardna
devijacija
483
160
109,97
30,78
1546,00
73,68
483
160
157,62
250,55
432,03
792,48
483
160
43,92
36,03
184,85
75,23
483
160
1672,74
22,19
12616,27
70,46
IL-1β
parametri
n
Normalan
BV
483
160
12,12
11,72
17,50
19,23
Normalan
BV
483
160
18,78
25,92
78,59
91,42
Normalan
BV
483
160
358,38
1083,68
5169,43
13160,50
Normalan
BV
483
160
59,51
49,59
194,56
188,60
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
Normalan
BV
TNF-α
Normalan
BV
IL-12p70
Normalan
BV
IFN-γ
Normalan
BV
IL-2
Normalan
BV
parametri
IL-17A
Normalan
BV
IL-22
Normalan
BV
IL-9
Normalan
BV
IL-10
Normalan
BV
n
386
Tabela 76: Ispitivani parametri u podeli u kojoj su sve pacijentkinje sa C. albicans na osnovu
semikvantitativne podele svrstane u tri gupe, a preostale pacijentkinje u grupu sa normalnim nalazom i
BV (NP-2G/CA)
parametri
%Apoptoze
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
QPMN-A
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
QPMN-B
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
Dužina grlića
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
pH
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
128
20
35
20
14
217
13,28
17,07
9,95
9,79
10,43
12,59
11,21
10,60
6,67
6,87
8,22
10,16
131
23
36
21
15
226
6,58
1,57
5,60
16,49
21,29
7,81
31,98
2,61
9,56
36,62
62,33
31,49
360
88
128
72
33
681
0,48
0,48
0,93
3,22
4,89
1,07
0,91
0,69
2,10
13,09
8,00
4,86
358
87
128
72
33
678
41,04
40,09
39,44
40,38
38,12
40,40
6,13
7,30
7,92
7,16
7,27
6,85
317
86
118
71
29
621
4,30
5,23
4,51
4,71
4,89
4,55
srednja
vrednost
0,42
0,45
0,60
0,69
0,79
0,61
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
344
83
117
66
33
643
1028,24
1683,69
1476,84
1373,60
1119,48
1234,61
1270,24
1554,55
1793,23
1228,16
862,28
1415,54
343
83
117
66
32
641
13,04
14,07
13,00
9,02
8,53
12,52
62,45
32,02
27,64
13,39
14,33
48,83
344
83
117
66
33
643
70,37
33,50
75,99
14,87
1,98
57,43
480,28
138,29
507,95
72,82
5,49
416,43
344
83
117
66
33
643
2807,59
3863,72
2509,36
1268,62
2391,93
2710,35
14304,85
16684,28
14300,11
7566,10
13700,84
14049,40
344
83
117
66
33
643
41,45
41,66
54,99
36,84
41,65
43,48
srednja
vrednost
125,88
64,34
125,87
66,89
86,10
112,74
standardna
devijacija
344
83
117
66
33
643
134,69
30,53
47,96
36,51
34,89
90,27
1830,91
71,76
112,84
71,00
64,46
1340,51
344
83
117
66
33
643
154,46
285,35
201,34
150,97
178,19
180,74
418,45
1015,60
541,69
317,11
370,52
545,24
344
83
117
66
33
643
40,45
33,13
55,04
39,22
39,01
41,96
212,19
63,79
103,24
54,59
66,57
164,52
344
83
117
66
33
643
2174,98
23,79
25,64
875,46
16,24
1262,03
14610,00
85,79
66,60
6993,48
34,02
10955,04
IL-1β
n
IL-4
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
TNF-α
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IL-12p70
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IFN-γ
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IL-2
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
parametri
n
IL-17A
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
344
83
117
66
33
643
10,57
13,11
15,60
12,14
11,54
12,02
15,97
20,25
23,20
13,75
15,93
17,93
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
344
83
117
66
33
643
18,68
32,21
22,60
15,23
14,25
20,56
90,61
111,85
57,03
27,66
29,05
81,96
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
344
83
117
66
33
643
490,81
59,90
1449,21
27,62
39,19
538,86
6122,84
113,27
15391,34
52,29
111,35
7940,82
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
344
83
117
66
33
643
56,22
65,30
67,19
41,44
40,07
57,04
191,03
255,10
219,47
63,62
71,95
193,00
IL-5
IL-6
IL-13
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IL-22
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IL-9
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
IL-10
NOR
BV
CA NULL
CA MID
CA FULL
UKUPNO
387
Tabela 77: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice i
koncentracije ispitivanih citokina kod dve gupe pacijentkinja na osnovu pH
parametri
%Apoptoze
Zdrave
Bolesne
QPMN-A
Zdrave
Bolesne
QPMN-B
Zdrave
Bolesne
Dužina grlića
Zdrave
Bolesne
pH
Zdrave
Bolesne
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
149
46
12,10
13,73
10,05
10,78
152
52
8,22
8,45
32,66
34,56
446
165
0,69
2,16
1,61
9,30
444
164
40,70
40,00
6,65
7,08
455
167
4,23
5,41
srednja
vrednost
0,27
0,40
standardna
devijacija
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
419
157
1131,49
1552,07
1260,95
1735,18
417
157
13,76
11,03
58,30
24,77
419
157
74,76
39,58
509,09
185,97
419
157
2643,98
4328,96
13344,40
18751,36
419
157
47,21
37,62
srednja
vrednost
130,66
67,55
standardna
devijacija
419
157
121,72
27,55
1659,66
61,94
419
157
175,24
144,07
481,61
260,02
419
157
45,99
33,86
198,13
60,92
419
157
1520,08
1467,53
12064,76
12840,25
IL-1β
parametri
n
Zdrave
Bolesne
419
157
12,39
11,29
18,00
17,01
Zdrave
Bolesne
419
157
22,75
13,75
92,48
32,07
Zdrave
Bolesne
419
157
413,18
1091,70
5549,08
13286,46
Zdrave
Bolesne
419
157
54,36
57,80
172,94
218,19
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
Zdrave
Bolesne
TNF-α
Zdrave
Bolesne
IL-12p70
Zdrave
Bolesne
IFN-γ
Zdrave
Bolesne
IL-2
Zdrave
Bolesne
parametri
IL-17A
Zdrave
Bolesne
IL-22
Zdrave
Bolesne
IL-9
Zdrave
Bolesne
IL-10
Zdrave
Bolesne
n
388
Tabela 78: Procenat apotoze, kvantifikativno određivanje broja PMN, dužina grlića materice, vaginalni
pH i koncentracije ispitivanih citokina kod tri gupe pacijentkinja na osnovu rezultata testa sa 10% KOH
parametri
%Apoptoze
Negativan
Pozitivan
QPMN-A
Negativan
Pozitivan
QPMN-B
Normalan
BV
Dužina grlića
Negativan
Pozitivan
pH
Negativan
Pozitivan
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
157
44
11,90
14,75
9,72
11,65
162
48
8,48
7,41
32,74
33,71
482
147
0,66
2,16
1,56
9,29
480
146
40,73
39,73
6,74
7,04
472
148
4,37
5,02
srednja
vrednost
0,49
0,63
standardna
devijacija
parametri
n
Negativan
Pozitivan
455
137
12,66
10,81
17,54
19,03
Negativan
Pozitivan
455
137
20,80
18,43
84,42
69,54
Negativan
Pozitivan
455
137
410,26
1107,38
5542,54
13371,77
Negativan
Pozitivan
455
137
61,49
46,91
195,32
191,36
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
parametri
IL-1β
Negativan
Pozitivan
TNF-α
Negativan
Pozitivan
IL-12p70
Negativan
Pozitivan
IFN-γ
Negativan
Pozitivan
IL-2
Negativan
Pozitivan
parametri
IL-17A
Negativan
Pozitivan
IL22
Negativan
Pozitivan
IL-9
Negativan
Pozitivan
IL-10
Negativan
Pozitivan
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
455
137
1157,65
1531,95
1316,22
1734,79
454
136
13,36
11,84
57,09
31,38
455
137
80,45
23,67
516,07
109,09
455
137
3378,52
2296,19
15777,41
12653,70
455
137
47,81
35,48
srednja
vrednost
130,13
69,43
standardna
devijacija
455
137
121,59
27,06
1657,52
72,25
455
137
154,76
196,87
387,61
537,69
455
137
46,12
33,30
196,70
71,16
455
137
1784,29
21,98
13244,77
71,60
n
389
Tabela 79: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod četiri gupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 200
parametri
%Apoptoze
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
Dužina grlića
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
85
86
28
16
215
15,72*
12,09
9,81*
10,31
12,59
12,95*
8,35
6,58*
9,56
10,16
248
248
107
70
673
41,38*
40,50
40,64
38,55*
40,40
5,93
6,56
6,68
8,31
6,84
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
10,94
15,26
11,93
10,28
12,53
28,94
74,20
27,81
15,35
48,79
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
160,70
138,30
199,36
274,36
181,13
365,58
437,28
487,78
882,39
544,91
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
38,13
46,61
42,87
37,78
41,89
72,64
254,54
80,41
84,74
164,40
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
961,28
2011,38
1066,40
1393,42
1437,31
9455,59
13959,10
10931,31
11411,73
11815,78
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
11,21
12,10
13,76
11,44
12,00
20,36
16,94
30,31
18,83
20,53
11,21
14,41
18,15
20,06
20,10
17,92
77,91
53,49
144,95
47,89
81,90
14,41
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
38,64
1449,23
34,42
19,57
538,04
93,26
13246,56
78,90
51,11
7934,67
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
60,11
58,48
47,96
57,43
56,95
228,38
191,85
72,71
211,78
192,86
parametri
IL-17A
IL-22
IL-9
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
236
236
98
69
639
1289,92
1132,48
1271,29
1307,85
1233,99
1324,61
1479,05
1484,33
1361,71
1414,53
235
236
98
68
637
10,94
15,26
11,93
10,28
12,53
28,94
74,20
27,81
15,35
48,79
236
236
98
69
639
55,78
64,49
92,85
29,56
60,12
404,59
432,78
610,11
111,69
421,67
236
236
98
69
639
1629,05
4079,58
3646,39
1415,87
2804,64
10049,06
16826,78
18111,60
9464,73
14240,89
236
236
98
69
639
36,93
47,84
45,42
42,92
43,42
76,57
144,65
73,69
118,10
112,66
IL-1β
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
TNF-α
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-12p70
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IFN-γ
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-2
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-10
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
390
Tabela 80: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod četiri gupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 400
parametri
%Apoptoze
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
Dužina grlića
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
71
88
39
17
215
14,97*
11,94
11,12
8,21*
12,50
13,38
8,22
8,02
4,96
10,16
231
238
109
95
673
41,21
39,91
39,74
40,25
40,38
6,04
7,35
7,08
6,88
6,82
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
31,80
50,00
372,13
21,90
90,72
66,80
227,27
3363,14
52,41
1344,69
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
173,42
175,08
213,16
187,85
182,33
378,23
529,52
905,45
390,45
546,86
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
37,10
48,87
47,08
30,13
41,91
72,57
254,84
103,97
58,58
165,02
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
1325,61
1270,75
1701,39
1916,23
1448,53
11515,03
11262,88
12636,20
13377,94
11861,30
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
12,15
12,32
12,17
11,16
12,08
16,16
17,57
20,36
20,43
17,97
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
25,18
19,04
17,71
17,04
20,65
120,34
54,01
49,44
51,66
82,20
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
34,45
1460,30
26,14
20,77
542,19
83,45
13274,77
72,97
49,44
7965,56
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
219
229
101
90
639
63,02
59,15
62,31
33,24
57,33
219,66
181,98
233,44
60,16
193,56
parametri
IL-17A
IL-22
IL-9
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
219
229
101
90
639
1401,83
1097,73
1098,10
1352,09
1237,84
1574,17
1266,10
1151,92
1600,29
1416,34
218
229
101
89
637
12,35
14,60
11,44
9,51
12,62
27,82
73,50
32,23
15,00
48,97
219
229
101
90
639
69,20
55,06
34,40
83,04
60,58
436,30
440,46
123,35
550,01
423,29
219
229
101
90
639
3471,63
2945,53
550,88
3507,87
2826,54
15579,17
14740,11
5226,06
16599,68
14294,42
219
229
101
90
639
41,17
49,59
40,72
37,87
43,65
82,10
142,63
123,00
76,68
113,07
IL-1β
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
TNF-α
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-12p70
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IFN-γ
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-2
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-10
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
391
Tabela 81: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod četiri gupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 1000
parametri
%Apoptoze
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
Dužina grlića
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
85
86
28
16
215
14,47*
11,38
8,69*
14,72
12,50
12,25
8,76
6,48
7,80
10,16
248
248
107
70
673
41,45*
39,91*
39,53
39,54
40,38
5,89
7,01
8,05
6,89
6,82
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
172,17
56,53
26,83
19,82
90,72
2200,50
231,34
66,83
40,82
1344,69
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
171,19
166,45
149,38
321,51
182,33
373,36
484,82
338,97
1151,24
546,86
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
35,87
57,63
30,22
25,45
41,91
70,15
257,27
67,37
42,64
165,02
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
1471,49
1473,40
1180,06
1666,27
1448,53
11671,12
11670,88
11528,86
13739,95
11861,30
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
11,55
13,18
11,88
10,36
12,08
15,33
19,54
22,49
12,98
17,97
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
24,19
21,12
16,60
12,70
20,65
116,09
59,64
53,20
19,19
82,20
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
32,33
1076,98
844,32
27,85
542,19
77,69
12013,10
8128,86
55,06
7965,56
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
236
236
98
69
639
60,44
63,15
34,13
59,72
57,33
211,75
182,36
65,28
273,18
193,56
parametri
IL-17A
IL-22
IL-9
parametri
n
srednja
vrednost
standardna
devijacija
236
236
98
69
639
1298,62
1160,94
1261,89
1258,80
1237,84
1398,88
1398,52
1516,35
1408,79
1416,34
235
236
98
68
637
11,74
15,80
8,61
10,35
12,62
26,73
74,16
16,17
23,13
48,97
236
236
98
69
639
64,58
27,20
152,27
30,87
60,58
420,56
154,57
816,38
140,12
423,29
236
236
98
69
639
3802,90
1970,63
2249,29
3234,46
2826,54
16167,58
12172,65
11926,18
17096,89
14294,42
236
236
98
69
639
39,32
55,26
33,03
33,79
43,65
79,67
159,14
66,28
58,64
113,07
IL-1β
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
TNF-α
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-12p70
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IFN-γ
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-2
PMN0
PMN1
PMN2
PMN3
UKUPNO
IL-10
IL-4
IL-5
IL-6
IL-13
392
Tabela 82: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod dve grupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 200
n
Srednja
vrednost
Standardna
devijacija
Zdrava
148
13,78
10,86
Bolesna
69
10,03
7,95
Zdrava
157
3,50
8,81
Bolesna
69
17,61
54,43
Zdrava
433
0,36
0,51
Bolesna
248
2,31
7,89
Zdrava
430
40,89
6,30
Bolesna
248
39,55
7,64
Zdrava
411
60,66
420,11
Bolesna
233
59,17
425,32
Zdrava
411
3000,39
14281,53
Bolesna
233
2459,33
14193,00
Zdrava
411
120,52
1675,25
Bolesna
233
36,51
91,78
Zdrava
411
43,04
119,54
Bolesna
233
44,09
99,62
Zdrava
411
1548,92
12180,28
Bolesna
233
1240,44
11166,74
Zdrava
411
42,88
196,27
Bolesna
233
40,16
82,61
Zdrava
411
148,17
406,94
Bolesna
233
239,27
724,54
Zdrava
411
828,02
9924,85
Bolesna
233
26,52
65,86
Zdrava
411
59,20
208,47
Bolesna
233
53,00
162,05
Zdrava
411
11,71
16,60
Bolesna
233
12,52
20,07
Zdrava
411
18,44
65,31
Bolesna
233
24,20
105,02
Zdrava
411
1201,82
1413,61
Bolesna
233
1290,75
1417,41
Zdrava
410
13,36
58,77
Bolesna
232
11,05
22,06
BROJPMNX200G
%Apoptoze
QPMN-A
QPMN-B
Dužina grlića
IL-12p70
IFN-γ
IL-17A
IL-2
IL-10
IL-9
IL-22
IL-6
IL-13
IL-4
IL-5
IL-1β
TNF-α
393
Tabela 83: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod dve grupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 400
n
Srednja
vrednost
Standardna
devijacija
Zdrava
159
13,30
10,90
Bolesna
56
10,24
7,31
Zdrava
167
6,22
28,65
Bolesna
57
12,72
38,94
Zdrava
471
0,49
0,96
Bolesna
205
2,42
8,61
Zdrava
469
40,55
6,76
Bolesna
204
39,98
6,97
Zdrava
448
61,97
438,00
Bolesna
191
57,32
387,69
Zdrava
448
3202,71
15141,36
Bolesna
191
1944,23
12068,06
Zdrava
448
41,10
169,13
Bolesna
191
207,10
2446,43
Zdrava
448
45,47
116,97
Bolesna
191
39,38
103,53
Zdrava
448
1297,57
11374,11
Bolesna
191
1802,63
12956,98
Zdrava
448
43,12
189,02
Bolesna
191
39,09
85,84
Zdrava
448
174,27
461,29
Bolesna
191
201,23
709,27
Zdrava
448
763,29
9507,70
Bolesna
191
23,61
62,89
Zdrava
448
61,04
201,07
Bolesna
191
48,62
174,89
Zdrava
448
12,24
16,88
Bolesna
191
11,70
20,35
Zdrava
448
22,04
92,52
Bolesna
191
17,40
50,37
Zdrava
448
1246,39
1431,55
Bolesna
191
1217,79
1383,52
Zdrava
447
13,50
56,03
Bolesna
190
10,54
25,60
BROJPMNX400G
%Apoptoze
QPMN-A
QPMN-B
Dužina grlića
IL-12p70
IFN-γ
IL-17A
IL-2
IL-10
IL-9
IL-22
IL-6
IL-13
IL-4
IL-5
IL-1β
TNF-α
394
Tabela 84: Procenat apotoze, dužina grlića materice i koncentracije ispitivanih citokina kod dve grupe
pacijentkinja na osnovu semikvantitatine procene broja PMN na mikroskopskom uvećanju x 1000
n
Srednja
vrednost
Standardna
devijacija
Zdrava
171
12,92
10,72
Bolesna
44
10,88
7,50
Zdrava
179
6,24
27,74
Bolesna
45
14,40
43,60
Zdrava
499
0,55
1,13
Bolesna
177
2,55
9,21
Zdrava
496
40,68
6,51
Bolesna
177
39,54
7,59
Zdrava
472
45,89
317,05
Bolesna
167
102,11
633,31
Zdrava
472
2886,76
14324,40
Bolesna
167
2656,33
14250,90
Zdrava
472
114,35
1563,97
Bolesna
167
23,94
57,48
Zdrava
472
47,29
125,96
Bolesna
167
33,35
63,06
Zdrava
472
1472,44
11658,61
Bolesna
167
1380,95
12452,26
Zdrava
472
46,75
188,67
Bolesna
167
28,25
58,33
Zdrava
472
168,82
432,24
Bolesna
167
220,50
785,68
Zdrava
472
554,65
8501,79
Bolesna
167
506,97
6227,03
Zdrava
472
61,80
197,40
Bolesna
167
44,70
182,27
Zdrava
472
12,37
17,56
Bolesna
167
11,25
19,11
Zdrava
472
22,65
92,20
Bolesna
167
14,99
42,52
Zdrava
472
1229,78
1398,92
Bolesna
167
1260,61
1468,53
Zdrava
471
13,78
55,77
Bolesna
166
9,32
19,28
BROJPMNX1000G
%Apoptoze
QPMN-A
QPMN-B
Dužina grlića
IL-12p70
IFN-γ
IL-17A
IL-2
IL-10
IL-9
IL-22
IL-6
IL-13
IL-4
IL-5
IL-1β
TNF-α
395
Tabela 85: Rezultati ANOVA (post hoc Tamhane) za podelu po Nugentu i podelu po Ison/Hay
parametri
Podela po Nugent-u
grupe
p
IL-13
Normalan
Intermedia
0,001
IL-1b
Normalan
BV
0,002
IL-2
Normalan
Intermedia
0,019
IL-10
Normalan
BV
0,034
Intermedia
0,000
BV
0,000
Intermedia
0,000
pH
Normalan
BV
parametri
Podela po Ison/Hay-u
grupe
p
QPMN-B
Cist nalaz
Normalan
0,000
IFNg
Cist nalaz
Normalan
0,001
BV
0,037
Normalan
Intermedia
0,004
Normalan
Koke
0,000
BV
Koke
0,001
Cist nalaz
Normalan
0,000
Cist nalaz
BV
0,000
Normalan
Intermedia
0,000
Normalan
BV
0,000
Normalan
Koke
0,001
Intermedia
Normalan
0,000
Intermedia
BV
0,000
BV
Koke
0,000
IL-17a
IL-2
pH
396
Tabela 86: Rezultati ANOVA (post hoc Tamhane) za podelu po Claeys-u i podelu po NP-6G
podela po Claeys-u
parametri
grupe
p
podela po NP-6G
parametri
grupe
p
QPMN-A
Intermedia
Koke
0,042
QPMN-B
BV NULL
BV MID
0,048
IFN γ
Normalan
Koke
0,004
IFN γ
NOR FULL
BV FULL
0,004
Intermedia
Koke
0,001
NOR NULL
NOR
FULL
0,000
BV
Koke
0,001
NOR NULL
NOR
MID
0,004
Intermedia
0,031
NOR NULL
BV NULL
0,000
Koke
0,001
NOR NULL
BV MID
0,001
BV
Koke
0,023
NOR NULL
BV FULL
0,000
Normalan
Sličan
normalnom
0,028
NOR FULL
BV NULL
0,000
Intermedia
Koke
0,036
NOR FULL
BV MID
0,000
Koke
Normalan
0,000
NOR MID
BV NULL
0,000
Koke
Leukoreje
0,022
NOR MID
BV MID
0,000
Normalan
Intermedia
0,007
NOR MID
BV FULL
0,000
Normalan
Koke
0,001
BV MID
NOR
NULL
0,001
Intermedia
Normalan
0,007
BV MID
BV FULL
0,000
Normalan
Koke
0,029
BV FULL
NOR
NULL
0,000
Normalan
Koke
0,004
BV FULL
NOR
FULL
0,000
BV
Koke
0,003
BV FULL
BV NULL
0,001
Koke
Leukoreje
0,031
Normalan
Intermedia
0,000
Normalan
BV
0,000
Intermedia
BV
0,000
Intermedia
Leukoreje
0,000
BV
Leukoreje
0,000
BV
Sličan
normalnom
0,003
IL-17a
Normalan
IL-2
IL-22
IL-13
IL-4
TNF-α
pH
pH
397
PRILOG 4
Tabela 87: Sperman-ov koeficijent korelacije
Parametri
* IL-12p70
IFN-γ
IL-17A
IL-2
ρ
0,028
0,046
0,033
0,014
%
p
0,679
0,504
0,630
0,833
APO
n
214
214
214
214
ρ
.082*
-0,026
-0,012
-0,028
Broj
PMN
p
0,038
0,510
0,766
0,478
(x 200)
n
644
644
644
644
ρ
0,020
-0,054
-0,001
-0,031
Broj
PMN
p
0,619
0,169
0,974
0,436
(x 400)
n
639
639
639
639
ρ
0,017
-0,054
-0,036
-0,055
Broj
PMN
p
0,673
0,174
0,363
0,165
(x 1000) n
639
639
639
639
ρ
0,014
-0,002
0,013
0,026
Broj PMN
p
0,838
0,979
0,851
0,700
(x 106/ml)
n
223
223
223
223
ρ
.131**
0,035
-0,029
0,008
Broj
PMN
p
0,001
0,376
0,465
0,848
( x 109/l) n
644
644
644
644
ρ
0,051
0,013
0,006
-0,020
Dužina
p
0,199
0,735
0,877
0,609
grlića
n
644
644
644
644
* ρ –koeficijent korelacije; p – verovatnoća; n – broj nalaza
IL-10
0,029
0,673
214
0,014
0,728
644
-0,017
0,660
639
-0,015
0,698
639
-0,016
0,818
223
0,054
0,174
644
0,051
0,195
644
IL-9
-0.150*
0,028
214
-0,041
0,302
644
-0,047
0,239
639
-0,026
0,519
639
.155*
0,021
223
-.086*
0,028
644
-0,049
0,211
644
IL-22
0,055
0,421
214
0,052
0,192
644
-0,057
0,148
639
-0,045
0,257
639
-0,017
0,806
223
.119**
0,002
644
0,065
0,101
644
398
Parametri
*
ρ
%
p
APO
n
ρ
Broj
PMN
p
(x 200)
n
ρ
Broj
PMN
p
(x 400)
n
ρ
Broj
PMN
p
(x 1000) n
ρ
Broj PMN
p
(x 106/ml)
n
ρ
Broj
PMN
p
9
( x 10 /l) n
ρ
Dužina
p
grlića
n
IL-6
0,045
0,513
214
-0,047
0,231
644
-0,019
0,636
639
-0,040
0,309
639
-0,020
0,765
223
-.092*
0,020
644
-0,027
0,501
644
IL-13
0,029
0,672
214
0,048
0,226
644
0,004
0,928
639
0,005
0,893
639
0,130
0,053
223
0,025
0,519
644
-0,020
0,604
644
IL-4
0,021
0,758
214
-0,036
0,361
644
-0,033
0,409
639
-0,051
0,197
639
0,065
0,333
223
-0,060
0,128
644
0-,020
0,620
644
IL-5
0,042
0,540
214
0,052
0,186
644
0,006
0,872
639
0,006
0,880
639
.141*
0,035
223
0,020
0,606
644
-0,010
0,801
644
IL-1b
0,018
0,790
214
0,019
0,634
644
-0,023
0,562
639
-0,040
0,315
639
0,053
0,435
223
0,019
0,633
644
-0,045
0,251
644
TNF-α
0,024
0,727
214
.087*
0,027
642
-0,008
0,839
637
0,007
0,855
637
.148*
0,027
223
.101*
0,010
642
0,010
0,803
642
399
Download

докторска дисертација